專利名稱：用作蛋白激酶抑制劑的3-氨基-吡唑-4-酰胺衍生物的制作方法
用作蛋白激酶抑制劑的3-M-吡唑-4-酰胺衍生物
本發(fā)明涉及3-iJ^-吡唑-4-羧酸衍生物，它們在治療蛋白激酶調(diào)節(jié)響應 的疾病中的用途或它們在制備用于治療所述疾病的藥物制劑中的用途，本 發(fā)明還涉及藥物制劑，其特別用于對抗所述疾病，該藥物制劑包含所述化 合物和可藥用栽體，所述化合物用于治療動物或人體，特別是對抗所述疾 病，本發(fā)明還涉及通過給動物或人施用所述化合物治療動物或人體的方法， 以及制備所述化合物的方法，其中在每種情況中，當提及化合物時，它們 可以以本身存在和/或以(優(yōu)選可藥用)鹽形式存在。
對于術語"蛋白激酶"，所定義的一類酶活性蛋白質(zhì)，可以分為受體 型激酶和非受體型激酶，還可以分為酪氨酸和絲氨^/蘇氨酸激酶。關于它 們的定位，可以分為核、胞質(zhì)和膜相關的激酶。很多膜相關的酪氨酸激酶 同時是生長因子的受體。
關于它們的催化活性，蛋白激酶(PK)是酶，其催化細胞蛋白質(zhì)中的特 別的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的磷酸化。底物蛋白質(zhì)的翻譯后修飾通 常用作分子開關，表示調(diào)節(jié)細胞增殖、活化和/或分化的步驟。異?；蜻^度， 或更常見的是不適當?shù)腜K活性已經(jīng)在多種疾病狀態(tài)、包括良性和惡性增 殖障礙中觀察到。在^L多情況中，在體外和體內(nèi)通過應用PK抑制劑來治 療疾病、例如增殖障礙是可能的。
在過去的數(shù)年中，已經(jīng)了解了 Eph受體酪氨酸激酶和它們配體(ephrin) 的基本作用。多種不同的Eph受體4皮分類并且基于它們對配體的親和力被 分為EphA或EphB亞類。至少已經(jīng)鑒定出八種印hrin，它們M蛋白， 或是甘油磷脂酰肌醇(GPI)-連接型(ephrinA),或是跨膜型(ephrinB)。 Eph 受體和它們配體間的信號傳導表現(xiàn)出受制于直接的細胞間接觸的位點。接 觸的結果是i秀導細胞間的交互雙向事件。ephrin和它們的受體在某些部位 的表達被認為對組織圖式發(fā)育和組織空間非常受限的細胞部位具有影響。 特別的作用包括細胞遷移、粘附和體節(jié)形成的修飾。EphB4(也稱為HTK)及其配體ephrinB2(HTKL)在建立和確定血管網(wǎng) 絡中發(fā)揮重要作用。在靜脈上皮細胞上，EphB4是特異性表達的，而在血 管發(fā)生的早期，ephrinB2特異性地并且相反地表達在動脈內(nèi)皮細胞上。功 能障礙的基因?qū)е滦∈笈咛ブ滤佬裕⑶以谌毕輊phrinB2和EphB4的情 況中，胚胎在形成毛細管連接中表現(xiàn)出相同的缺陷。在胚胎發(fā)生過程中兩 者都表達在血細胞生成和血管發(fā)生的第一位點。對于適合的造血、內(nèi)皮、 成血管細胞和原始中胚層發(fā)生，已經(jīng)建立了必需的作用。EphB4缺陷導致 胚胎干細胞的中胚層分化結果的改變。乳房組織中EphB4的異位表達導致 構造障礙、組織功能異常，并且是惡性腫瘤的誘因(參見，例如N.Munarini 等人，J. Cell. Sci. Uf， 25-37(2002))。從這些以及其它數(shù)據(jù)，可以得出以下 結論不適當?shù)腅phB4表達可能涉及惡性腫瘤的形成，因此抑制EphB4 可以;敗期望成為戰(zhàn)勝惡性胂瘤、例如癌癥等的工具。
細胞中發(fā)現(xiàn)的酪氨酸激酶c-Src的組成性表達的病毒形式c-Src(來自 勞斯肉瘤病毒， 一種逆轉(zhuǎn)錄病毒)是Src蛋白酪氨酸激酶的不適當表達如何 導致基于轉(zhuǎn)化細胞的惡性腫瘤的實例。抑制Src蛋白酪氨酸激酶可以引起 轉(zhuǎn)化腫瘤細胞失調(diào)生長的抑制，例如在結締組織腫瘤中。因此，在本文中 抑制c-Src或其修飾或突變形式還被期望在治療增殖疾病中顯示出有益的 作用。
已知VEGFR(血管內(nèi)皮生長因子受體)參與控制血管發(fā)生的開始。特別 是實體瘤取決于良好的血液供給，因此，在治療此類腫瘤中，抑制VEGFR 和血管發(fā)生正在進行臨床研究，顯示出有前景的結果。VEGF還是白血病 和淋巴瘤中主要的參與者，并且在多種實體惡性腫瘤中高表達，與惡性疾 病進程具有良好的相關性。伴有VEGFR-2(KDR)表達的腫瘤疾病的實例是 肺癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、惡性胸膜間皮瘤和黑 素瘤。除了它的血管發(fā)生活性之外，VEGFR的配體(VEGF)通過腫瘤細胞 中的直接促存活作用促進胂瘤生長。多種其它疾病與失調(diào)的血管發(fā)生有關， 例如以下提及的。
在患有慢性粒細胞白血病(CML)的患者中觀察到abl原癌基因轉(zhuǎn)化為 癌基因。染色體異位將染色體22上的bcr基因連接到染色體9的abl基因
6上，從而產(chǎn)生費城染色體。產(chǎn)生的融合蛋白具有Bcr蛋白的氨基末端，其 結合Abl酪氨酸蛋白激酶的羧基末端。因此，Abl激酶結構域變得不適當 的活性，引起骨髓中造血細胞克隆的過度增殖。通過GleeVeCTM或 Glivec⑧(Novartis的商標)的活性成分(該融合蛋白的抑制劑)抑制該酪氨酸 激酶在治療CML中顯示出高活性。因此，可以證實如下一個普通概念 Abl酪氨酸激酶的不適當?shù)谋磉_可以治療惡性肺瘤，特別是白血病。
但是，到目前為止用作蛋白激酶抑制劑的很多化合物表現(xiàn)出缺乏特異 性、不希望的副作用(特別是由對多于一種類型的蛋白激酶的不利抑制性質(zhì) 引起的副作用)、由于太高的特異性而缺乏功效、僅對某些疾病的功效、在 施用過程中抗性的發(fā)生和/或相當?shù)牟幌Ｍ男再|(zhì)。
這導致了本發(fā)明的問題特別是在了解多種增殖和其它蛋白激酶相關 疾病以及對某些治療抗性的發(fā)生，仍然需要提供新的化合物，其用作蛋白 激酶抑制劑，并且因此用于治療這些蛋白酪氨酸激酶-(例如絲氨l蘇氨酸 和/或優(yōu)選蛋白酪氨酸激酶-(PTK-))相關疾病。所需的是新型藥物有利的蛋 白激酶、特別是PTK抑制化合物，特別是具有有利的性質(zhì)，例如對有限的 組或甚至單獨的蛋白激酶的高親和力和/或選擇性、活性(其中已經(jīng)發(fā)生對 不同類型化合物的抗性)、對某些組的激酶的有用的親和特性等。需要新型 蛋白激酶抑制劑，其能滿足提及的或其它問題。
發(fā)明概述
目前令人驚訝地發(fā)現(xiàn)很多蛋白激酶，其參與營養(yǎng)因子介導的信號轉(zhuǎn)導 和疾病現(xiàn)象，其涉及蛋白激酶活性，例如增殖(例如腫瘤)生長，蛋白酪氨 酸激酶的特別的代表性實例是來自src激酶家族的激酶(特別是c-src激酶)、 VEGF-受體激酶(例如KDR和Flt-l)、 RET-受體激酶和/或Ephrin受體激 酶(例如EphB2激酶、EphB4激酶或相關激酶)、進一步的abl激酶(特別是 v-abl或c-abl激酶)、b-raf(V599E)、 EGF受體激酶或EGF家族的其它激 酶(例如HER-1或c-erbB2激酶(HER-2))、 Flt畫3、 Ick、 fyn、 c-erbB3激 酶、c-erbB4激酶、PDGF-受體酪氨酸蛋白激酶家族成員(例如PDGF-受體 激酶)、CSF-1受體激酶、Kit-受體激酶(c-Kit)、 FGF-受體激酶(例如 FGF-R1、 FGF-R2、 FGF畫R3、 FGF-R4)、 c國Raf、酪蛋白激酶(CK-1、CK畫2、 G-CK)、 Pak、 ALK、 ZAP70、 Jakl、 Jak2、 Axl、 Cdkl、 cdk4、 cdk5、 Met、 FAK、 Pyk2、 Syk、 Tie-2、胰島素受體激酶(Ins-R)、胰島素 樣生長因子受體激酶(IGF-1激酶)、和/或進一步的絲氨^/蘇氨酸激酶，例 如蛋白激酶C(PK-C)、 PK-B、 EK-B或cdc激酶，例如CDK1，可以被本 發(fā)明的3-#^-吡哇化合物抑制，以及，例如組成性活化任何一種或多種這 些激酶的突變形式(例如Bcr-Abl 、 RET/MEN2A 、 RET/MEN2B 、 RET/PTC1-9或b-raf(V599E))。所有這些和其它蛋白激酶在哺乳動物細胞 (包括人細胞)的生長調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。特別是可以發(fā)現(xiàn)對細胞 Eph4B激酶具有很高的功效。
考慮到這些活性，本發(fā)明化合物可以例如用于治療蛋白激酶調(diào)節(jié)響應 的疾病，例如特別是與此類激酶的異常(未調(diào)節(jié)或失調(diào)或組成性的等)或過 度活性相關的疾病，特別是提及的那些并且最特別是作為優(yōu)選提及的那些。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及游離形式或鹽形式的下式的3-#^-吡唑-4-羧酸衍生物
其中
R，是d—7烷基或者被d-7烷氧基或Cw烷基之一取代的苯基；
R2是-NH-CO-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自鹵素、Cw烷氧基 或三氟甲基的取代基取代，或者
是-CO-NH-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自鹵素、Cw烷氧基或 三氟曱基的取代基取代；并且
R3是d.7烷基或卣素。
本發(fā)明還涉及式I化合物或其可藥用鹽在治療蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的疾
8病中的用途，特別是在動物或優(yōu)選人中，所述的疾病特別是對"發(fā)明概述"
中提及的一種或多種蛋白酪氨酸激酶(PTK)，更特別的是一種或多種選自 下歹1的PTK的抑命響應的疾病src激酵家族(特另，J是c-src 激酶)、VEGF-受體激酶(例如KDR和Flt-l)、 RET-受體激酶或Ephrin受體激酶(例如 EphB2激酶、EphB4激酶或相關激酶)或者它們的突變(例如組成性活化的 或其它局部或整體失調(diào)的)形式。
本發(fā)明還涉及式I化合物或其(優(yōu)選可藥用)鹽在制備用于治療所述疾 病的藥物制劑中的用途、包含式I化合物或其可藥用鹽以及至少一種可藥 用載體特別用于對抗所述疾病的藥物制劑、用于治療動物或人體(特別是對 抗前一段落中提及的疾病)的式I化合物或其可藥用鹽、治療動物或人體的 方法(該方法包括給動物或人、特別是需要該治療的患者施用有效治療所述 疾病的量的式I化合物或其可藥用鹽)以及制備式I化合物或其(優(yōu)選可藥用) 鹽的方法。
在式I中，獨立地、共同地或以任何組合或亞-組合來優(yōu)選以下含義。 除非另外"^兌明，在本>^開內(nèi)容的上下文中，上下文所用的通用術語或 符號優(yōu)選具有以下含義。
術語"d.7烷基"定義為具有至多并且包括7個、特別是至多并且包 括4個碳原子的基團，所述的基團是具有一個或多個分支的支鏈的或者是 直鏈的。低級或d-7烷基例如是正戊基、正己基或正庚基或者優(yōu)選Cw烷 基，特別是曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔 丁基，優(yōu)選甲基。
術語"d—7烷氧基，，定義為具有至多并且包括7個、特別是至多并且 包括4個碳原子的基團，例如甲氡基或乙氡基，優(yōu)選甲氧基。 卣素優(yōu)選氟、氯、溴或碘，最優(yōu)選氟、氯或溴。
鹽特別是式I化合物的可藥用鹽。它們可以在鹽形成基團、例如堿性 或酸性基團存在下形成，它們例如在pH范圍為4至10的水性環(huán)境中可以 以至少部分解離的形式存在，或者特別是以固體形式分離，或者它們可以 在帶電基團(例如季銨)存在下形成，在后者情況中，酰化的鹽是與有機或 無機酸(例如如下一個段落定義的)的陰離子形成的。
9此類鹽由具有堿性氮原子的式I化合物優(yōu)選與有機或無機酸形成的，
例如形成為酸加成鹽，特別是可藥用鹽。適合的無機i^A例如氫卣酸(例如 鹽酸)、硫酸或磷酸。適合的有機酸是例如羧酸、膦酸、磺酸或M磺酸， 例如乙酸、丙酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、氨基酸(例如谷氨酸或 天冬氨酸)、馬來酸、羥基馬來酸、曱基馬來酸、苯甲酸、曱磺酸或乙磺酸、 乙-l，2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1，5-萘-二磺酸、N-環(huán)己基氨基磺酸、 N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-H^磺酸，或其它有機質(zhì)子酸，例如抗壞血酸。
在負電荷基團(例如羧基或磺基)的存在下，還可以與堿形成鹽，例如 金屬或銨鹽，例如堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀、鎂或鈣鹽，或與氨 或適合的有機胺的銨鹽，例如叔單胺，例如三乙胺或三(2-羥基乙基)胺，或 雜環(huán)堿，例如N-乙基-哌咬或N，N，-二甲基旅嚷。
當堿性基團和酸性疾病存在于同一個分子中時，式I化合物還可以形 成內(nèi)鹽。
對于分離或純化目的，也是可能應用不可藥用鹽，例如苦味酸鹽或高 氯酸鹽。對于治療用途，僅應用可藥用鹽或游離化合物(其可應用于包含在 藥物制劑中)，并且因此優(yōu)選這些。
考慮到游離形式的化合物與它們的鹽(包括那些可以用作中間體的鹽， 例如在純化或鑒定化合物或其鹽中)形式之間的緊密關系，上下文中任何涉 及"化合物，，(還包括原料和"中間體")特別是涉及式I化合物的被理解為 還涉及其一種或多種鹽或者游離化合物與其一種或多種鹽的混合物，其每 個旨在還包括任何溶劑化物、代謝前體(例如式I化合物的酯或酰胺)或任何 一種或多種這些物質(zhì)的鹽，正如適當?shù)暮陀欣牟⑶胰绻麤]有另外明確提 及。不同的晶體形式和溶劑化物是可獲得的，然后也包括在內(nèi)。
當復數(shù)形式用于化合物、鹽、藥物制劑、疾病、障礙等時，其旨在表 示還包括單個化合物、鹽、藥物制劑、疾病、障礙等，當應用"一個"、 "一種"等時，指的是不定的或優(yōu)選"一個"、"一種"等。
在某些情況中，本發(fā)明化合物在取代基中可以包含一個或多個手性中 心或者顯示其它不對稱性(導致對映異構體)或者另外可以以多于一種立體 異構體的形式存在，例如由于多于一個手性中心或多于一個其它類型的不對稱性或由于能提供Z/E(或順式-反式)異構體現(xiàn)象(非對映異構體)的環(huán)或 雙鍵。本發(fā)明包括兩種或多種此類異構體的混合物，例如對映異構體的混 合物，特別是外消旋體，以及優(yōu)選純化的異構體，特別是純化的對映異構 體或?qū)τ钞悩嬻w富集的混合物。
式I化合物具有有價值的藥理學性質(zhì)并且用于治療蛋白激酶、特別是 蛋白酪氨酸激酶(特別是在以上"發(fā)明概述"中提及的一種或多種蛋白激酶， 最特別是c-src激酶、VEGF-受體激酶(例如KDR和Flt-l)、 RET-受體激 酶和/或Ephrin受體激酶(例如EphB2激酶、EphB4激酶或相關激酶))調(diào)節(jié) 響應的疾病，其中調(diào)節(jié)優(yōu)選表示抑制，并且響應表示疾病和/或其癥狀的進 程被緩解、停止或者甚至反轉(zhuǎn)成至多并且包括完全或至少暫時治愈。術語 "治療"特別是包括預防，包括例如在患者中的預防性治療，其中說明他 們將要或易于發(fā)生疾病的突變或變化已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，或者優(yōu)選治療性(包括但不 限于緩解性、治愈性、癥狀緩解性、癥狀減輕性、疾病或癥狀抑制性、進 程延緩性、激酶調(diào)節(jié)性和/或激酶抑制性)治療所述疾病，特別是以下提及 的任何一種或多種疾病，
本文所用的術語"治愈性"優(yōu)選表示在治療涉及(特別是失調(diào)的)受體 酪氨酸激酶活性的進行性發(fā)作中的功效。
術語"預防性"優(yōu)選表示預防涉及失調(diào)的受體酪氨酸激酶活性的疾病 的發(fā)作或復發(fā)。
本文所用的術語"延緩進程"特別表示給處于所治療疾病的前期或早 期的患者施用活性化合物，其中患者，例如被診斷出相應疾病的預先形式， 或者患者處于例如藥物治療的病癥或者因意外引起的病癥中，在這種情況 中，發(fā)生相應疾病是可能的，或者例如轉(zhuǎn)移會在沒有治療下預期發(fā)生。
動物優(yōu)選是溫血動物，更優(yōu)選哺乳動物。人(其通常也歸入通用術語"動 物，，)特別是患者或易于對以上或以下定義的疾病存在風險的人(例如由于 某些突變或其它特征)。
當以下或以上提及術語"應用"或"用途"(作為動詞或名詞)(涉及式 I化合物或其可藥用鹽的用途)時，其(如果上下文沒有不同表示或不同建議) 包括任何一個或多個本發(fā)明的以下實施方案，分別是(如果沒有另夕卜說明):
ii在治療蛋白(特別是酪氨酸)激酶調(diào)節(jié)(特別是抑制)響應的疾病中的用途、在 制備用于治療蛋白激酶調(diào)節(jié)(特別是抑制)響應的疾病的藥物組合物中的用 途、在治療蛋白激酶調(diào)節(jié)(特別是抑制)響應的疾病和/或增殖疾病中應用一 種或多種式I化合物的方法、包含一種或多種式I化合物用于治療所述的 蛋白激酶調(diào)節(jié)(特別是抑制)響應的疾病的藥物制劑以及在治療所述的蛋白 激酶調(diào)節(jié)(特別是抑制)響應的疾病中的一種或多種式I化合物，正如適當?shù)?br> 并且有利的，如果沒有另外說明。特別的是，所治療的并且優(yōu)選"應用" 式I化合物的疾病選自以下提及的(特別是酪氨酸)蛋白激酶調(diào)節(jié)(特別是抑 制)響應的(也表示"支持的，，，不僅"依賴"，還包括疾病對調(diào)節(jié)、特別 是抑制蛋白激酶響應的情況，即蛋白激酶活性支持或甚至引起疾病現(xiàn)象) 疾病，特別是以下提及的增殖疾病。
當提及蛋白激酶時，其涉及任何類型的蛋白激酶，特別是以上"發(fā)明 概述"中定義的那些之一，更特別是絲氨^/蘇氨酸和/或優(yōu)選蛋白酪氨酸激
酶，最優(yōu)選一種或多種酪氨酸蛋白激酶，特別選自c-src激酶、VEGF-受 體激酶(例如KDR和Flt-l)、 RET-受體激酶和/或Ephrin受體激酶，例如 EphB2激酶、EphB4激酶或相關激酶，包括任何一種或多種這些激酶的一 種或多種改變的或突變的或等位形式(例如引起各自原癌基因轉(zhuǎn)化為癌基 因的那些，例如組成性活化的突變，例如Bcr-Abl)。特別的是包括異常高 表達的、組成性活化的或正常的但是在患者的給定情況的其它調(diào)節(jié)機制中 相對過度活化和/或突變的形式。
本發(fā)明化合物在調(diào)節(jié)蛋白激酶、特別是作為蛋白激酶抑制劑中的用途
證明
在以下典型的示例性試驗體系的描述中，下列縮略語具有以下含義 DMSO二甲亞砜；DTT-二硫蘇糖醇；EDTA-乙二胺四乙酸鹽；MOI-多 重感染；PMSF-對-曱苯磺酰氟；Tris-三(羥基曱基)氨基甲烷。如果沒有 另外說明，"抑制劑"是式I的試驗化合物。
式I化合物作為抑制劑或Ephrin B4受體(EphB4)激酶的功效可以證明
12Bac-to-Bac (Invitrogen Life Technologies, Basel, Switzerland) GST-融合表達載體的傳代將EphB-類的完整胞質(zhì)編碼區(qū)從分別來源于人胎盤 或腦的cDNA文庫通過PCR擴增。將重組的桿狀病毒傳代，其表達人 EphB4受體的氨基酸區(qū)域566-987(SwissProt Database, Accession No. P54760)。 將GST序列克隆至pFastBacl 載體(Invitrogen Life Technologies, Basel, Switzerland)中并且PCR擴增。將編碼EphB4-受體域 的cDNA在GST序列框架3'端分別克隆至該修飾的FastBacl載體中，以 產(chǎn)生pBac-to-BacTM供體載體。將通過轉(zhuǎn)化獲得的單克隆接種并且過夜培 養(yǎng)，用于小規(guī)^莫質(zhì)粒制備。質(zhì)粒DNA的限制酶分析顯示幾個克隆包^ 期大小的插入片段。通過自動測序，插入片段和約50 bp的側(cè)翼載體序列 在雙鏈上得到發(fā)jiE。
病毒的制備如果沒有另外說明，根據(jù)GIBCO提供的方案制備用于 每種激酶的病毒。簡而言之，將包含激酶域的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染到DH10Bac 細胞系(GIBCO)中并且涂到選擇性瓊脂板上。沒有將融合序列插入到病毒 基因組(通過細菌進行的)中的菌落是藍色。挑選單個白色菌落，并且通過 標準質(zhì)粒純化方法將病毒DNA(桿狀病毒穿梭栽體)從細菌中分離。然后根 據(jù)方案應用Cellfectin試劑將Sf9細胞或Sf21細胞在25 112燒瓶中用病毒 DNA轉(zhuǎn)染。
GST-標記激酶的純化將離心的細胞裂解液裝入2 mL谷胱甘肽-瓊脂 糖柱(Pharmacia)中并且用10 mL的25 mM Tris國HCl， pH 7.5、 2 mM EDTA、 lmMDTT、 200 mM NaCl洗滌三次。然后，將GST-標記蛋白通 過10份(每份1 mL)25 mM Tris-HCl， pH 7.5、 10mM還原型谷胱甘肽、 100mMNaCl、 lmMDTT、 10。/。甘油洗脫，并且在-70。C下J^存。
蛋白激酶試驗蛋白激酶的活性是在抑制劑的存在或不存在下試驗的， 通過測量摻入到谷氨酸和酪氨酸聚合物(聚(GIu，Tyr))(作為底物)中的 [Y33PATP的33P進行。純化的GST-EphB(30 ng)的激酶試驗是在環(huán)境溫度 下、在包含20mMTrisHCl， pH7.5、 10mMMgCl2、 3-50mMMnCl2、 0.01 mM Na3V04、 l%DMSO、 1 mM DTT、3 pg/mL聚(Ghi，Tyr) 4:l(Sigma; St. Louis, Mo" USA)和2.0-3.0 |uM ATP(y-[33P-ATP 0.1 fiCi)的終體積30
13中進行15-30分鐘。通過加入20 nL 125 mM EDTA將試驗終止。隨后， 將40 反應混合物轉(zhuǎn)移至預先用甲醇浸泡5分鐘的Immobilon-PVDF膜 (Millipore， Bedford, MA， USA)上，用水沖洗，然后用0.5%113 04浸泡5 分鐘并且安裝在切斷真空源的真空裝置上。點完所有樣品后，連接真空并 且將每孔用200 |LiL 0.5%H3PO4沖洗。將膜移去并且在振蕩器上用 1.0。/。H3P04洗滌4次，用乙醇洗滌l次。在環(huán)境溫度下干燥后，將膜計數(shù)， 安裝在Packard TopCount%-孔框架中并且加入10 pL/孑L的 MicroscintTM(Packard)。 ICso值是通過每種化合物在四種濃度(通常是0.01 、 0.1、 l和10nM)下重復兩次的抑制百分數(shù)的線性回歸分析來計算的。蛋白 激酶活性的一個單位定義為在37'C下每亳克蛋白每分鐘由h^PATP轉(zhuǎn)移 至底物蛋白的1 nmol的33P ATP。式I化合物顯示EphB4抑制范圍為0.005 pM-lO pM，優(yōu)選ICso值為0.05-10 ^M。
可選擇的是，EphB4受體自磷酸化可以測量如下EphB4受體自磷 酸化的抑制可以用體外細胞試驗來證實，例如將轉(zhuǎn)染的A375人黑素瘤細 胞(ATCC號CRL-1619)(其穩(wěn)定表達人EphB4(SwissProt AccNo P54760)) 接種在6-孔細胞培養(yǎng)板的完全培養(yǎng)基(具有10。/。胎牛血清-FCS)中，并且在 37。C和5。/。C02下培養(yǎng)，直至它們顯示出90%融合。然后將試驗化合物在 培養(yǎng)基(沒有FCS，具有0.1。/。牛血清白蛋白)中稀釋并且加入至細胞中。(對 照包含無試驗化合物的培養(yǎng)基)。配體誘導的自磷酸化是通過加入1颶/mL 可溶的ephrinB2-Fc(s國ephrinB2-Fc: R&D Biosystems ， CatNr 496畫EB)和 0.1 pM原釩酸鹽來誘導的。在37。C下進一步培養(yǎng)20分鐘后，將細胞用冰 冷的PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次并且立即在200 |LiL裂解緩沖^/孔中裂 解。然后，將裂解液離心以除去細胞核，并且上清液的蛋白濃度是應用商 購的蛋白試驗(PIERCE)來確定的。然后，將裂解液立即應用或者如果需要， 在-20'C下貯存。
夾心ELISA用于測量EphB4磷酸化為了捕獲磷酸化的EphB4蛋白， 將100 ng/孑L的ephrinB2-Fc(s-ephrinB2-Fc: R&D Biosystems, CatNr 496-EB)固定在MaxiSorb(Niinc)ELISA板中。然后，將板洗滌并且將剩余 的游離蛋白結合位點用在含有吐溫20⑧(聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯，ICI/Uniquema)的磷酸鹽緩沖液(PBST)中的3%TopBlock (Juro， Cat. # TB232010)飽和。然后，將細胞裂解液(100ng蛋白/孔)在室溫下在這些板 中培養(yǎng)l小時。用PBS將孔洗滌三次后，加入偶^t喊性磷酸酶的抗磷酸酪 氨酸抗體(PY 20堿性磷酸鹽結合的ZYMED， Cat Nr03-7722)并且再培養(yǎng) 1小時。將板再洗滌，然后證明抗磷酸酪氨酸抗體與捕獲的磷酸化受體的 結合，并且應用10 mM D-硝基苯基磷酸鹽(作為底物)進行定量并且在0.5-1 小時后測量405 nm處的OD。
陽性對照(用釩酸鹽和s-ephrinB2-Fc刺激的)和陰性對照(沒有刺激)的 信號差異對應最大的EphB4磷酸化(=100%)。試驗物質(zhì)的活性計算為最大 EphB4磷酸化的抑制百分數(shù)，其中誘導一半最大抑制的物質(zhì)的濃度定義為 ICso(用于50%抑制的抑制劑量)。對于式I化合物，可以發(fā)現(xiàn)ICso值范圍 為0.005至10 nM，優(yōu)選0.005至5 jiiM。
式I化合物還可以抑制其它酪氨酸蛋白激酶，例如特別是c-Src激酶， 其與動物、特別是哺乳動物細胞，包括人細胞的生長調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化有關。適 合的試驗在Andrejauskas畫Buchdunger等人，Cancer Res. 52， 5353-8(1992) 中描述。應用該試驗體系，式I化合物可以顯示抑制c-Src的ICso值范圍 為例如0.01至20 |aM，通常為0.01至10 ^M。
本發(fā)明化合物作為KDR蛋白-酪氨酸激酶活性抑制劑的活性可以證明 如下VEGF-誘導的受體自磷酸化的抑制可以在細胞中、例如轉(zhuǎn)染的CHO 細胞中證明，該細胞穩(wěn)定表達人VEGF-R2受體(KDR)，并且將其接種在 6-孔細胞培養(yǎng)板的完全培養(yǎng)基(具有10。/。胎牛血清-FCS)中，并且在37。C 、 5。/。C02下培養(yǎng)，直至它們顯示出約80%融合。然后，將試驗化合物在培 養(yǎng)基(沒有FCS，具有0.1%牛血清白蛋白)中稀釋并且加入至細胞中。對照 包含無試驗化合物的培養(yǎng)基。在37。C下培養(yǎng)2小時后，加入重組的VEGF; 最終VEGF濃度是20 ng/mL。在37°C下進一步培養(yǎng)5分鐘后，將細胞用 冰冷的PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次并且立即在100 |aL裂解緩沖、^/孔中 裂解。然后，將裂解液離心以除去細胞核，并且上清液的蛋白濃度是應用 商購的蛋白試驗(BIORAD)來確定的。然后，將裂解液立即應用或者如果 需要在-20。C下貯存。應用該方案，發(fā)現(xiàn)選擇的式I化合物顯示對KDR抑制的ICso值優(yōu)選比對c-Abl酪氨酸激酶高出至少1.5倍，更優(yōu)選比對EphB4
酪氨酸激酶高出大于2倍。在該試驗體系中，對于式I化合物，發(fā)現(xiàn)IQo 值范圍為0.01至20pM，更優(yōu)選為0.01至10 nM。 式I化合物還可以抑制其它蛋白激酶。
本發(fā)明化合物作為c-Abl蛋白酪氨酸激酶活性抑制劑的功效可以證明 如下
體外酶試驗是在96孑U1中進行的，如Geissler等Cancer Res. 1992; 52:4492-4498中描述的濾膜結合試驗，進行如下修改。將c-Abl的His-標 記激酶域克隆并且在桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)中表達，如Bhat等人在J.Biol.Chem. 1997; 272:16170-16175中描述的。將37 kD的蛋白(c-Abl激酶)通過兩步法 純化，經(jīng)鈷金屬螯合柱后進行陰離子交換柱，產(chǎn)量為1-2 mg/L的Sf9細胞 (Bhat等人，引用的參考)。通過SDS-PAGE考馬斯藍染色后判斷c-Abl激 酶的純度>90%。該試驗包含(總體積為30 nL): c-Abl激酶(50ng)、 20 mM Tris.HCl， pH 7.5、 10 mM MgCI2、 10 pM Na3V04、 1 mM DTT和0.06 jnCi/ 試驗 [/3p-ATP(5 pM ATP)， 應用 30 pg/mL 聚 隱Ala，Glu，Lys，Tyr-6:2:5:l(Poly-AEKY， Sigma P1152),在l%DMSO的存在 下進行。通it^入10 |iL 250 mM EDTA將反應終止并且將30 jaL反應混 合物轉(zhuǎn)移到預先用甲醇浸泡5分鐘的Immobilon-PVDF膜(Millipore， Bedford, MA， USA)上，用水沖洗，然后用0.5%11*04浸泡5分鐘，并且 安裝在切斷真空源的真空裝置上。點完所有樣品后，連接真空并且將每孔 用200 nL0.5。/。H3PO4沖洗。將膜移去并且在振蕩器上用0.5%11^04洗滌 (4次)并且用乙醇洗滌1次。在環(huán)境溫度下干燥后，將膜計數(shù)，安裝在 Packard TopCoimt96-孑L框架中，并且加入 10 ^L/孑L的 MicroscintTM(Packard)。應用該試驗體系，式I化合物可以顯示對c-Abl 抑制的ICso值的范圍為例如0.02至10 nM，通常為0.02至5 |aM。
另外，式I化合物還可用于抑制b-raf(V599E)。 B-Raf-V外9E的活性 是在抑制劑的存在或不存在下通過測量y^PATP摻入到(ffis)-lKB中的33P 而試驗的。將試驗化合物溶于DMSO(10 mM)中并且在-20。C下貯存。在 DMSO中新鮮制備系列稀釋液并且進一步用純 J^釋以得到在3%DMSO
16中的3倍濃縮試驗溶液。終體積(30 nL)的試驗包含10 pL試驗溶液 (l%DMSO)、 10fxL試驗混合物(20mMTris畫HCl， pH7.5、 3mMMnCl2、 3 mM MgCl2、 1 nM DTT、 3 |Xg/mL(His)-lKB， l%DMSO和3.5 jxM ATP [,P-ATP 0.1 nCi)和10 酶稀釋液(600 ng的GST-B-Raf-V599E)。在 96-孔形式中的移液步驟按程序設計在MultiPROBE Iix、 MultiPROBE IILx或HamiltonSTAR 自動機上進行。試驗如文獻(參見C. Garcia-Echeverria等人，Cancer Cel.. f， 231-9(2004))中描述的那樣進行， 通過加入20 125 raM EDTA來終止。通過濾膜結合的方法來捕獲磷酸 化的肽進行如下將40 |LiL反應混合物轉(zhuǎn)移到預先用甲醇浸泡5分鐘的 Immobilon-PVDF膜上，用水沖洗，然后用0.5%H3PO4浸泡5分鐘并且安 裝在切斷真空源的真空裝置上。點完所有樣品后，連接真空并且將每孔用 200 pL0.5。/。H3PO4沖洗。將游離膜移去并且在振蕩器上用1.0。/。HbP04洗 滌4次，用乙醇洗滌1次。在環(huán)境溫度下干燥后將膜計數(shù)，安裝在Packard TopCount96-孔框架中并且加入10 pL/孔的MicroscintTM。最后，將板密 封并且在微板閃爍計數(shù)器(TopCount NXT， TopCount NXT HTS)中計數(shù)。 在閃板方法的情況中，激酶反應首先在基于聚苯乙烯的塑料板中進行，60 分鐘后通過加入20 pL 125 mM EDTA來終止。為了捕獲(60分鐘，室溫)， 將生物素化的底物轉(zhuǎn)移到鎳包被的閃板中。將試驗板用PBS洗滌三次并且 在室溫下干燥。然后，將板密封并且在微教閃爍計數(shù)器(T叩Count NXT， TopCoimtNXTHTS)中計數(shù)。ICso值通過化合物在四個濃度(通常是0.01、 0.1、 1和10 nM)下重復兩次的抑制百分數(shù)的線性回歸分析來計算或者作為 8個單點ICso，起始在10inM,隨后按1:3稀釋。對于b-raf抑制，式I化 合物可以顯示ICso值的范圍為0.0005 nM至20 |iM，例如范圍為0.001至 帥M。
結果表明式I化合物的有利的親和特性。
還有試驗證明式I化合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性。例如，為了試驗式I 化合物在體內(nèi)是否抑制血管發(fā)生，在小鼠的生長因子移植模型中試驗了其 對血管發(fā)生因子(例如VEGF、 bFGF、 S-1P. PDGF或IGF-1)誘導的血管發(fā) 生響應的作用在多孔特氟隆室(體積0.5 mL)中^包含肝素的(20單位/mL)的0.8。/。w/v瓊脂，將或不將生長因子(2嗎/mL人VEGF)皮下^A到 C57/C6小鼠的背側(cè)脅腹。將小鼠用試驗化合物(例如5、 10、 25、 50或100 mg/kg， 口服每天一次)或載體處理，在植入室的當天開始并且此后連續(xù)4 天。在處理結束后，將小鼠處死，并且將室取出。將生長在室周圍的血管 化的組織小心取出并且稱重，血含量是通過測量組織的血紅蛋白含量來估 算的(Drabkins方法；Sigma， Deisenhofen， Germany)。 Tie-2蛋白水平(作為 內(nèi)皮標志物的測量)通過特異的ELISA確定以將血管發(fā)生響應定量。以前 已經(jīng)顯示這些生長因子誘導生長在室周圍的組織(組織學表征包含成纖維 細胞和小血管)的重量、血含量和Tie-2蛋白水平呈劑量-依賴性增加，并且 該響應是通過中和抗體來封閉的，例如特異性中和VEGF(參見Wood JM 等人，Cancer Res. 60(8)， 2178-2189, (2000);和Schlaeppi等人，J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125,336-342,(1999》。對于該模型，在以上給定的濃度的 式I化合物的情況中可以表現(xiàn)出抑制。在本發(fā)明優(yōu)選的理解中，蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的疾病是對用所治療的單 個有利方法來調(diào)節(jié)(特別是抑制)蛋白(優(yōu)選酪氨酸)激酶活性響應的障礙，特 別是具有以上優(yōu)選特征的疾病(其中可以應用式I化合物)，其是一種或多種 增殖疾病(表示其取決于(特別是不適當?shù)?蛋白激酶活性)，包括過度增殖病 癥，例如一種或多種白血病、增生、纖維變性(特別是肺，但是還可以是其 它類型的纖維變性，例如腎纖維變性)、血管發(fā)生、4艮屑病、動脈粥樣硬化 和血管平滑肌增生(例如血管成形術后的狹窄或再狹窄)。另外，式I化合物 可以用于治療血栓形成和/或硬皮病。優(yōu)選的是式I化合物在治療(包括預防)增殖障礙(特別是其對調(diào)節(jié)(特別途，所述的增殖障礙選自肺瘤或癌癥疾病，特別是對抗優(yōu)選良性或特別是 惡性腫瘤或癌癥疾病，更優(yōu)選實體瘤，例如腦癌、腎癌、肝癌、腎上腺癌、 膀胱癌、乳腺癌、胃癌(特別是胃腫瘤)、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、前列 腺癌、胰腺癌、肺癌(例如小或大細胞肺癌)、陰道癌、甲狀腺癌、肉瘤、 膠質(zhì)母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤或胃腸癌，特別是結腸癌或結腸直腸腺瘤， 或頸與頭的腫瘤，例如頭與頸的鱗狀癌，包括瘤形成，特別是上皮特征的，例如在乳房癌的情況中；表皮過度增殖(非癌癥)，特別是銀屑??；前列腺 增生；或白血病。
式I化合物或其用途使其可能f 1起腫瘤消退和/或預防肺瘤轉(zhuǎn)移的形成 和(微)轉(zhuǎn)移的生長。
將式I化合物用于治療涉及與幾個或特別是單個蛋白(優(yōu)選酪氨酸)激 酶(特別是優(yōu)選提及的那些)相關的免疫系統(tǒng)疾病也是可能的；另外，式I 化合物還可以用于治療中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所述的疾病涉及由至少
的信號轉(zhuǎn)導。
在慢性粒細胞白血病(CML)中，造血干細胞(HSC)中的相互平衡的染 色體易位產(chǎn)生BCR-ABL雜交基因。后者編碼致癌的Bcr-Abl融合蛋白。 但是，ABL編碼緊密調(diào)節(jié)的蛋白酪氨酸激酶，其在調(diào)節(jié)細胞增殖、粘附和 凋亡中發(fā)揮重要作用，BCR-ABL融合基因編碼組成性的活化的激酶，其 轉(zhuǎn)化HSC以產(chǎn)生顯示失調(diào)的克隆的增殖、對骨髓間質(zhì)粘附的能力降低以及 對突變刺激的凋亡響應降低的表型，這使得其進行性地累積更多惡性轉(zhuǎn)化。 產(chǎn)生的粒細胞未能發(fā)育成成熟淋巴細胞并且被釋放^循環(huán)系統(tǒng)，導致成 熟細胞的缺乏和感染易感性的增加。已經(jīng)描述了 Bcr-Abl(或相當?shù)耐蛔冃?式)的ATP-竟爭性抑制劑阻止激酶活化促有絲分裂和抗凋亡途徑(例如P-3 激酶和STAT5)，導致BCR-ABL表型細胞死亡并且因此提供了對CML有 效的治療。因此，本發(fā)明應用的式I的3-tJ^-吡峻化合物作為Bcr-Abl抑 制劑特別適用于治療與其it^J^目關的疾病，特別是白血病，例如白血病， 例如CML或ALL。
血管發(fā)生被認為是那些生長超過最大直徑約1-2 mm的腫瘤的絕對先 決條件；達到這個極限，氧和營養(yǎng)素是可能通過擴散來提供給腫瘤細胞。 因此，每種腫瘤(無論是原發(fā)的還是繼發(fā)的)在其達到一定大小后其生長取 決于血管發(fā)生。三個主要機制在對抗腫瘤的血管發(fā)生抑制劑的活性中發(fā)揮 重要作用l)抑制血管(特別是毛細管)生長進入無血管的休眠腫瘤，結果是 由于在凋亡和增殖之間獲得了平衡，沒有凈肺瘤生長；2)由于缺乏血流進 出胂瘤而防止腫瘤細胞遷移；和3)抑制內(nèi)皮細胞增殖，從而避免通過內(nèi)皮細胞正常連接血管而施加在外周組織上的旁分泌生長刺激作用。
式I化合物，考慮到它們抑制KDR并且特別是Ephrin受體激酶以及 可能抑制其它蛋白激酶并且因此調(diào)節(jié)血管發(fā)生的能力，其特別適合用于對 抗與相應受體、優(yōu)選酪氨酸激酶的不適當活性、特別是其過表達有關的疾 病或障礙。在這些疾病中，以下是特別重要的特別是例如局部缺血、視 網(wǎng)膜病變(例如年齡相關的)、黃斑變性、銀屑病、肥胖癥、血管母細胞瘤、 血管瘤、炎性疾病例如類風濕或風濕炎性疾病，特別是關節(jié)炎，例如類風 濕性關節(jié)炎或其它慢性炎性障礙例如慢性哮喘、動脈或移植后動脈粥樣硬 化、子宮內(nèi)膜異位癥并且特別是腫瘤疾病，例如所謂的實體瘤，特別是胃 腸道癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、前列腺癌、卵 巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、腦癌、黑素瘤、卡波西肉瘤、頭與頸的鱗狀細 胞癌、惡性胸膜間皮瘤(mesothelioma)、淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤，和進一 步的液體腫瘤，例如白血病。
式I化合物特別用于預防或治療由持續(xù)血管發(fā)生觸發(fā)的疾病，例如再
狹窄，例如支架誘導的再狹窄；克隆病；霍奇金病；眼疾病，例如糖尿病 性視網(wǎng)膜病變和新生血管性青光眼；腎疾病，例如腎小球腎炎；糖尿病腎 病；炎性腸病；惡性腎硬化；血栓性微血管病綜合征；(例如匱性)移植排 斥反應和腎小球??；纖維變性疾病，例如肝硬化；腎小球膜細胞增殖疾??； 神經(jīng)組織損傷；以及用于抑制氣嚢導管治療后血管再閉塞，用于血管修復 或插入維持血管暢通的機械裝置(例如支架)后，作為免疫抑制劑，作為無 疤痕傷口愈合的輔助劑，以及用于治療老年斑和接觸性皮炎。
優(yōu)選的是，本發(fā)明涉及式I化合物或其可藥用鹽在治療本文提及的實 體瘤和/或本文提及的液體腫瘤、例如白血病中的用途。
制備方法
式I化合物是應用類似于本領域基本上已知的用于其它化合物的方法 來制備的，以便對于新的式I化合物，方法是新的類似的方法，優(yōu)選通過 在式IV或式V的原料與式VI的原料或其活性衍生物之間形成酰胺鍵
20如果需要，將式I化合物轉(zhuǎn)化為不同的式I化合物，將可獲得的式I 化合物的鹽轉(zhuǎn)化為游離化合物或不同的鹽，將可獲得的游離的式I化合物 轉(zhuǎn)化為其鹽，和/或?qū)⒖色@得的式I化合物的異構體混合物分離為單個異構 體。
與式VI的酸或其活性衍生物的縮合反應優(yōu)選與活性酸衍生物(其可以
以本身應用)，例如與對稱或混合酸酐、活性酯或酰鹵(例如酰氯)形式的活 性酸衍生物，例如在叔氮堿(例如三-低級烷基胺或吡咬)的存在下進行，或 者活性酸^t生物可以例如在原位形成活性酯的試劑的存在下通過縮合反應 原位形成。該反應例如通過將原料溶于適合的溶劑例如卣代烴，例如二氯
甲垸、N，N-二曱基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮或者兩 種或多種此類溶劑的混合物中，并且通過加入適合的堿例如三乙胺、二異 丙基乙基胺(DIEA)或N-甲基嗎啉來進行，并且如果活性酸衍生物是原位形 成的，原位形成活性酸衍生物的適合的偶聯(lián)劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DCC/HOBT)、雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOPCl)、 0-(l，2-二氫-2-氧代-l-吡^&)-N，N，N，，N，-四甲基脲錄四氟硼酸鹽(TPTU)、 O-(苯并三唑-l-基)-N，N，N，，N，-四曱基脲錯四氟硼酸鹽(TBTU)、(苯并三唑 -1-基氧基)-三吡咯烷子基錟-六氟磷酸鹽^78(^)、1-(3-二曱基絲丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/羥基苯并三唑或l-羥基-7-氮雜苯并三唑(EDC/HOBT 或EDC/HOAt)或單獨的HOAt，或與(l-氯-2-甲基-丙烯基)-二甲基胺一起。
21對于某些其它可能的偶聯(lián)劑，參見例如Klauser; Bodansky， Synthesis 1972， 453-463。優(yōu)選將反應混合物在溫度為約-20至50。C 、特別是0。C至30匸、 例如室溫下攪拌。
任選的反應和轉(zhuǎn)化
可以將式I化合物轉(zhuǎn)化為不同的式I化合物。
可以將具有至少一個鹽形成基團的式I化合物的鹽以自身已知的方法 制備。例如，具有酸性基團的式I化合物的鹽可以通過將化合物用金屬化 合物(例如適合的有機羧酸的堿金屬鹽，例如2-乙基己酸的鈉鹽)、無M 金屬或堿土金屬化合物(例如相應的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，例如氬 氧化鈉或氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀或者碳酸氫鈉或碳酸氫鉀)、相應的鈣 化合物或者氨或適合的有機胺處理而形成，優(yōu)選應用化學計算量或僅少量 過量的鹽形成試劑。式I化合物的酸加成鹽可以以常規(guī)方法、例如通過將 式I化合物用酸或適合的離子交換試劑處理而獲得。具有酸性和堿性鹽形
成基團(例如氣基和^JO的式I化合物的內(nèi)鹽可以例如通過例如用弱堿將 鹽(例如酸加成鹽)中和到等電點或者通過用離子交換劑處理而形成?？梢?將式I化合物的鹽以常規(guī)方法轉(zhuǎn)化為游離化合物、金屬或銨鹽，例如，通 過用適合的酸和酸加成鹽處理，例如，通過用適合的堿性試劑處理。在兩 種情況中，可以應用適合的離子交換劑。
通過適合的分離方法可以將立體異構體混合物(例如非對映異構體混 合物)以本身已知的方法分離為它們相應的異構體。通過分級結晶、色譜法、 溶劑分配和類似的方法可以將非對映異構體混合物分離為它們各自的非對 映異構體。該分離可以在起始化合物之一的水平或在式I化合物本身中進
行。對映異構體可以通過形成非對映異構體鹽進行分離，例如通過與對映 異構純的手性酸形成鹽或通過色譜法，例如通過HPLC，應用具有手性配 體的色鐠底物進行。
中間體和終產(chǎn)物可以根據(jù)標準方法處理和/或純化，例如應用色譜方 法、分配方法、(重)結晶等。
原料
原料或者是本領域已知的(它們中的某些甚至可以是可商購獲得的)，或者它們可以根據(jù)本領域已知的方法制備。保護基(即使沒有特別提及)可 以在適當?shù)臅r候引入和除去，以保護官能團，官能團的反應在相應的反應 步驟中是不希望的。保護基和它們引入和除去的方法例如在提及的參考文 獻中描述。本領域技術人員將容易地決定是否以及哪種保護基是有用的或 需要的。
除了式IV、 V或VI那些之夕卜，原料例如優(yōu)選以下這些(除非另外說明， 原料式中的變量如式I中定義的) 式II的原料
其中R4是卣素、d-7烷氧基或三氟甲基，n是l或2，并且Halo是鹵 素，例如氯、氟、硪或溴，優(yōu)選氯。 式II，的原料
其中R3是Cw烷基或鹵素，R4是鹵素、Cw烷氧基或三氟甲基，并且 n是l或2。
式III的原料可以例如通過在式II的原料與式II，的原料之間形成酰胺 鍵而獲得，例如在二氯甲烷中、在室溫下應用三乙胺。
式IV的原料(其中R3是Cp烷基或鹵素，Rt是鹵素、Cw烷氧基或三 氟曱基，并且n是1或2)可以例如通過將相應的式III的原料例如用 Raney-Nickel在甲醇中在室溫下氫化而獲得。
其中R3是d
式III的原料
烷基或卣素
23式V的原料(其中R3是Cw烷基或鹵素，R4是卣素、d.7烷lt^或三
氟曱基，并且n是1或2)可以例如以制備式IV的原料中描述的類似的方 法應用相應的原料而獲得。
式IV和V的原料具有以下通式
Ri如式I中定義的。 通用處理條件
以下通常應用于上下文提及的所有處理，但是優(yōu)選上下文特別提及的 反應條件
在任何反應中，當適當或需要時，即使沒有特別提及，可以將保護基 用于保護不需要參與給定反應的保護官能團，并且在適當或需要的階段可 以將它們引入和/或除去。因此，包括應用保護基的反應還盡可能包括在本 申請中描述的沒有特別提及保護和/或脫保護的反應的情況中。
在本公開的范圍內(nèi)，除非上下文另外說明，僅將容易除去的基團(其不 是特別需要的式I終產(chǎn)物的組成)指定為"保護基"。功能團通過此類保護 基的保護、保護基本身以及它們的除去在例如標準參考著作中描述，例如 J. F. W. McOmie， "Protective Groups in Organic Chemistry(有機化學中 的保護基)"，Plenum Press, London and New York 1973; T. W. Greene和 P. G. M. Wuts， "Protective Groups in Organic Synthesis(有機合成中的保 護基)"，第三版，Wiley， New York 1999; "The Peptides(肽)"；第3巻(編 輯E. Gross和J. Meienhofer)， Academic Press, London and New York 1981;" Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic
其中Rz和R3如式I中定義的。
在式VI的原料中Chemistry(有機化學方法))，Houben Weyl，第4版，第15/1巻，Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974 ; H.畫D. Jakubke和H. Jeschkeit， "AminosSuren， Peptide, Proteine" (Amino acids, Peptides, Proteins(氨基 酸、肽、蛋白質(zhì))),Verlag Chemie， Weinheim， Deerfield Beach, and Basel 1982 ; 以及 Jochen Lehmann, " Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate ，， (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives(碳7JC化合物化學單糖及衍生物))，Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974。保護基的特性是它們可以例如通過溶劑解、 還原、光解或可選擇的是在生理條件下(例如通過酶裂解)容易地除去。
所有上述處理步驟可以在本身已知的反應條件下進行，優(yōu)選特別提及 的那些，不存在或通常存在溶劑或稀釋劑，優(yōu)選對所用的試劑是惰性的并 且溶解它們的溶劑或稀釋劑，不存在或存在催化劑、縮合劑或中和劑，例 如離子交換劑，例如陽離子交換劑，例如以H+形式，這取決于在降低、正 ?；蛏叩臏囟认路磻?或反應物的性質(zhì)，在例如溫度范圍為約-100。C至 約190。C、優(yōu)選約-80。C至約150'C、例如-80至-60。C、室溫、-20至40。?；?回流溫度下，在大氣壓下或在升高或降低的壓力的密閉容器中，和/或在惰 性氣氛下，例如在氬氣或氮氣氣氛下。
溶劑(適合于任何特殊反應的那些溶劑)可以選自包括特別提及的那 些，例如水、酯類(例如低級烷基-低級鏈烷酸酯，例如乙酸乙酯)、醚類(脂 肪族醚類(例如乙醚)或環(huán)醚類(例如四氫呋喃或二^悉烷))、液體芳香烴類(例 如苯或甲苯)、醇類(例如甲醇、乙醇或者1-或2-丙醇)、腈類(例如乙腈)、 鹵代烴類(例如二氯甲烷或氯仿)、酰胺類(例如二甲基甲酰胺或二曱基乙酰 胺)、堿類(例如雜環(huán)氮堿，例如吡啶或N-甲基-吡咯烷-2-酮)、羧酸酐(例如 低級鏈烷酸酐，例如乙酸酐)、環(huán)、直鏈或支鏈烴類(例如環(huán)己烷、己烷或 異戊烷)或者這些的混合物，例如水溶液，除非在處理描述中另外說明。此 類溶劑混合物還可以用于處理，例如通過色譜法或分配。
本發(fā)明還涉及那些處理形式，其中將在處理的任何階段中作為中間體 可獲得的化合物用作原料并且進行剩下的處理步驟，或者其中原料是在反 應條件下形式的或以衍生物形式(例如保護的形式或鹽形式)應用，或者通過本發(fā)明處理可獲得的化合物是在處理條件下產(chǎn)生的并且在原位進一步處 理。在本發(fā)明的處理中，優(yōu)選應用那些產(chǎn)生優(yōu)選描述的式I化合物的原料。 本發(fā)明還涉及新的中間體和/或原料。特別優(yōu)選與實施例中提及的那些相同 或相似的反應條件。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案
在優(yōu)選的實施方案中和在上下文更全面范圍的實施方案中，以及在權 利要求中，任何一個或多個或所有通用表達可以被上下文提供的相應的更 特別的定義替代，從而獲得更強大的本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明優(yōu)選涉及游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物，其中
畫Ri是-CH3或者被以下取代基Cw烷氧基或d々烷基取代的苯基，苯 基取代基優(yōu)選是Cw烷氧基，優(yōu)選d—4烷氧基；或者
-R3是d.7烷基，優(yōu)選CL4烷基；或者
是-CH3或者被d_7烷氧基、優(yōu)選d_4烷氧基取代的苯基，
畫R2是畫NH-CO-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自氟、d.7烷氧基(優(yōu) 選Ci4烷fLiO或三氟甲基的取代基取代，或
-CO-NH-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自Cw烷氧基(優(yōu)選C" 烷氧基)或三氟甲基的取代基取代，并且
-R3是d.7烷基，優(yōu)選CL4烷基；或者
-R，是-CH3或被d_4烷氧基(優(yōu)選甲IL^)取代的苯基， 畫R2是-NH畫CO-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自氟、C"烷氧基(優(yōu)
選甲氧基)或三氟甲基的取代基取代，或
-CO-NH-苯基,其中苯基環(huán)被一個或兩個選自C"烷氧基(優(yōu)選甲lL&)
或三氟甲基的取代基取代；并且 畫R3是C^烷基，優(yōu)選甲基。 在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及
-藥物制劑，該藥物制劑包含式I化合物或其可藥用鹽，以及至少一種 可藥用載體。
-式I化合物或其可藥用鹽，其用于診斷性或治療性治療動物或人體。 誦式I化合物或其可藥用鹽在治療蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的疾病中的用途，
26或者在制備用于治療蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的疾病的藥物制劑中的用途，例如 其中蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的疾病是一種或多種選自對抑制 一種或多種蛋白酪
氨酸激酶具有響應的疾病，所述的激酶選自c-src激酶、VEGF-受體激酶(例 如KDR和Flt-l)、RET-受體激酶和/或Ephrin受體激酶(例如EphB2激酶、 EphB4激酶或相關激酶)，例如其中所治療的疾病是一種或多種選自以下的 疾病增殖疾病，例如白血病(特別是慢性粒細胞白血病(CML)或ALL)、 增生、纖維變性(例如肝硬化)、血管發(fā)生、銀屑病、動脈粥樣硬化(特別是 動脈或移植后動脈粥樣硬化)、血管平滑肌增生(例如血管成形術后的狹窄 或再狹窄)，腫瘤或癌癥疾病，特別是良性或特別是惡性胂瘤或癌癥疾病， 更特別是實體瘤，例如腦癌、腎癌、肝癌、腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、 胃癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌、陰 道癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、肉瘤、M母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤或胃 腸癌、結腸直腸腺瘤，黑素瘤或頸與頭的腫瘤(例如頭與頸的鱗狀癌)、腎 小球膜細胞增殖疾病、惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、瘤形成，特別是上皮特 征的，例如在乳房癌的情況中，表皮過度增殖(非癌癥)，特別是銀屑病、 前列腺增生；卡波西肉瘤、血栓形成、硬皮??；免疫系統(tǒng)疾??；中樞或外 周神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中至少一種蛋白(優(yōu)選酪氨酸)激酶(特別是選自優(yōu)選提 及的那些蛋白酪氨酸激酶)參與信號轉(zhuǎn)導；視網(wǎng)膜病變例如糖尿病性視網(wǎng)膜 病變、新生血管性青光眼或黃斑變性、肥胖癥、血管母細胞瘤、血管瘤； 糖尿病腎?。粣盒阅I硬化、炎性疾病例如類風濕或風濕炎性疾病，特別是 關節(jié)炎，例如類風濕性關節(jié)炎、其它慢性炎性障礙例如慢性哮喘、子宮內(nèi) 膜異位癥、克隆病、霍奇金病、腎小球腎炎、炎性腸病、血栓性孩bfii管病 綜合征、移植排斥反應、腎小球病、神經(jīng)組織損傷、傷口愈合、老年斑、 接觸性皮炎和再狹窄例如支架誘導的再狹窄。
-制備式I化合物的方法，該方法包括在式V，的原料與式VI的原料之
間形成酰胺鍵，其中R!、 R2和R3如以上定義的，并且如果需要，將式I
化合物轉(zhuǎn)化為不同的式I化合物，將可獲得的式I化合物的鹽轉(zhuǎn)化為游離 化合物或不同的鹽，將可獲得的游離的式I化合物轉(zhuǎn)化為其鹽，和/或?qū)⒖?獲得的式I化合物的異構體混合物分離為單個異構體。
27藥物組合物
本發(fā)明還涉及包含優(yōu)選新的式I化合物的藥物組合物、它們在治療(在 本發(fā)明更廣的方面還包括預防)中的用途或治療疾病或障礙的方法，其取決 于不適當?shù)牡鞍?特別是酪氨酸)激酶活性，特別是以上提及的優(yōu)選的障礙 或疾病，本發(fā)明還涉及用于所述用途的化合物和藥物制劑以及它們的制備， 特別是用于所述用途。更通常的是，藥物制劑在式I化合物的情況中是有 用的。
本發(fā)明的藥理學可接受的化合物可以存在于藥物組合物中或用于例如 制備藥物組合物，所述的藥物組合物包含有效量的式I化合物或其可藥用 鹽作為活性成分，與一種或多種無機或有機、固體或液體、可藥用載體(載 體物質(zhì))一起或混合。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其適合施用于溫血動物，特別是人(或施用 于衍生自溫血動物，特別是人的細胞或細胞系，例如淋巴細胞)，用于治療 (在本發(fā)明更廣的方面，還包括預防，例如預防對抗)對抑制蛋白質(zhì)(特別是 酪氨酸)激酶活性響應的疾病，該藥物組合物包含一定量的式I化合物或其 可藥用鹽(優(yōu)選其對所述抑制是有效的)以及至少一種可藥用栽體。
本發(fā)明的藥物組合物是用于腸內(nèi)(例如鼻、直腸或口服)或非腸道(例如 肌內(nèi)或靜脈內(nèi))施用于溫血動物(特別是人)的那些，其包含有效劑量的藥理 學活性成分，單獨或與有效量的可藥用載體一起?；钚猿煞值膭┝咳Q于 例如溫血動物的種類、體重、年齡和個體情況、個體藥代動力學數(shù)據(jù)、所 治療的疾病和施用方式。
本發(fā)明還涉及治療疾病的方法，其對抑制取決于不適當?shù)牡鞍?特別是 酪氨酸)激酶活性的疾病有響應，該方法包括特別是給溫血動物(例如人)施 用預防或特別是治療有效量的式I化合物或其可藥用鹽，因為所提及的疾 病之一需要此類治療。
施用于溫血動物(例如約70 kg體重的人)的式I化合物或其可藥用鹽的 劑量優(yōu)選為約3 mg至約10 g、更優(yōu)選約10 mg至約1.5 g、最優(yōu)選約100 mg 至約1000 mg/人/天，優(yōu)選分為1至3個單劑量，其可以例如是相同大小。 通常，兒童接受成人劑量的一半。藥物組合物包含約1%至約95%、優(yōu)選約20%至約90%的活性成分。 本發(fā)明的藥物組合物可以是例如單位劑型，例如是安瓿、小瓶、栓劑、錠 劑、片劑或膠嚢劑形式。
本發(fā)明的藥物組合物以本身已知的方法制備，例如通過常規(guī)的溶解、 凍干、混合、制豐立或配制處理。
優(yōu)選應用活性成分的溶液和懸浮液，并且特別是等滲水溶液或懸浮液， 在應用之前制備這些溶液或懸浮液是可能的，例如在凍干組合物的情況中， 其包含活性成分，單獨或與載體、例如甘露醇一起。藥物組合物可以是無 菌的和/或可以包含賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑和/或乳化劑、增 溶劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑，并且以本身已知的方法制備，例 如通過常規(guī)的溶解或凍干方法。所述的溶液或懸浮液可以包含增加粘度的 物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮 或明膠。
在油中的懸浮液包含作為油組分的常規(guī)用于注射目的的植物油、合成 油或半合成油。同樣可以特別提及的是液體脂肪酸酯，其包含作為酸組分 的具有8至22、特別是12至22個碳原子的長鏈脂肪酸，例如月桂酸、十 三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕櫚酸、十七酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸， 或相應不飽和酸，例如油酸、反油酸、芥酸、順蕪酸或亞油酸，如果需要， 加入抗氧化劑，例如維生素E、 |3-胡蘿卜素或3，5-二-叔丁基-4-羥基甲苯。 那些脂肪酸酯的醇組分具有最多6個碳原子，并且是單-或多-羥基，例如 一-、二-或三-羥基醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇或者它們的異 構體，但是特別是二元醇和甘油。因此，脂肪酸酯的以下實例被提及油 酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、"LabrafilM2375"(聚氧乙烯 甘油三油酸酯，Gattefoss6， Paris)、 "Miglyol 812"(具有C8至C12鏈長 的飽和脂肪酸的三甘油酯，HiilsAG， Germany),但是特別是植物油，例 如棉籽油、杏仁油、歉脫油、蓖麻油、a油、大豆油和花生油。
注射或輸注組合物以常規(guī)方法在無菌條件下制備；相同的條件還用于 將組合物引入安瓿或小瓶并且密封容器。
用于口服施用的藥物組合物可以通過以下方法獲得將活性成分與固體載體混合，如果需要，將產(chǎn)生的混合物制粒，如果希望或必需，在加入 適合的賦形劑后，將混合物制成片劑、錠劑片芯或膠囊劑。將它們裝入塑 料載體中使得活性成分得以分歉或以計算量釋放出來，這也是可能的。
適合的載體特別是填充劑，例如糖類，例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山 梨醇，纖維素制劑和/或磷酸釣，例如磷酸三釣或磷酸氫4丐，以及粘合劑， 例如應用例如玉米、小麥、大米或土豆淀粉的淀粉糊，明膠、黃蓍膠、甲 基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，和 /或，如果需要，崩解劑，例如以上提及的淀粉和/或羧曱基淀粉、交聯(lián)聚乙 烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。賦形劑特別是流動調(diào) 節(jié)劑和潤滑劑，例如硅酸、滑石粉、硬脂酸或其鹽，例如硬脂酸鎂或釣， 和/或聚乙二醇。將錠劑片芯用適合的、任選腸包衣，特別是應用濃縮的糖 溶液，其可以包含阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二 氧化鈦，或在適合的有機溶劑中的包衣溶液，或，用于制備腸包衣、適合 的纖維素制劑溶液，例如乙基纖維素鄰苯二甲酸酯或羥丙基曱基纖維素鄰
苯二曱酸酯。膠嚢劑是由明膠制成的干燥填充的膠嚢劑和由明膠和增塑劑 (例如甘油或山梨醇)制成的軟密封膠嚢劑。干燥填充的膠嚢劑可以包含顆
粒形式的活性成分，例如與以下物質(zhì)一起填充劑(例如乳糖)、粘合劑(例 如淀粉)和/或助流劑(例如滑石粉或硬脂酸鎂)，并且如果需要，與穩(wěn)定劑一 起。在軟膠嚢劑中，優(yōu)選將活性成分溶于或懸浮于適合的油性賦形劑、例 如脂肪油、石蠟油或液體聚乙二醇中，也可能加入穩(wěn)定劑和/或抗菌劑?？?以將染料或色素加入至片劑或錠劑包衣或膠嚢殼中，例如用于鑒別目的或 用于說明活性成分的不同劑量。
式I化合物還可以用于有利地與其它生物學活性劑，優(yōu)選與其它抗增 殖劑組合。此類抗增殖劑包括但不限于芳香酶抑制劑；抗雌激素劑；拓樸 異構酶I抑制劑；拓樸異構酶II抑制劑；微管活性劑；烷化劑；組蛋白脫 乙?；敢种苿?；誘導細胞分化進程的化合物；環(huán)加氧酶抑制劑；MMP 抑制劑；mTOR抑制劑；抗腫瘤抗代謝劑；鉑化合物；靶向/降低蛋白或脂 質(zhì)激酶活性的化合物和進一步的抗血管發(fā)生的化合物；靶向、降低或抑制 蛋白或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物；促性激素釋放素激動劑；抗雄激素劑；曱硫氨酸氨基肽酶抑制劑；二膦酸；生物響應改性劑；抗增殖抗體；類肝 素酶抑制劑；Ras致癌亞型抑制劑；端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑、蛋白齊沐抑 制劑；在治療惡性血液病中所用的藥物；靶向、降低或抑制Flt-3活性的化 合物；Hsp90抑制劑；和替莫唑胺(TEMODAL⑧)。
本文所用的術語"芳香酶抑制劑"涉及抑制雌激素產(chǎn)生的化合物，即 分別將底物雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇。該術語包括但不限于甾 體類，特別是阿他美坦、依西美坦和福美坦，并且特別是非甾體類，特別 是氨魯米特、羅谷亞胺(roglethimide)、吡魯米特、曲洛司坦、睪內(nèi)酯、酮 康唑、伏氯喳、法倔唑、阿那曲唑和來曲唑。依西美坦可以例如以其上市 的形式施用，例如商標為AROMASIN。福美坦可以例如以其上市的形式 施用，例如商標為LENTARON。法倔唑可以例如以其上市的形式施用， 例如商標為AFEMA。阿那曲唑可以例如以其上市的形式施用，例如商標 為ARIMIDEX。來曲唑可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 FEMARA或FEMAR。氨魯米特可以例如以其上市的形式施用，例如商標 為ORIMETEN。包含化療劑(其是芳香酶抑制劑)的本發(fā)明組合特別用于治 療激素受體陽性腫瘤，例如乳腺腫瘤。
本文所用的術語"抗雌激素劑"涉及在雌激素受體水平拮抗雌激素作 用的化合物。該術語包括但不限于他莫昔芬、氟維司群、雷洛昔芬和鹽酸 雷洛昔芬。他莫昔芬可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 NOLVADEX。鹽酸雷洛昔芬可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 EVISTA。氟維司群可以如US-4，659，516中公開的那樣配制或其可以例如 以其上市的形式施用，例如商標為FASLODEX。包含化療劑(其是抗雌激 素劑)的本發(fā)明組合特別用于治療雌激素受體陽性腫瘤，例如乳腺腫瘤。
本文所用的術語"抗雄激素劑"涉及能夠抑制雄激素的生物學作用的 任何物質(zhì)，并且包括但不限于比卡魯胺(CASODEX)，其可以例如如 US-4，636，505中公開的那樣配制。
本文所用的術語"促性激素釋放素激動劑"包括但不限于阿巴瑞克、 戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林是在US-4，100，274中公開的，并且可 以例如以其上市的形式施用，例如商標為ZOLADEX。阿巴瑞克可以例如如US-5，843，901中7iHf的那樣配制。
本文所用的術語"拓樸異構酶I抑制劑"包括但不限于托泊替康、吉 馬替康(gimatecan)、伊立替康、喜樹堿及其類似物，9-硝基喜樹堿和大分 子喜樹堿結合物PNU-166148(WO-99/17804中的化合物Al)。伊立替康可 以例如以其上市的形式施用，例如商標為CAMPTOSAR。托泊替康可以 例如以其上市的形式施用，例如商標為HYCAMTIN。
本文所用的術語"拓樸異構酶II抑制劑"包括但不限于蒽環(huán)類，例如 多柔比星，例如包括脂質(zhì)體形式，例如CAELYX、柔紅霉素、表柔比星、 伊達比星和奈莫柔比星，蒽醌類米托蒽醌和洛索蒽醌，以及鬼臼毒素類依 托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 ETOPOPHOS。替尼泊苷可以例如以其上市的形式施用，例如商標為VM 26-BRISTOL。多柔比星可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN。表柔比星可以例如以其上市的形式施 用，例如商標為FARMORUBICIN。伊達比星可以例如以其上市的形式施 用，例如商標為ZAVEDOS。米托蒽醌可以例如以其上市的形式施用，例 如商標為NOVANTRON。
術語"微管活性劑"涉及微管穩(wěn)定劑、微管去穩(wěn)定劑和微管聚合抑制 劑，包括但不限于紫杉烷類，例如紫杉酚和多西他賽，長春花生物堿類， 例如長春喊，特別是硫酸長春喊，長春新堿，特別是硫酸長春新堿，以及 長春瑞濱、discodermolides、秋水仙堿和埃博霉素(epothilones)及其衍生物， 例如埃博霉素B或其衍生物。紫杉醇可以例如以其上市的形式施用，例如 商標為TAXOL。多西他賽可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 TAXOTERE。石危酸長春堿可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 VINBLASTINR.P.。硫酸長春新堿可以例如以其上市的形式施用，例如商 標為FARMISTIN。 Discodermolide可以例如如US-5，010，099中公開的那 樣獲得。還包括埃博霉素衍生物，其是在WO-98/1012l、 US-6，194，181、 WO-98/25929 、 WO畫98/08849 、 WO-99/43653 、 WO-98/22461 和 WO-00/31247中/>開的。特別優(yōu)選埃博霉素A和/或B。
本文所用的術語"烷化劑"包括但不限于環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美
32法侖或亞硝基脲(BCNU或Gliadel)。環(huán)磷酰胺可以例如以其上市的形式施 用，例如商標為CYCLOSTIN。異環(huán)磷酰胺可以例如以其上市的形式施用， 例如商標為HOLOXAN。
術語"組蛋白脫乙?；敢种苿?或"HDAC抑制劑"涉及抑制組蛋 白脫乙酰基酶并且具有抗增殖活性的化合物。這些化合物包括 WO-02/22577中公開的化合物，特別是N陽羥基-3畫[4-[[(2-羥基乙基)[2-(lH國 吲味-3-基) 乙基]-M曱基苯基-2E-2-丙烯酰胺、N-羥基-3-[4-[[2-(2-甲基 -11^引味-3-基)-乙基-#^甲基1苯基1-2￡-2-丙烯酰胺及其可藥用鹽。其進 一步特別包括辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)。
術語"抗腫瘤抗代謝劑"包括但不限于5-H泉嘧啶(5-FU);卡培他濱； 吉西他濱；DNA脫甲基化基，例如5-氮雜胞苷和地西他濱；甲氨蝶呤；依 達曲沙；以及葉酸拮抗劑，例如培美曲塞。卡培他濱可以例如以其上市的 形式施用，例如商標為XELODA。吉西他濱可以例如以其上市的形式施用， 例如商標為GEMZAR。還包括單克隆抗體曲妥珠單抗，其可以例如以其 上市的形式施用，例如商標為HERCEPTIN。
本文所用的術語"鉑化合物，，包括但不限于卡鉑、順鉑(cisplatin)、順 鉤(cisplatinum)和奧沙利鉑。卡鉑可以例如以其上市的形式施用，例如商 標為CARBOPLAT。奧沙利鉑可以例如以其上市的形式施用，例如商標為 ELOXATIN。
本文所用的術語"乾向/降低蛋白或脂質(zhì)激酶活性的化合物和進一步的 抗血管發(fā)生的化合物"包括但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或絲氨酸和/或蘇 氨酸激酶抑制劑或脂質(zhì)激酶抑制劑，例如
a) 耙向、降低或抑制血小板衍生生長因子受體(PDGFR)活性的化合 物，例如把向、降低或抑制PDGFR活性的化合物，特別是抑制PDGF受 體的化合物，例如N-苯基-2-嘧咬-胺衍生物，例如伊馬替尼、SU101、 SU6668 和GFB-111;
b) 耙向、降低或抑制成纖維細胞生長因子受體(FGFR)活性的化合物；
c) 耙向、降低或抑制胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR)活性的化合物， 特別是抑制IGF-IR的化合物，例如WO-02/092599中公開的那些化合物；d) 靶向、降低或抑制Trk受體酪氨酸激酶家族活性的化合物；
e) 靶向、降低或抑制Axl受體酪氨酸激酶家族活性的化合物；
f) 靶向、降低或抑制c-Met受體活性的化合物；
g) 靶向、降低或抑制c-Kit受體酪氨酸激酶(PDGFR家族的部分)活性 的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Kit受體酪氨酸激酶家族活性的化合 物，特別是抑制c-Kit受體的化合物，例如伊馬替尼；
h) 靶向、降低或抑制c-Abl家族成員和它們的基因融合產(chǎn)物(例如 BCR-Abl激酶)活性的化合物，例如乾向、降低或抑制c-Abl家族成員和它 們的基因融合產(chǎn)物活性的化合物，例如N-苯基-2-嘧淀-胺衍生物，例如伊 馬替尼、PD180970、 AG957、 NSC 680410或ParkeDavis的PD173955;
i) 靶向、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和絲氨^/蘇氨酸激酶的Raf家 族成員、MEK、 SRC、 JAK、 FAK、 PDK、 Ras/MAPK和PI(3)激酶家族 或PI(3)-激酶-相關激酶家族成員和/或細胞周期蛋白依賴性激酶家族(CDK) 成員活性的化合物，并且特別是US-5，093，330中公開的那些星孢素衍生物， 例如米哚妥林；進一步的化合物的實例包括例如UCN-Ol、沙芬戈、BAY 43-9006、莒蘚抑素l、派立福辛、伊莫福新、RO 318220和RO 320432、 GO 6976 、 Isis 3521 、 LY333531/LY379196 、異會啉化合物(例如 WO-00/09495中7^開的那些)、FTIs、 PD184352或QAN697(P13K抑制劑)；
j)耙向、降低或抑制蛋白酪氨酸激酶活性的化合物，例如甲磺酸伊馬 替尼(GLIVEC/GLEEVEC)或酪氨酸磷酸化抑制劑。酪氨酸磷酸化抑制劑 優(yōu)選是低分子量(Mr〈1500)的化合物或其可藥用鹽，特別是選自以下的化 合物亞節(jié)基丙二腈(benzylidenemalonitrile)類或S-芳基苯丙二腈 (S畫arylbenzenemalonirile)或雙底物奮林類化合物，更特別是選自以下的任 ^H匕合物Tyrphostin A23/RG-50810、 AG 99、 Tyrphostin AG 213、 Tyrphostin AG 1748、 Tyrphostin AG 490、 Tyrphostin B44、 Tyrphostin B44(+)對映異構體、Tyrphostin AG 555、 AG 494、 Tyrphostin AG 556、 AG957和adaphostin(4-U(2，5-二羥基苯基)甲基]氨基)-苯甲酸金剛烷酯， NSC 680410， adaphostin);以及
k)靶向、降低或抑制受體酪氨酸激酶的表皮生長因子家族(同-或異二
34聚體的EGFR、 ErbB2、 ErbB3、 ErbB4)活性的化合物，例如耙向、降低或抑制表皮生長因子受體家族活性的化合物特別是抑制EGF受體酪氨酸激酶家族成員(例如EGF受體、ErbB2、 ErbB3和ErbB4)或結合EGF或EGF相關配體的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，并且特別是WO-97/02266(例如實施例39的化合物)中或EP-0 564 409、 WO-99/03854、 EP-0 520 722、 EP陽O566 226、 EP-0 787 722、 EP畫O 837 063、 US畫5，747，498、 WO-98/10767、WO-97/30034、 WO-97/49688、 WO-97/38983并且特別是WO-96/30347(例如稱為CP 358774的化合物)、WO-96/33980(例如4匕合物ZD 1839)和WO-95/03283(例如化合物ZM105180)中通常并且特別地公開的那些化合物、蛋白質(zhì)或單克隆抗體；例如曲妥珠單抗(例如HerpetinR)、西妥昔單抗、易瑞沙、厄洛替尼(TarcevaTM)、 CI-1033、 EKB-569、 GW-2016、 El.l、E2.4、 E2.5、 E6.2、 E6.4、 E2.ll、 E6.3或E7.6.3以及WO-03/013541中公開的7H-吡咯并-[2，3-d嘧咬衍生物。
進一步的抗血管發(fā)生的化合物包括具有另外機制的化合物，對于它們的活性，例如與蛋白或脂質(zhì)激酶抑制無關，例如沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。
靶向、降低或抑制蛋白或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物是例如磷酸酶1、磷酸酶2A、 PTEN或CDC25的抑制劑，例如岡田酸或其矛汴生物。
誘導細胞分化進程的化合物是例如維生素A酸、a-、 y-或5-生育酚或a-、 Y-或5-生育三埽酚(tocotrieno1)。
本文所用的術語"環(huán)加氧酶抑制劑"包括但不限于例如Cox-2抑制劑、5-烷基取代的2-芳基M苯基乙酸和衍生物，例如塞來昔布(CELEBREX)、羅非昔布(VIOXX)、依托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸，例如5-甲基-2-(2，-氯-6，-氟苯胺基)苯基乙酸，蘆米考昔。
術語"mTOR抑制劑，，涉及抑制雷帕霉素的哺乳動物靶標(mTOR)并且具有抗增殖活性的化合物，例如西羅莫司(Rapamune⑤)、依維莫司(CerticanTM)、 CCI-779和ABT578。
本文所用的術語"二膦酸，，包括但不限于依替膦酸(etridonicacid)、氯膦酸、替魯膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑來膦酸。
35"依替膦酸"可以例如以其上市的形式施用，例如商標為DIDRONEL。
"氯膦酸，，可以例如以其上市的形式施用，例如商標為BONEFOS。"替魯膦酸，，可以例如以其上市的形式施用，例如商標為SKELID。"帕米膦酸"可以例如以其上市的形式施用，例如商標為AREDIATM。"阿侖膦酸，，可以例如以其上市的形式施用，例如商標為FOSAMAX。"伊班膦酸"可以例如以其上市的形式施用，例如商標為BONDRANAT。"利塞膦酸"可以例如以其上市的形式施用，例如商標為ACTONEL。"唑來膦酸"可以例如以其上市的形式施用，例如商標為ZOMETA。
本文所用的術語"類肝素酶抑制劑"是指靶向、降低或抑制」琉酸肝素降解的化合物。該術語包括但不限于PI-88。
本文所用的術語"生物響應改性劑"是指^^巴因子或干擾素，例如干擾素Y。
本文所用的術i吾"Ras致癌亞型抑制劑"，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，是指耙向、降低或抑制Ras致癌活性的化合物，例如"法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，，，例如L畫744832、 DK8G557或R115777(Zarnestra)。
本文所用的術語"端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑，，是指靶向、降低或抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的化合物，特別是抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶受體的化合物，例如telomestatin。
本文所用的術語"曱石泉氨酸氨基肽酶抑制劑"是指靶向、降低或抑制甲石克氨酸氨基肽酶活性的化合物，例如bengamide或其衍生物。
本文所用的術語"蛋白酶體抑制劑，，是指靶向、降低或抑制蛋白SI^活性的4匕合物，例如PS-341或MLN341。
本文所用的術語"基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑"或("MMP抑制劑")包括但不限于膠原素擬肽(peptidomimetic)和非素擬肽抑制劑、四環(huán)素衍生物，例如異羥肟酸鹽素擬肽抑制劑巴馬司他及其口服生物可利用的類似物，馬立馬司他(BB-2516)、普啉司他(AG3340) 、 metastat(NSC 683551)、BMS-279251、 BAY 12 9566、 TAA211、 MMI270B或AAJ996。
本文所用的術語"在治療惡性血液病中所用的藥物"包括但不限于FMS樣酪氨酸激酶抑制劑，例如靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；干擾素；l-b-D-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)和bisulfan;以及ALK抑制劑，例如靶向、降低或抑制退行發(fā)育淋巴瘤激酶的化合物。
"靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物"特別是抑制Flt-3的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，例如PKC412、米咪妥林、星孢素衍生物、SU11248和MLN518。
本文所用的術語"HSP90抑制劑"包括但不限于靶向、降低或抑制HSP90的內(nèi)腺苷三磷酸酶活性的化合物；通過泛素蛋白酶體途徑降解、耙向、降低或抑制HSP患者蛋白質(zhì)的化合物。粑向、降低或抑制HSP90的內(nèi)腺苷三磷酸酶活性的化合物特別是抑制HSP90的腺苷三磷酸酶活性的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，例如17-烯丙基氨基，17-脫甲氧基格爾德霉素(17AAG)(格爾德霉素衍生物)；其它格爾德霉素相關化合物；根赤殼菌素和HDAC抑制劑。
本文所用的術語"抗增殖抗體，，包括但不限于曲妥珠單抗(HerceptinTM)、 rastuzumab-DMl 、貝伐珠單抗(AvastinTM)、利妥昔單抗(Rituxan⑧)、PRO64553(抗-CD40)和2C4抗體。"抗體"表示例如完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少2個完整抗體形成的多特異性抗體以及抗體片段，只要它們顯示預期的生物學活性。
對于治療急性粒細胞白血病(AML)，式I化合物可以與標準白血病療法組合應用，特別是與用于治療AML的療法組合應用。特別的是，式I化合物可以與例如法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和/或用于治療AML的其它藥物(例如柔紅霉素、多柔比星、Ara-C、 VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊達比星、碳鉑和PKC412)組合施用。
通過代號、通用或商品名稱鑒定的活性劑的結構可以從現(xiàn)行版本的標準匯編"The Merck Index(默克索引)，，或從數(shù)據(jù)庫例如PatentsInternational(例如IMS World Publications)中獲得。
上述化合物(其可以與式I化合物組合應用)可以如本領域描述的那樣(例如以上引用的文獻)制備和施用。
式I化合物還可以有利地與已知的治療方法、例如施用激素或特別是輻射組合應用。式I化合物可以特別用作放射增敏劑，特別是用于治療對放射療法不敏感的腫瘤。
對于"組合，，，其表示或是在一個劑量單位形式中的固定組合，或是用于組合施用的部分的藥盒，其中式I化合物和組合伴倡可以是在相同時間單獨施用或者在時間間隔內(nèi)分開施用，其特別使組合伴侶顯示聯(lián)合、例如協(xié)同作用，或其任何組合。
以下實施例i兌明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。實施例
溫度以攝氏度測量。除非另外說明，反應在室溫(RT)下進行。
TLC中的Rf值表示每種物質(zhì)遷移的距離與洗脫液前沿遷移的距離的比值。TLC的Rf值是在5x10 cm的TLC板(珪膠F2S4， Merck, Darmstadt,Germany)上測量的；實施例中的溶劑系統(tǒng)表示如下
*10%甲醇/90%二氯甲烷
**5%甲醇/95%二氯甲烷
如果沒有另外說明，分析HPLC條件如下
色謙柱Column Engineering, Inc.， Matrix, 3 fim C18 150x4.6 mm(Lot#205)，通過215和254nm處的紫外吸收檢測。柱溫是35。C并且保留時間(tj0以分鐘給出。流速lmL/分鐘。
梯度水(0.1。ATFA)/乙腈(0.1。/oTFA)-98/2，達1分鐘，在10分鐘內(nèi)至100%乙腈(0.:T/oTFA)。在100%保持2分鐘(總運行時間13分鐘)。
縮略語
HPLC高效液相色譜法
IsoluteIsolute HM畫N by International Solvent Technology
min分鐘
mL毫升
MS-ES電噴霧質(zhì)i昝法
RfTLC的前沿比
RT室溫
TFA三氟乙酸
38TLC 薄層色鐠法
tR 保留時間 uv 紫夕卜
原料
合成苯胺結構單元的通用方法(用N-(3-絲-4-甲基-苯基)-3-三氟曱基-
甲基-苯甲?；鵐)-苯基l-酰胺
將5誦^J^l-(4歸甲氧基-苯基)-lH陽吡唑-4-甲酸(100 mg， 0.43 mmol)、 TPTU(140 mg， 0.47 mmol)和DIEA(184 mL， 1.07 mmol)在室溫下攪拌直 至完全形成中間體活化的酯。然后，加入N-(3-M-4-甲基-苯基)^三氟曱 基-苯甲酰胺(126 mg， 0.43 mmol)，并且將混合物加熱至90。C達3小時， 通過加入水猝滅，并且應用乙酸乙酯萃取。將產(chǎn)物通過自動柱色譜法純化,
苯曱酰胺的結構式和離析物來說明)
o
o
0。N
NH，
^(3-氨基-4-曱基-苯基)-3-三氟甲基-苯曱酰胺
(A)
(B)
(C)
左上表示的化合物N-(3-#J^-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺是通 過將相應的硝基化合物(]\-(4-甲基-3-硝基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺)(A) 與Raney-Nickel在甲醇中、在室溫下氫化而獲得的。中間體(A)是通過將 4誦曱基-3-硝基-苯基胺(B)與3-三氟曱基-苯曱酰氯(C)在二氯甲烷中、在室溫 下應用三乙胺反應而獲得的。中間體(A)獲得很好的產(chǎn)率。類似的并且不同 的苯胺已經(jīng)描述過(例如CAS no. 30069-31-9)。對于偶聯(lián)，優(yōu)選應用相應的 酰氯。
反向的3-氨基-苯甲酰胺衍生物3-l^-4-甲基-N-(3-三氟甲基-苯基)-苯 甲酰胺和3-#J^-N-(4-甲氧基-3-三氟曱基-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺是根據(jù)類 似的方法，應用相應的可商購獲得的原料合成的。
實施例1: 5-絲-W4-甲猛-苯基)-111-吡唑-4-曱酸2-曱基-5-(3-三氟
NH

NH
39并且在高真空泵下干燥，產(chǎn)生標題化合物，為白色固體。HPLC: tR= 10.57 分鐘；MS-ES: (M+H)+ = 510; TLC*: Rf=0.62。 原料制備如下
步驟1.1: 5-#J^-l-(4-甲氧基-苯基)-lH-吡唑-4-甲酸 將5-^J^-l畫(4-甲氧基畫苯基)-lH-吡唑國4-甲酰胺(2.0 g, 8.6 mmol)在30 mL 8 M氬氧化鈉溶液和20 mL乙醇中加熱至回流達18小時。應用6 M HC1溶液將反應酸化至pH 6，并且將形成的沉淀通過過濾分離并且在真空 泵下干燥，得到標題化合物。HPLC: tR = 7.29分鐘；MS-ES: (M+H)+ =234; TLC*: Rf = 0.33。
步驟1.2: 5-^-l-(4-曱IL^-苯基)-lH-吡唑-4-甲酰胺 將5-tJ^-l-(4誦甲氧基-苯基)-lH-吡唑-4-腈(18.3 g， 69.8 mmol)緩十t^ 入至93mL濃硫酸(1680mmol)中，將溫度保持在10和15。C之間。完全加 入之后，將反應混合物攪拌l小時。然后，將混合物傾倒在水/水上，并且 將pH調(diào)至pH8。將形成的沉淀通過過濾分離并且在高真空泵下干燥，得 到標題化合物。HPLC: ^ = 6.92分鐘；MS畫ES: (M+H)+=233; TLC**: Rf=0.27。
步驟1.3: 5-tJ^l-(4-曱氧基-苯基)-lH-吡唑-4-腈
在4-甲氧基-苯基肼鹽酸鹽(20 g， 89.5 mmol)(Fluka)的乙醇懸浮液中滴 加入三乙胺(13.1 mL， 94 mmol)。在該溶液中分小批加入乙氧基亞甲基丙 二腈(ll g， 89.5 mmol)(Aldrich),因為該反應是放熱的。將產(chǎn)物沉淀通過 過濾分離，用醚洗滌并且在高真空泵下干燥，得到標題化合物。HPLC: tR-6.07分4中；MS-ES: (M+H)+=215; TLC**: Rf=0.52。
實施例2: 5-絲-l-(4-曱l^-苯基)-lH-吡唑-4-曱酸2-曱基-5-(3-三氟 甲基-苯基M甲?；?-苯基卜酰胺
應用實施例1中描述的相同方法，除了應用3-氨基-4-甲基-N-(3-三氟 曱基-苯基)-苯甲酰胺替代N-(3-絲-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。 產(chǎn)物通過自動柱色譜法分離并且在高真空泵下干燥，得到標題化合物，為 白色固體。HPLC: tR =10.65分鐘；MS-ES: (M+H)+=510; TLC*: Rf = 0.63。
實施例3: 5-氨基-l-甲基-lH-吡唑-4-甲酸『2-曱基-5-(3-三氟曱基-苯甲?；被?-苯基l-酰胺
將5-^^-l-甲基-lH-吡唑-4-甲酸(80mg， 0.57 mmol)、 EDC-HCl(lll mg， 0.57mmol; Fluka)和HOBt(77 mg， 0.57 mmol; Fluka)在2 mL干燥 的DMF中攪拌。1小時后，沒有原料剩余，并且加入N-(3-^i^4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(167mg， 0.57mmo1)。將反應在90。C下攪拌16 小時，通過加入水猝滅，并且應用乙酸乙酯萃取。產(chǎn)物通過自動柱色鐠法 純化，并且在高真空泵下干燥，得到標題化合物，為白色固體。HPLC: ^ = 9.22分鐘；MS-ES+: (M+H)+ = 418; TLC*: Rf = 0.38。
原料制備如下
歩驟3.1: 5-^J^國l-曱基-lH-吡唑陽4國甲酸
將5-^J^-l-甲基-lH-吡唑-4-甲酸乙酯(16.4 g， 97 mmol)在97 mL 2 M 氫氧化鈉溶液和100 mL乙醇中加熱至回流。完全皂化后，將混合物用6M HCl溶液酸化至pH5，并且將形成的沉淀通過過濾分離。將產(chǎn)物在高真空 泵下干燥并且將標題化合物分離，為白色固體。HPLC: ^ = 4.65分鐘； MS畫ES+: (M+H)+ = 142; TLC*: Rf=0.24。
歩驟3.2: 5-氮基-l-甲基-lH-吡唑-4-曱酸乙酯
將甲基肼(7.6mL， 0.14 mol; Aldrich)用25 mL乙醇稀釋。加入三乙 胺(20 mL， 0.14 mol)并且將混合物冷卻至0°C。分小批加入2-^&-3-乙氧 基-丙烯酸乙酯(24.02g， 0.14 mol; Fluka)，并且將混合物在室溫下攪拌18 小時。將乙醇減壓除去，并且將獲得的油狀物結晶。將產(chǎn)物懸浮于乙醚中 并且通過過濾分離。獲得標題化合物，為淡黃色固體。HPLC: tR = 6.87 分4中；MS-ES+: (M+H)+ = 170。
實施例4: 5-氨基-l-甲基-lH-吡唑-4-曱酸〖2-曱基-5-(3-三氟曱基-苯基
絲甲?；鵙苯基1國酰胺
應用實施例3中描述的相同方法，除了應用3-氨基-4誦甲基-N-(3-三氟 甲基-苯基)-苯曱酰胺替代！^-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟曱基-苯甲酰胺。 將產(chǎn)物通過自動柱色譜法分離，并且在高真空泵下干燥，得到標題化合物， 為白色固體。HPLC: tR-9.54分4中；MS畫ES: (M+H)+ = 418; TLC*: Rf =0.33。實施例5: 5-t^-l-甲基-lH-吡唑-4-曱酸〖5-(4-曱氧基-3-三氟曱基-苯 曱?；z)-2-曱基-苯基l-酰胺
應用實施例3中描述的相同方法，除了應用N-(3-i^-4-曱基-苯基)-4-甲氧基-3-三氟甲基-苯甲酰胺替代]\-(3-氨基-4-曱基-苯基)-3-三氟甲基-苯 甲酰胺。將產(chǎn)物通過自動柱色語法分離，并且在高真空泵下干燥，得到標 題化合物，為白色固體。HPLC: tR-9.21分鐘；MS-ES: (M+H)+ = 448; TIX*: Rf = 0.34。
實施例6: 5-氨基-l-曱基-lH-吡唑-4-甲酸〖5-"-氟-3-三氟甲基-苯甲酰 基#^)-2-曱基-苯基l-酰胺
應用實施例3中描述的相同方法，除了應用N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-4-氟-3-三氟甲基-苯曱酰胺替代]\-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟曱基-苯甲酰 胺。將產(chǎn)物通過自動柱色譜法分離，并且在高真空泵下干燥，得到標題化 合物，為白色固體。HPLC: tR-9.45分鐘；MS-ES: (M+H)+ = 436; TLC*: Rf = 0.30。
實施例7: 5-氨基-l-曱基-lH-吡唑-4-甲酸5-(4-曱氧基-3-三氟曱基-苯 基M甲酰基)-2-甲基-苯基卜酰胺
應用實施例3中描述的相同方法，除了應用3-M-N-(4-甲l^-3-三 氟曱基-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺替代N-(3-#J^-4-甲基-苯基)各三氟曱基-苯 曱酰胺。將產(chǎn)物通過自動柱色譜法分離，并且在高真空泵下干燥，得到標 題化合物，為白色固體。HPLC: tR-9,30分鐘；MS-ES: (M+H)+ = 448; TLC*: Rf=0.32。
實施例8:軟膠嚢劑
如下制備5000粒軟明膠膠嚢劑，每粒包含作為活性成分的0.05 g式I 化合物
組分
活性成分 250 g
Laui"oglycol 2升
制備方法將粉末狀的活性成分懸浮于LauroglykoP(丙二醇月桂酸酯， Gattefoss6 S.A.， Saint Priest, France)中，并且在濕的粉磨機中研磨，以產(chǎn)
42生約l至3pm的粒徑。然后，應用膠嚢填充機將每份0.419g的混合物裝 入軟明MJ^嚢中。 實施例9:片劑
按照標準方法制備片劑，每片包含作為活性成分的100 mg式I化合物 組分
活性成分 100 mg
結晶乳糖 240 mg
Avicel 80 mg
PVPPXL 20 mg
Aerosil 2 mg
硬脂酸鎂 5 mg
447 mg
制備將活性成分與栽體物質(zhì)混合，并且通過壓片機(KorschEKO，沖 才莫直徑10 mm)壓制。
Avicel⑧是微晶纖維素(FMC， Philadelphia, USA)。 PVPPXL是交聯(lián)聚 乙烯聚吡咯烷酮(BASF， Germany) 。 Aerosil 是二氧化硅(Degussa， Germany)。
實施例10: EphB4激酶活性的抑制
應用上述的試驗體系，試驗實施例1至7的化合物抑制EphB4激酶的 能力。發(fā)現(xiàn)特別是在概述中給出的范圍內(nèi)的IC5o值Oimol/L)。
4權利要求
1. 游離形式或鹽形式的下式化合物其中R1是C1-7烷基或者被C1-7烷氧基或C1-7烷基之一取代的苯基；R2是-NH-CO-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自鹵素、C1-7烷氧基或三氟甲基的取代基取代，或者是-CO-NH-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自鹵素、C1-7烷氧基或三氟甲基的取代基取代；并且R3是C1-7烷基或鹵素。
2. 權利要求1的式I化合物，其中 Rj是d-7烷基或者被d-7烷l^取代的苯基；并且 R3是d-7烷基。
3. 權利要求1或權利要求2的式I化合物，其中 R是-CH3或者被甲氧基取代的苯基；R2是-NH-CO-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自氟、甲氧基或三氟 曱基的取代基取代，或者是-CO-NH-苯基，其中苯基環(huán)被一個或兩個選自甲氧基或三氟甲基的 取代基取代；并且R3是-CH3。
4. 權利要求1至3中任意一項的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合 物，其選自以下化合物，包括5-氨基小(4-甲氧基-苯基)-111-吡唑-4-甲酸2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲 酰基氨基)-苯基]-酰胺，5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-111-吡唑-4-曱酸[2-甲基-5-(3-三氟曱基-苯基 #^甲酰基)-苯基-酰胺，5-氨基-1-曱基-111-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲?；被?- 苯基-酰胺，5-氨基-1-甲基-111-吡唑-4-甲酸2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯基氨基甲酰 基)-苯基-酰胺，5-氨基-1-甲基-111-吡唑-4-甲酸[5-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯甲?；?基)-2陽甲基隱苯基-酰胺，5-氨基-1-甲基-lH-吡唑-4-甲酸[5-(4-氟-3-三氟甲基-苯甲?；被?-2-甲基-苯基卜酰胺和S-氨基-l-甲基-lH-吡唑斗甲酸5-(4-曱氧基-3-三氟甲基-苯基絲甲酰 基)-2-甲基-苯基-酰胺。
5. 藥物組合物，該藥物組合物包含權利要求l中定義的作為活性成分 的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及可藥用載體或稀釋劑。
6. 權利要求l中定義的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物，其用 作藥物。
7. 權利要求l中定義的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物，其用 于治療或預防蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的病癥、疾病或障礙。
8. 權利要求l中定義的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物作為藥 物在治療或預防蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的病癥、疾病或障礙中的用途。
9. 權利要求l中定義的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物在制備 用于治療或預防蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的病癥、疾病或障礙的藥物中的用途。
10. 在需要此類治療或預防的個體中治療或預防蛋白激酶調(diào)節(jié)響應的 病癥、疾病或障礙的方法，該方法包括給此類個體施用治療有效量的權利 要求l中定義的游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物。
11. 組合，該組合包含治療有效量的權利要求1中定義的游離形式或 可藥用鹽形式的式I化合物和第二種藥物，用于同時或依次施用。
12.制備權利要求l中定義的游離形式或鹽形式的式I化合物的方法， 該方法包括以下步驟在游離形式或鹽形式的式(V，)的原料與游離形式或鹽形式的式(VI)的 原料或其活性矛汴生物之間形成酰胺鍵在式(VI)中，R，如式I中定義的，隨后任選將產(chǎn)生的化合物還原、氧化或其它官能化，裂解任選存在的 任何保護基，將可獲得的式I化合物轉(zhuǎn)化為不同的式I化合物，將可獲得 的式I化合物的鹽轉(zhuǎn)化為游離化合物或不同的鹽，將可獲得的式I的游離 化合物轉(zhuǎn)化為其鹽，和/或?qū)⒖色@得的式I化合物的異構體混合物分離為單 個異構體，并且回收如此可獲得的游離形式或鹽形式的式I化合物。在式(V，)中，R2和R3如式I中定義的，
全文摘要
本發(fā)明涉及新的游離形式或鹽形式的式(I)的雜環(huán)化合物，其中所有變量如說明書中所定義的，本發(fā)明還涉及它們的制備、它們作為藥物的用途以及包含它們的藥物。
文檔編號C07D231/38GK101522636SQ200780038325
公開日2009年9月2日 申請日期2007年10月29日 優(yōu)先權日2006年10月30日
發(fā)明者P·因巴赫, P·菲雷, P·霍爾策 申請人:諾瓦提斯公司