專利名稱：與突變麥芽糖結合蛋白融合的靶蛋白的溶解和純化的制作方法
與突變麥芽糖結合蛋白融合的靶蛋白的溶解和純化
背景當需要大量純蛋白時，重組蛋白在生物技術中具有多種用
途。微生物表達系統(tǒng)，如大腸桿菌和酵母通常是第一選擇， 這是由于它們的低成本和高產(chǎn)率。當在大腸桿菌中表達異種蛋白時， 通常碰到蛋白的低水平表達和/或不溶的問題。即使蛋白充分表達并保 持可溶，其必須從細胞提取物的大量其它蛋白中純化。要促進靶蛋白 的表達和純化，通常使用的一種方法是對該蛋白融合親和標記。好的
親和標記具有這樣的性質(zhì)——當融合到靶蛋白的N-末端時，其促進高 水平表達，并提供簡單的一步親和純化，其允許靶蛋白從表達環(huán)境中 被純化。大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白(MBP)通常被用作表達和純 化大腸桿菌中產(chǎn)生的異種蛋白的親和標記。MBP的天然功能是在外膜 孔蛋白結合麥芽糖糊精并在內(nèi)膜將其釋放到MalEFK轉(zhuǎn)運元件 (transport apparatus)。 MBP的C-末端與耙蛋白的N-末端融合允許融 合蛋白在大腸桿菌中表達(

圖1)。 MBP禾BMBP融合體(ftision)可以 通過結合到色譜基質(zhì)而在一步內(nèi)被純化，所述色譜基質(zhì)含有大量葡萄 糖a-l—4-葡萄糖多糖中任意一種，如直鏈淀粉、淀粉或其它麥芽糖糊 精(美國專利5,643,758)。許多在其天然宿主(native host)中可溶的 蛋白當作為重組蛋白表達時不溶解。對于這些蛋白中的許多種來說， 與MBP融合使它們可溶(Kapust & ^Waugh， /Voto'" <Scz'. 8:1668-74 (1999))。 MBP作為親和標記的用途被這樣的事實減弱——取決于 MBP-靶蛋白純化中的蛋白， 一些融合體既不能結合到親和基質(zhì)又不能 結合到其它。此外，非離子去污劑的存在，如Triton X100和Tween 20 會干擾結合，特別對于具有固有較低親和性的MBP-靶蛋白融合體。
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研究人員已經(jīng)使用MBP的結構制備定向突變，以便改變 MBP的結合特性。MBP的X射線晶體結構已經(jīng)由Spurlino等，J Ao/. C/7em. 266:5202-5219 (1991)報道。MBP包含兩個結構域，在多糖結合 的結構域之間具有一個裂(cleft)。包含N-末端的結構域被稱為N結構 域，而包含C-末端的結構域被稱為C結構域。三個環(huán)跨在這兩個結構 域之間，形成鉸鏈區(qū)(hinge)。兩個小組已經(jīng)使用該結構在鉸鏈區(qū)后面 的區(qū)域進行定向突變，提高了 MBP對麥芽糖和麥芽三糖的親和性 (Marvin等，tV"/1"/ S化"c/^m/ 8:795-798 (200)；Telmer &
Shilton， Jowma/o/S/o/. CTzew. 278:34555-34567 (2003))。然而，該方法 具有固有的缺點，因為對MBP的修飾提高了該蛋白表面的疏水性并因 此降低了其溶解性。這通過增大其使融合蛋白不溶的傾向而減小了其 作為親和標記的用途。
概述在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了修飾的MBP融合蛋 白，其由具有突變的MBP氨基酸序列表征，其中所述突變使修飾的 MBP融合蛋白具有至少一種選自下列的特性(i)提高的對麥芽糖糊精 底物的親和力及(ii)當與具有有限溶解性的靶蛋白融合時，提高的溶解 性。在本發(fā)明的又一實施方式中，修飾的MBP具有突變，其位于螺旋 XI和XII之間的鉸鏈區(qū)，或在該蛋白A313的10人的區(qū)域內(nèi)。例如， 突變可以位于C結構域或在S146的10人的區(qū)域內(nèi)——在該蛋白的(3-折疊F的開端。該修飾具體可以是A313V或S146T。在本發(fā)明的又一實施方式中，修飾的MBP可以與靶蛋白融 合形成融合蛋白，并且可以，例如具有比與靶蛋白融合的未修飾MBP
蛋白的溶解度更高的溶解度。在本發(fā)明的一個實施方式中，修飾的MBP可具有選自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列或編碼該蛋白的DNA序列，所 述DNA序列選自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5 。 DNA可以被插入載 體，如pKLACl載體，用于在諸如克魯維酵母屬(《/">n^raw_yc")或 大腸桿菌的宿主細胞中表達。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了一種用于純化蛋白的方法，其包括在諸如克魯維酵母屬或大腸桿菌的宿主細胞中表達包 含上述修飾的MBP中任一種和靶蛋白的融合蛋白。修飾的MBP融合 蛋白被允許結合到諸如多糖的基質(zhì)，所述多糖由麥芽糖糊精示例。融 合蛋白隨后可以在選定的緩沖液中從該基質(zhì)洗脫，以獲得純化蛋白。在本發(fā)明的又一實施方式中，提供了一種用于溶解靶蛋白 的方法，其包括表達融合到靶蛋白的MBP突變體，以至于融合蛋白被 溶解到大于在不存在突變MBP的情況下觀察到的程度，和被溶解到大 于使用非突變MBP觀察到的程度。突變的實例包括A313V突變和/或 S146T突變。
附圖簡述圖1示意性描述通過如下進行靶蛋白的克隆和純化表達 編碼與靶蛋白融合的MBP的DNA，允許該融合蛋白選擇性地結合直 鏈淀粉，在含麥芽糖的緩沖液中洗脫靶蛋白并隨后通過蛋白酶剪切從 純化的融合蛋白中回收靶蛋白。圖2提供了比較野生型MBP與修飾的MBP的序列。圖2A:編碼來自pMAL-c2X的野生型MBP(SEQIDNO:2) 的DNA序列(SEQIDNO:l)。圖2B:編碼MBP突變體A9 (SEQ ID NO:4)的DNA序 列(SEQIDNO:3)。修飾的MBP序列中的變化以粗體標識。圖2C:編碼MBP突變體G8-1 (SEQIDNO:6)的DNA序 列(SEQIDNO:5)。修飾的MBP DNA和氨基酸序列中的變化以粗體 標識。圖3顯示了比較使用野生型MBP (pK01483)或修飾的 MBP (A9或G8-l)的蛋白產(chǎn)率的柱形圖。MBP的產(chǎn)率以mg/500ml
培養(yǎng)物的形式提供。圖4顯示了在SDS-PAGE凝膠上從含有野生型MBP、MBP A313V和S146T修飾的pMAL中純化的MBP-Klenow產(chǎn)物。質(zhì)粒 WT=pIH1062， A313V=pIH1643， S136T=pIH1644。泳道CE^粗提物， FT-流過物(flowthrough)，且E4先脫物。等份的指明部分(indicated fraction)被加樣于每個泳道。從A313V突變MBP中比從野生型MBP獲得了明顯更高的MBP融合蛋白的產(chǎn)率(也參見表l)。圖5:用于表達MBP-CBD融合蛋白的pMB50的序列(SEQ IDN0:7)(參見表2)。圖6: SDS-PAGE凝膠，顯示了融合野生型和修飾的MBP 到DHFR和GAPDH對溶解性的影響。DHFR融合質(zhì)粒WT=pIH1616， A313V=pIH1617， S146T=pIH1618， DM=pIH1646。 GAPDH融合質(zhì)粒 WT=pIH1625， A313V=pIH1626， S146T=pIH1627， DM=pIH1645。泳
道T:總細胞提取物，S-可溶提取物，1=不溶物質(zhì)的重懸液。等份的
指明部分被加樣于每個泳道。與野生型MBPs相比，對兩種突變體來 說可溶與不溶蛋白的比例都更高。圖7提供了 pKLMF2-PMASal的序列(SEQ ID NO:8)。圖8顯示了使用支鏈淀粉樹脂柱，從SDS-PAGE凝膠上融 合蛋白親和純化得到的部分。通過在攜帶MBP(A313V)-PMASal表達 盒的乳酸克魯維酵母(K/M_yvera/77_ycM /ac^ )細胞中表達 MBP(A313V)PMASal產(chǎn)生了提高產(chǎn)率的修飾的MBP融合蛋白。泳道1-NEB寬范圍標記物，Ipswich, MA;泳道2——粗提物加樣；泳道3——柱流過物；泳道4^——柱洗液；泳道5、 6和7，柱緩沖液+麥芽糖的洗脫物。
實施方式詳述
本文使用的術語在下文討論。"野生型"MBP包括通過在pMAL-2質(zhì)粒之一的衍生物中 表達而產(chǎn)生的MBP蛋白，所述質(zhì)粒在多接頭中具有一個終止密碼子， 例如pK01483。"與突變體MBP融合的蛋白的增強的溶解度"是當與融合 到野生型MBP的相同蛋白比較時，溶解蛋白的量的增加。溶解度可以 被表達為可溶蛋白與不溶物質(zhì)通過例如離心被去除之前存在的蛋白總 量的比例。"突變MBP提高的親和性"或"突變MBP融合蛋白"包
8括在確定的一組條件下，與固體底物如麥芽糖糊精結合的蛋白量的 增加。親和純化的效力可以被表示為在特定條件下結合到麥芽糖糊精 并隨后用特定的緩沖液洗脫的蛋白與應用到該柱上的蛋白總量的比 例。本發(fā)明的實施方式提供了 MBP突變體，當與耙蛋白融合 時，其在體內(nèi)表達的過程中提高融合蛋白的溶解度，并在純化過程中 也可以提高融合蛋白的親和力。本實施方式包括突變MBP，當在野生 型MBP顯示部分結合的條件下被施加到多糖培養(yǎng)基如包含麥芽糖糊精 的培養(yǎng)基上時，該突變MBP顯示出與該培養(yǎng)基提高的結合。修飾的 MBPs隨后使用如可溶麥芽糖糊精的溶液從培養(yǎng)基洗脫，當與野生型 MBP相比時，產(chǎn)生至少1.5到IO倍多的蛋白。為了發(fā)現(xiàn)這些改進的MBP突變體，需要克服技術障礙，其 包括開發(fā)能夠處理大量樣品的技術。在超聲處理不實用于大規(guī)模純化 且裂解緩沖液會干擾MBP的親和結合的情況下，這需要改進的用于破 碎宿主細胞以釋放溶解的融合蛋白的方法。發(fā)現(xiàn)通過滴定去污劑和溶 菌酶，識別合適濃度和比例的這些裂解試劑，以有效地破碎宿主細胞 而沒有不良地影響結合親和是可能的。為了篩選帶有期望結合親和性質(zhì)的突變體，96孔微量培養(yǎng) 板被使用，其中每個孔包含用于結合融合蛋白的微量基質(zhì)，并且濾器 除去濾液中的污染物質(zhì)。這使得快速篩選大量樣品成為可能。在實施例中描述了用于獲得和測試修飾的突變MBP蛋白 作為純化蛋白的改進標記的篩選方法。對基質(zhì)具有更高親和力的這些 修飾的MBP解決了與MBP融合蛋白的野生型MBP有關的問題，所述 MBP融合蛋白對基質(zhì)結合較差或結合被非離子去污劑的存在干擾。在實施例中，描述了具有提高的溶解度和對多糖基質(zhì)提高 的結合親和力的期望特性的兩個突變(S146T和A313V)，其使用篩選 步驟分離。S146T突變在MBP的C結構域中(3-折疊F的開端。當不溶 的靶蛋白與含有該突變的MBP融合時，融合蛋白的溶解度被增強。本 文描述的A313V突變位于跨兩個結構域之間的第三鉸鏈區(qū)中，特別地， 位于螺旋XI和XII之間的環(huán)中。該突變增加融合蛋白的溶解度和親和 力。當在大腸桿菌中表達異種蛋白時，該蛋白可能以不溶聚集體
9(aggregate)的形式被部分或全部表達。在特定的實施例中，溶解度 可隨著總溶解度的上限被向上提高1.1或更多。本文引用的所有參考文獻，以及2006年4月14日提交的 美國臨時申請?zhí)?0/792,133被引入作為參考。
實施例
材料限制性內(nèi)切酶，(3-瓊脂糖酶，DNA聚合酶，T4連接酶，熱 敏磷酸酶(Antarctic phosphatase),石蕊(Litmus) 38，包括pMAL-c2X 和pMAL-c2G的pMAL蛋白融合和純化系統(tǒng)，直鏈淀粉樹脂(弁E8021 )， 連接到辣根過氧化物酶的抗MBP單克隆抗體(#E8038)，用戶友好型 克隆試劑盒(USER Friendly Cloning kit),包含載體pKLACl的乳酸克 魯維酵母(AT. /fl"&)蛋白表達試劑盒，宿主菌株TB1、ER1992、ER2502、 ER2984、 NEB-5a禾口 NEB Turbo，以及合成寡核苷酸從New England Biolabs， Inc. (NEB) , Ipswich, MA獲得。帶有濾器底部的Unifilter 800 微滴定微量培養(yǎng)板從英國的Whatman Brentford公司購買。Minelute DNA Extraction禾Q Qiaprep Spin試劑盒從Qiagen， Valencia, CA購買。 MegalO從Dojindo，Gaithersburg,MD購買。雞蛋白溶菌酶、考馬斯亮 藍R (Coomassie brilliant blue R)和酸洗滌玻璃珠(425-600微米)從 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO購買。Sea Plaque GTG低解鏈溫度瓊脂糖 從Cambrex, E. Rutherford, NJ購買。 一次性聚乙烯柱(#732-6008)從 BioRad, Hercules, CA購買。10-20%梯度凝膠從日本東京的Daiichi或 Invitrogen/Novex, Carlsbad, CA購買。CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物 從瑞士的Roche, Basel購買。SimplyBlue Safestain從Invitrogen, Carlsbad, CA購買。人二氫葉酸還原酶(DHFR) cDNA克隆pOTB7-DHFR從 Invitrogen購買(MGC:857)。 GAPDH基因從pJF931獲得(Fox等 L饑537:53-57 (2003))。
技術粘質(zhì)沙雷氏菌(5Wr"c/" w^scewra )核酸酶如 PCT/US05/28739所述獲得。質(zhì)粒DNA的小量制備使用Qiaprep Spin Kit
10制備。隨機PCR誘變?nèi)鏔romant等爿"a(v"ca/5z'oc/^w&o/ 224， 347-353 (1995)中所述進行。PCR使用Vent⑥D(zhuǎn)NA聚合酶進行，除了注明的那 些。DNA片段通過在1% Sea Plaque GTG低解鏈溫度瓊脂糖上電泳被 凝膠純化，切出條帶，并使用Minelute DNA提取試劑盒(Minelute DNA Extraction kit)純化DNA;或在75。C熔化5分鐘，冷卻到37。C，并用 卩-瓊脂糖酶消化1-2小時。DNA測序在Applied Biosystems的(ABI的) 自動DNA測序儀3100ABI型中，使用Big Dye標記的染料終止化學試 劑(ABI, Foster City, CA)進行。SDS-PAGE根據(jù)丙烯酰胺凝膠提供商 的說明進行，并且蛋白通過用考馬斯亮藍R染色觀察，除了另外注明 的。 MBP從pMal-c2X或pMal-c2G或pMal-c2G的衍生物中被 表達。識別扁/￡中突變的堿基編號指的是pMAL-c2X序列中的堿基編 號(圖2A-1、 2A-2、 2B隱1、 2B-2、 2C-1和2C-2(SEQ ID NOS:l-6))。 pMAL-c2G衍生物pSN1578通過下列過程產(chǎn)生用Bsml和BsiWI剪 切質(zhì)粒，用DNA聚合酶Klenow片段加上全部四種dNTPs處理產(chǎn)物， 接著連接而產(chǎn)生ma/五基因中的缺失。位點定向誘變使用Guan等A^wc/e/c爿c/d i^searc/;, 33:6225-6234 (2005)中所述的四引物PCR誘變進行。MBP禾B MBP融 合蛋白如pMAL蛋白融合和純化系統(tǒng)(Protein Fusion and Purification System)的說明所述被純化，除了在一些情況下，細胞使用溶菌酶/去
污劑溶液代替超聲處理裂解。大規(guī)模純化使用從500到lOOOmL培養(yǎng)物制備的粗細胞提 取物進行，并被加樣到含有15ml直鏈淀粉樹脂(NEB#E8021， Ipswich, MA)、直徑2.5cm的柱上。小規(guī)模純化使用由67ml培養(yǎng)物制備的粗提 物進行，并加樣到含lml直鏈淀粉樹脂的一次性聚乙烯柱上。SDS(十 二烷基磺酸鈉)-聚丙烯酰胺凝膠電泳使用10-20%梯度凝膠進行。對于 凝膠條帶的定量，凝膠在玻璃紙層之間干燥并用Microtek III掃描儀一
—Microtek, Carson, CA--掃描，并且光密度測定法使用Image J
(NIH)進行。
實施例I:帶有改進特性的MBP中的突變體的分離純化后提高產(chǎn)率的篩選來自pMAL-c2X的maffi基因的隨機誘變通過易錯PCR使
用以下引物完成
寡核苷酸1: 5' GGAGACAUGAATTCAATGAAAATCGAAGAA (SEQIDNO:9)和
寡核苷酸2: 5' GGGAAAGUAAGCTTAATCCTTCCCTCGATC (SEQ ID NO:IO)。使用用戶友好克隆試劑盒(USER Friendly Cloning Kit)，根 據(jù)制造商的說明，將PCR片段克隆迸線性化的pNEB20SA。轉(zhuǎn)化體在 lmL LB+lmM IPTG和100(ig/ml氨芐青霉素中生長過夜，隨后通過加 入0.3mg/ml溶菌酶和20個單位的粘質(zhì)沙雷氏菌".wa^cese似)核酸 酶進行裂解，溫育10分鐘，隨后加入0.1ml的2MTween20。粗提物被運用到在Unifilter 800微量培養(yǎng)板上的50pL直鏈 淀粉樹脂柱(NEB #E8021， Ipswich, MA)上，并且每個孔用0.7ml的 20mMTris-Cl、 0.2MNaCI、 lmMEDTA、 pH7.4 (柱緩沖液)清洗，隨 后用0.7mL的lOmM磷酸鈉、0.2MNaCl、 lmMEDTA、 pH7.2清洗。 結合到直鏈淀粉樹脂上的蛋白用0.2mL的10mM麥芽糖、10mM磷酸 鈉、0.2M NaCl、 ImM EDTA、pH7.2洗脫。洗脫物被轉(zhuǎn)移到Immulon 2HB 微滴定板(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)并在4。C溫育過夜。 微滴定孔隨后被倒空，用20mMTris-Cl、 150mMNaCl、 pH7.5 (TBST) 清洗兩次，隨后用0.36mlTBST+3。/。牛血清白蛋白在37""C封閉(block) 1小時?？妆挥肨BST清洗兩次，隨后向每個孔中加入0.1ml在 TBST+3。/。牛血清白蛋白中1:2000稀釋的與辣根過氧化物酶連接的抗 MBP單克隆抗體，并且該板在37。C溫育1小時?？妆坏箍眨S后用 TBST清洗兩次。孔用溶于水中的0.01%鄰苯二胺，0.003%過氧化氫顯 色(developed)。檢測反應通過加入0.025mL的4M H2S04停止，并且 孔在490nm用分光光度法(spectrophotometrically)分析。細胞從對應 于與野生型MBP相比顯示出更高結合和洗脫的樣品的裂解物中回收。 這些候選物被生長并重測試，以確認更高的結合和洗脫。隨機誘變后獲得的突變體的表征和分離來自USER的文庫、具有提高的結合和洗脫特性的兩種分 離物被測序(圖2)。 一種分離物，G8-l，被發(fā)現(xiàn)具有單個錯義突變， G1964C，以及一個靜默突變。G1964C突變對應于MBP中的氨基酸變 化S146T。另一種分離物，A9，被發(fā)現(xiàn)具有三個錯義突變，A1583G、 A2419G和C2465T，與一個靜默突變。A1583G、 A2419G和C2465T 突變分別對應于氨基酸變化N19S、 K298E和A313V。
亞克隆進pMal-C2X或pSN1578每種分離物使用以下引物通過PCR擴增 寡核苷酸3:
CGGC (SEQIDNO:ll)和寡核苷酸4:
5' ATATAAGCTTTCACCTTCCCTCGATCCCGAGGT ( SEQ ID NO: 12)。
擴增的DNA被乙醇沉淀，用Ndel和HindIII在NEBuffer4 (NEB, Ipswich，MA)中剪切，并凝膠純化。pSN1578用Ndel和HindlII剪切 并且該載體骨架被凝膠純化。G8-l和A9片段與pSN1578片段混合并 連接，并且連接被用于轉(zhuǎn)化TB1。來自每種轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒制備物被測 序并將G8-l命名為pIH1596，將A9命名為pIH1593。本實驗中的3' 引物在正確的閱讀框中具有終止密碼子，以防止malE翻譯進入pMAL 的/^Zcc片段。因此，這些亞克隆產(chǎn)生修飾的MBP，其在氨基酸序 列...正GR——由多接頭編碼——后結束。含有野生型ma/五基因接著 一個終止密碼子的對照質(zhì)粒通過用Xbal剪切和/acZa之間的多 接頭中的pMAL-c2X而構建。XbaI突出部分使用DNA聚合酶I、大片 段(Klenow)和所有四種dNTP，s填補(fill),隨后質(zhì)粒通過用T4連 接酶處理而重新環(huán)化。這在與wa/五相同的閱讀框中引入了終止密碼子， 并且該衍生物產(chǎn)生了與由G8-l和A9產(chǎn)生的可比的MBP，除了由多接 頭編碼的8個殘基的延伸。該對照質(zhì)粒被命名為pK01483。含有 pK01483、 pIH1596和pIH1593的大腸桿菌TBI在500rnL的LB+0,1%葡萄糖和100|ig/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)物中生長至2xl()S細胞/ml，用 0.3mM IPTG誘導，在37'C生長2小時，隨后收集。細胞被重懸浮在 25ml柱緩沖液(0.2mL的10mM麥芽糖、lOmM磷酸鈉、0.2MNaCl、 lmM EDTApH7.2) +10mM [3-巰基乙醇中，隨后通過超聲處理裂解。 提取物通過在9000xg下離心30分鐘澄清，隨后用柱緩沖液1:4稀釋并 加樣到15ml的直鏈淀粉樹脂柱上。該柱用約125mL柱緩沖液清洗， 并用柱緩沖液+10mM麥芽糖洗脫。MBP的產(chǎn)率在三種菌株之間比較
(圖3)。結果確認了修飾的MBP顯示出提高的與直鏈淀粉的結合和在 合適緩沖液中的洗脫。為了確認三個突變中的哪一個對于提高A9變體的結合是 必需的，三個突變分別亞克隆進pSN1578，在ma/五基因內(nèi)部帶有缺失
(其允許容易識別接受插入片段的克隆)的pMAL-c2G衍生物。 A1583G和A2419G突變沒有影響或降低MBP在親和純化中的產(chǎn)率， 而被排除。C2465T突變在分離物中通過4引物位點定向PCR誘變而 被重產(chǎn)生，其使用pMAL-c2X作為第一模板，用引物寡核苷酸5: 5' CTTCAAGGGTCAACCATCCAAACC (SEQIDNO:13)和寡核苷酸6: 5' AATACGCGGATCTTTCACCAACTCTTC (SEQ ID NO: 14)產(chǎn)生N-末端PCR片段，并用引物寡核苷酸7 : 5' GAAGAGTGGGTGAAAGATCCGCGTATT (SEQIDNO:15)和寡核苷 酸8: 5' CTGAGAATTCTGAAATCCTTCCCTCGAT (SEQ ID NO: 16 ) 產(chǎn)生C-末端PCR片段。組裝步驟用凝膠純化的N-和C-末端片段作為 模板及引物寡核苷酸5和寡核苷酸8實行。最終的PCR片段用Blpl 和Aval剪切，凝膠純化，并連接到已用Blpl和Aval剪切并凝膠純化 的pMAL-c2X。連接體被用于轉(zhuǎn)化TBI,并且質(zhì)粒從轉(zhuǎn)化體中被純化 并測序以確認C2465T突變。分離物被選擇用于進一步的研究并被命名 為pIH1606。在pIH1606的構建中，在MBP末端的終止密碼子不被保留； 該構建體表達融合到LacZaa片段的MBP。為了比較C2465T突變與其 親代A9的效果，在pIH1606中的ma伍基因后引入終止密碼子。該質(zhì) 粒用XbaI剪切，用Klenow加dNTP，s填補，并按上述用于pKOM83 的重連接。帶有終止密碼子的C2465T衍生物被稱為pPR1610。含有與pK01483和A9并列的該質(zhì)粒的TBI的大規(guī)模MBP純化顯示出，在 A9中發(fā)現(xiàn)的所有MBP產(chǎn)率的提高都可以歸因于C2465T突變。該突變 將MBP的丙氨酸313改變?yōu)槔i氨酸(A313V)。為了能夠比較MBP (S146T)與野生型MBP和具有精確平 行構建(exactly parallel construction)的衍生物中的MBP (A313V)，構建 具有與構建pK01483相同終止密碼子的MBP (S146T)的一種形式。 來自pIH1596的Ndel、 BIpI片段被純化并被亞克隆進pK01493，用 NdeI和BlpI剪切，產(chǎn)生pIH1619。
實施例II: MBP融合蛋白提髙的產(chǎn)率
A: MBP-Klenow為了測試修飾的MBPs是否可以在純化后提高融合蛋白的 產(chǎn)率，編碼大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段的基因被克隆進 pMAL-c2X、 pIH1619 (S146T)禾Q pPR1610 (A313V)。 MBP-Klenow 融合被選擇，因為其具有固有地對直鏈淀粉柱的低親和力，并且在親 和純化過程中， 一些MBP-Klenow蛋白流過直鏈淀粉柱而不結合。DNA 聚合酶I的Klenow部分從質(zhì)粒pPolA中被PCR，其包含被克隆進BglII 和HindIII位點之間pBR322的polA基因(Genbank ecopolA: 206-4127) 的BgIII-Hindin片段。PCR使用引物寡核苷酸9 : 5' CCAGAAGTGACGGCAACGGTGATT (SEQ ID NO:17)和寡核苷酸進行。 PCR片段被HindIII剪切并連接到pMAL-c2，其已經(jīng)用Xmnl 和HindIII剪切。產(chǎn)生的構建體被命名為pIH1040。為了降低插入片段 中PCR錯誤的幾率，Xhol到HindIII的區(qū)域被來自pPolA的相應片段 替代。該構建體通過測序檢查并被命名為pIH1062。編碼Klenow片段 的基因通過PCR被克隆進pPR1610和pIH1619，其使用pPolA作為模 板和引物寡核苷酸ll:
5' GTGATTTCTTATGACAAC丁ACGTCACCATCCTTGATG ( SEQ ID NO:19)和寡核苷酸12:
5' TTAAGGATCCTTAGTGCGCCTGATCCCAGT (SEQ ID NO:20 )。
15
PCR片段被BamHI剪切，并且載體被Xmnl和BamHI剪切、 純化并與PCR片段混合，并連接。連接體被用于轉(zhuǎn)化NEB Turbo (Ipswich, MA)，并且轉(zhuǎn)化體通過限制性分析，并通過MBP-Klenow 融合體表達及通過SDS-PAGE分析，檢查正確的結構。pIH1610-Klenow 構建體被命名為pIH1643，且pIH1619-Klenow構建體被命名為 pIH1644。 MBP-Klenow的親和純化使用含有pIH1062、 pIH1643禾口 pffll644的細胞進行。來自每個菌株的粗提物、柱流出物和洗脫物部分 通過SDS-PAGE分析(圖4)。洗脫的蛋白通過測量A，被定量，并使 用MBP-Klenow蛋白的預期消光系數(shù)(表l)定量。含有pIH1643、攜 帶MBP-A313V修飾的細胞產(chǎn)生比含有野生型MBP或S146T修飾的 MBP融合質(zhì)粒的細胞多兩倍多的融合蛋白。 B. MBP-幾丁質(zhì)結合結構域為了測試突變MBP提高來自親和純化的融合蛋白產(chǎn)率的 能力是否是普遍的性質(zhì)，具有固有對直鏈淀粉低親和性的另一種融合 蛋白被測試。融合到環(huán)狀芽孢桿菌(B"c//^ "ycw/a"s)幾丁質(zhì)結合結 構域(MBP-CBD)的MBP由質(zhì)粒pMB50編碼(圖5)。該MBP-CBD
融合蛋白的良好部分傾向于在親和純化過程中流過直鏈淀粉柱，這與 MBP-Klenow相似。編碼MBP (A313V)的pPR1610的部分使用Hpal 和SacI從質(zhì)粒中剪切，并且該片段被純化。pMB50用相同的酶剪切， 骨架也被純化，并且這兩個片段被連接并被轉(zhuǎn)化進ER2523。產(chǎn)生的質(zhì) 粒被命名為pIH1660。 MBP-CBD的親和純化使用含有從500mL培養(yǎng)物中收集的 pMB50和pIH1660的細胞進行。洗脫的蛋白通過測量八28()被定量，并 使用MBP-CBD蛋白的預期消光系數(shù)(表2)定量。含有pIH1643、攜 帶MBP-A313V修飾的細胞產(chǎn)生比含有野生型MBP融合質(zhì)粒的細胞多 兩倍多的融合蛋白。
實施例m: MBP融合蛋白溶解度的提高
MBP融合體的構建為了測試修飾的MBP's是否保持提高融合到MBP的蛋白
16的溶解度的能力，在大腸桿菌中傾向于不溶的兩種蛋白，二氫葉酸還
原酶(DHFR)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，被克隆進pIH1619 (S146T)禾卩pIH1610 (A313V)。作為對照，相同的兩種蛋白被克隆 進包含Telmer等稱為"MBP-DM"的修飾MBP中突變的pMAL-c2X 和pMAL-c2G衍生物中。編碼MBP-DM的載體按如下方法被構建首 先，在核苷酸2030具有翻譯靜默的Nsil位點的pMAL-c2G衍生物通 過四引物位點定向PCR構建。用于N-和C-末端片段的模板都是 pMAL-c2X。引物寡核苷酸13:
5' CCATAGCATATGAAAATCGAAGAAG (SEQ ID NO:21 ) 和寡核苷酸14:
5' CTTGAATGCATAACCCCCGTCAGCAGC (SEQ ID NO:22)被用于
產(chǎn)生N-末端片段，和引物寡核苷酸15:
5' GGTTATGCATTCAAGTATGAAAACGGCAAG (SEQ ID NO:23)和 寡核苷酸8被用于產(chǎn)生C-末端片段。PCR片段被凝膠純化，隨后被用 作使用引物寡核苷酸13和寡核苷酸8的組裝步驟中的模板。最終的 PCR片段被乙醇沉淀，用Ndel和EcoRI剪切，并被凝膠純化。pMAL-c2X 用NdeI和EcoRI剪切并被凝膠純化，并且兩個片段被混合并連接。連 接體被用于轉(zhuǎn)化ER2502，過夜培養(yǎng)物被生長，并且小量制備的DNA 被制備。得到了已經(jīng)獲得NsiI位點并且大小正確的若干轉(zhuǎn)化體，但是 意外地，它們都缺少EcoRI位點。這一組的代表，命名為pPR1629， 用Ndel和Aval剪切，并且片段被凝膠純化。pSN1578用相同的 兩種酶剪切并且質(zhì)粒骨架被凝膠提純。這兩個DNA片段被連接，該連 接體被用于轉(zhuǎn)化ER2502,并且來自一個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA被測序并 被命名為pPR1633。其次，被Telmer和Shilton稱作DM的修飾MBP 的基因通過如下的四引物PCR位點定向誘變被構建N-和C-末端片段 的模板都是pMAL-c2X。用于N-末端片段的引物為寡核苷酸16: 5'
IDNO:24)和寡核苷酸17:
5' GCGGCGTTTTCCGCAGTGGCGGCAATACGTGGATCTTTC ( SEQ IDNO:25)。 C-末端片段使用引物寡核苷酸18:ID NO:26)和寡核苷酸8產(chǎn)生。組裝PCR使用純化的N-和C-末端片 段與寡核苷酸16和寡核苷酸8作為引物進行。PCR片段被乙醇沉淀并 且連接到已經(jīng)用EcoRV線性化并用熱敏磷酸酶處理的石蕊38。連接體 被用于轉(zhuǎn)化NEB 5-ct (Ipswich, MA)，并且來自一個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA 被測序以確認該構建，并命名其為pPR1638。質(zhì)粒DNA pPR1633和 pPR1638用Nsil和Aval剪切，并且來自pPR1633的質(zhì)粒骨架和來自 pPR1638的片段被凝膠純化，連接，并且該連接體被用于轉(zhuǎn)化 NEBTurbo。來自一個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA被選擇用于測序，并被命名 為pPR1639。 DHFR基因使用pOTB7-DHFR作為模板并使用引物寡核苷
和寡核苷酸20: 5' TATTAATCATTCTTCTCATATACTTCAAA (SEQ ID NO:28)進行PCR，隨后用T4聚合酶和dT在室溫下處理PCR片段15 分鐘。該處理在片段的每個末端產(chǎn)生短的3'突出端，在DHFR基因的 上游末端產(chǎn)生GG和在下游末端產(chǎn)生A。載體pMAL-c2X和pPR1610 通過用XmnI剪切，隨后用T4聚合酶和dA處理而制備，所述處理相 似地在malE區(qū)域的末端產(chǎn)生3' CC突出端和在/acZa末端產(chǎn)生T。載 體DNAs被連接到DHFR片段并且連接體被用于轉(zhuǎn)化ER1992。對于每 個載體，轉(zhuǎn)化體通過由SDS-PAGE分析的期望大小的融合蛋白的限制 性分析和表達而確認。pMAL-c2X-DHFR分離物被命名為pIH1616,且 pPR1610-DHFR分離物被命名為pIH1617。DHFR插入片段隨后按以下 步驟被亞克隆進pIH1596: pIH1616用Ndel和BlpI剪切，對消化液進 行跑膠，并且骨架(包括DHFR基因)被切除并凝膠純化。pIH1596 用Ndel和Blpl剪切，并且malE，被凝膠純化。載體骨架被連接到malE' 片段，并且連接體被用于轉(zhuǎn)化ER1992。分離物通過由SDS-PAGE分析
的期望大小的融合蛋白的限制性分析和表達而確認，并被命名為 pIH1618。 DHFR插入片段通過下列步驟被亞克隆進pPR1639:用Aval 和Sail剪切pPR1639和pIH1616，凝膠純化來自pPR1639的載體骨架 和來自pIH1616的DHFR片段，并連接兩個片段。連接體被用于轉(zhuǎn)化 NEB Turbo，并且轉(zhuǎn)化體通過測序確認并被命名為pIH1646。使用pJF931作為模板并使用引物寡核苷酸21: 5'GGATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGG (SEQIDNO:29)和寡核苷酸 22: 5'TATTACTCCTTGGAGGCCATGTAGGCCA (SEQIDNO:30)對 GAPDH基因進行PCR，隨后用T4聚合酶和dT處理PCR片段。載體pMAL-c2X、 pPR1610和pIH1619按上文所述通過用 Xmnl剪切，隨后用T4聚合酶和dA處理而制備。載體DNA被連接到 GAPDH片段并且連接體被用于轉(zhuǎn)化ER1992。對于每個載體，轉(zhuǎn)化體 通過由SDS-PAGE分析的期望大小的融合蛋白的限制性分析和表達而 確認。pMAL-c2X-GAPDH分離物被命名為pIH1625， pPR1610-GAPDH 分離物被命名為pIH1626，且pPR1619-GAPDH分離物被命名為 pIH1627。 GAPDH插入片段隨后通過用Aval和Sail剪切pPR1639禾口 pIH1625，凝膠純化來自pPR1639的載體骨架和來自pIH1625的 GAPDH片段，并連接兩個片段而被亞克隆進pPR1639。連接體被用于 轉(zhuǎn)化NEB Turbo，并且轉(zhuǎn)化體通過由SDS-PAGE分析的期望大小的融 合蛋白的限制性分析和表達而確認，并被命名為pIH1645。
溶解度曲線 20ml含有8種pMAL質(zhì)粒(pMAL-c2X、pIH1619(攜帶S146T) 和pPR1610(攜帶A313V)，每個質(zhì)粒進一步包含編碼DHFR或GAPDH 的基因)的TB1培養(yǎng)物在LBamp中生長到2xl08/ml，用0.3mM IPTG 誘導，溫育額外的兩小時，隨后細胞通過在微離心機中3000xg離心收 集。每個細胞團被重懸浮于2ml的50mMTris-ClpH7.9， 50mMNaCl， 0.75mM EDTA， 0.6% Mega 10， 150(ig/ml溶菌酶和20孔尼茨單位 (Kimitzunit) /ml粘質(zhì)沙雷氏菌核酸酶，并在室溫下溫育10分鐘。重 懸浮的細胞團被指定為總細胞提取物。125^1樣品被取出并在14,000xg 下離心2分鐘。上清液被移出并被指定為可溶部分。細胞團被重懸浮 在125^1相同的緩沖液中，并被指定為不溶部分。對于每個菌株，每個 部分的樣品(5^1)在SDS-PAGE上電泳(圖5)。凝膠被干燥并掃描， 并且每個泳道中MBP融合蛋白的量被定量為可溶蛋白與離心前細胞裂 解物中存在的蛋白的比例(表2)。對于DHFR和GAPDH融合體，A313V 和S146T修飾的MBP與野生型MBP相比，提高了融合蛋白的溶解度。 用DM修飾的MBP制備的融合體，如預期，與野生型MBP相比顯示
19出降低的溶解度。
實施例IV: MBP突變體在乳酸克魯維酵母中的應用
乳酸克魯維酵母MBP(A313V)-融合表達載體的構建編碼突變麥芽糖結合蛋白的基因，MBP(A313V)，使用正 向和反應引物通過PCR擴增，所述引物分別為
寡核苷酸23: 5' GCCCAAGCTTGCCJCCATGAAAATCGAAGAAGGT (SEQIDNO:31)和寡核苷酸24:
(SEQ ID NO:32)。正向引物被工程化以包含歷"dn限制性內(nèi)切酶位 點(粗體)，然后是在緊接malE基因起始密碼子(下劃線)之前的Kozak 共有序列(斜體)。反向引物被工程化以包含^/zo1限制性內(nèi)切酶位點
(粗體)，然后是編碼蛋白酶腸激酶的蛋白水解識別位點的DNA (斜 體和下劃線)。反向引物中沒有插入終止密碼子，以允許閱讀框內(nèi)C-末端MBP(A313V)融合表達盒的構建。malE基因從含有全長基因的質(zhì) 粒pPR1610中使用Phusion聚合酶擴增。擴增的基因被克隆進乳酸克 魯維酵母表達載體pKLACl的歷^ffll和lol限制酶切位點，以產(chǎn)生 乳酸克魯維酵母MBP(A313V)-融合表達載體(pKIMF2)。該克隆策略 導致pKLACl中乳酸克魯維酵母的a-交配因子(mating factor)前原信 號序列(pre-pro signal s叫uence)被基因替代。因此，MBP-和 MBP(A313V)-融合蛋白將不會被引導至分泌途徑，而是相反將被保留 在酵母細胞溶膠中。
MBP(A313V)-融合蛋白在乳酸克魯維酵母中的表達和純化編碼截短形式的副肌球蛋白的基因(Steel等， / /w羅"o/. 145:3917-3923 (1990))使用如下引物通過PCR擴增寡核苷酸25: 5' GCGCTCGAGAATTCCGCATTCGGTAGTATG (SEQIDNO:33)和寡
核苷酸26:
ATAAGAATGCGGCCGCrC4CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT (SEQIDNO:34)。正向引物被工程化以包含Xhol限制酶切位點(粗體)。反向引物被工程化以包含Notl限制酶切位點(粗體)，其緊鄰
PMASal的終止密碼子的上游(斜體)?？寺〔呗匀缦?。約750bp副肌球蛋白基因被擴增和純化。 片段被"wl和雙消化并被克隆進表達載體pKIMF2的Xhol和Notl 限制酶切位點，產(chǎn)生在PMASal的C-末端和N-末端之間符合讀框的融 合體。以這種方式構建的質(zhì)粒被命名為pKLMF2-PMASal (圖7)。 MBP(A313V)-PMASal融合載體(pKIMF2-PMASal)通過 SacII限制酶切消化被線性化并且純化的產(chǎn)物使用乳酸克魯維酵母蛋白 表達試劑盒(K /acfe Protein Expression Kit)根據(jù)其說明轉(zhuǎn)化進化學感 受態(tài)的乳酸克魯維酵母細胞中。轉(zhuǎn)化體菌落在乙酰胺板中被選擇，并 且含有正確插入的MBP(A313V)-PMASal表達盒的克隆通過上述試劑 盒中所述的全細胞PCR被識別。 20ml YPGaiactose培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2% 半乳糖)培養(yǎng)物用含有多拷貝整合MBP(A313V)-PMASal表達盒的乳 酸克魯維酵母細胞菌株接種，并在帶有搖床的培養(yǎng)箱中3(TC下生長4 天。生長后培養(yǎng)物中的總細胞含量確定約為8.2xl0"細胞(或約為 4.1xl()8細胞/ml)。細胞通過在4。C、 8,000rpm離心IO分鐘收集。細胞
在蒸餾水中洗滌一次以去除多余的培養(yǎng)液。對于裂解物的制備，細胞被重懸浮在2ml 1M山梨糖醇中 的10mg/ml溶細胞酶溶液中，并在37。C溫育1小時。細胞通過在微型 離心機中輕度離心(7,000rpm) 2分鐘收集。細胞團被重懸浮在總體積 3ml含有蛋白酶抑制劑混合物(CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物， Roche)的冰冷直鏈淀粉柱緩沖液(20mMTris-ClpH7.4， 0.2MNaCl， lmM EDTA)中。細胞漿被轉(zhuǎn)移到玻璃管中并置于冰上。等體積的酸 清洗玻璃珠(425-600微米，Sigma)被加入細胞漿并且細胞通過渦旋 10次，每次持續(xù)l分鐘而破碎。細胞裂解物被轉(zhuǎn)移到新管中，并且玻 璃珠用lml柱緩沖液清洗4次。細胞裂解物和清洗液被合并且細胞碎 片通過離心除去。澄清的細胞裂解物用柱緩沖液稀釋到8ml。對于融合蛋白的純化，細胞裂解物通過用15ml柱緩沖液預 平衡的1.6ml直鏈淀粉樹脂柱。該柱用24ml柱緩沖液清洗，且結合的 蛋白以0.4ml的餾份用含有10mM麥芽糖的柱緩沖液洗脫。細胞裂解物和純化的蛋白通過在10-20% Tris-甘氨酸梯度凝膠上的SDS-PAGE分 離(國lved)。蛋白通過SimplyBlue Safestain識別。圖6顯示出大部 分洗脫的蛋白對應于MBP(A313V)-PMASal融合蛋白期望的大小 (68.5kDa)。表1.野生型和修飾的MBP的MBP-Klenow的產(chǎn)率 質(zhì)粒 MBP 產(chǎn)率
~"pffll062 WT 0.7mgs~~
pIH1643 A313V 2mgs
pIH1644 S146T 0.7mgs表2.野生型和MBP(A313V)的MBP-CBD的產(chǎn)率 質(zhì)粒 MBP 產(chǎn)率
~~pMB50 WT i^i^~
pIH1660 A313V 21.8mgs表3.MBP融合蛋白的溶解度
質(zhì)粒融合蛋白%溶解
pffll616MBP-DHFR36%
pIH1617MBP(A313V)-DHFR67%
pIH1618MBP(S146T)腳DHFR67%
pIH1646MBP(DM)陽DHFR25%
pIH1625MBP-GAPDH42%
pIH1626MBP(A313V)-GAPDH59%
pIH1627MBP(S146T)-GAPDH53%
pIH1645MBP(DM)-GAPDH17%
2權利要求
1. 修飾的麥芽糖結合蛋白(MBP)，其包括具有突變的MBP氨基酸序列，其中所述突變使所述修飾的MBP，當融合于蛋白時，具有以下至少一項的提高(i)對麥芽糖糊精底物的結合親和力；和(ii)當?shù)鞍拙哂杏邢奕芙舛葧r的溶解度。
2. 根據(jù)權利要求1所述修飾的MBP，其中所述突變位于螺旋XI 和XII之間的鉸鏈區(qū)或在所述蛋白的A313的IOA之內(nèi)的區(qū)域。
3. 根據(jù)權利要求1所述修飾的MBP，其中所述突變位于C結構域 或在S146的IOA之內(nèi)的區(qū)域、在所述蛋白的P-折疊F的開端。
4. 根據(jù)權利要求1所述修飾的MBP，其中所述突變?yōu)锳313V。
5. 根據(jù)權利要求1所述修飾的MBP，其中所述突變?yōu)镾146T。
6. 根據(jù)權利要求1所述修飾的MBP，其融合到靶蛋白以形成融合 蛋白。
7. 根據(jù)權利要求6所述修飾的MBP，其中所述融合蛋白具有比與 所述靶蛋白融合的未修飾的MBP蛋白的溶解度更高的溶解度。
8. 根據(jù)權利要求1所述修飾的MBP，其包括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。
9. 編碼修飾的MBP的分離DNA，其包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。
10. 包含根據(jù)權利要求9的DNA的載體。
11. 用根據(jù)權利要求10所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
12. 根據(jù)權利要求11所述的宿主細胞，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主細胞 為轉(zhuǎn)化的大腸桿菌宿主細胞。
13. 根據(jù)權利要求11所述的宿主細胞，其中所述轉(zhuǎn)化的宿主細胞 為轉(zhuǎn)化的克魯維酵母屬宿主細胞。
14. 根據(jù)權利要求11所述的宿主細胞，其中所述載體為pKIMF2。
15. 純化蛋白的方法，包括在宿主細胞中表達包含根據(jù)權利要求1所述的修飾的MBP和靶蛋 白的融合蛋白；允許所述修飾的MBP融合蛋白結合到基質(zhì)；和 在選定的緩沖液中從所述基質(zhì)洗脫所述融合蛋白，以獲得純化蛋白。
16. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述基質(zhì)是多糖。
17. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中碳水化合物為麥芽糖糊精。
18. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述修飾的MBP具有選 自A313V和S146T的突變。
19. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述修飾的MBP包括SEQ IDNO:4。
20. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述修飾的MBP包括SEQ ID NO:6。
21. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述修飾的MBP由SEQID NO:3或SEQ ID NO:5編碼。
22. 根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述宿主細胞為克魯維酵母屬或大腸桿菌。
23. 溶解耙蛋白的方法，包括表達與靶蛋白融合的修飾的MBP， 以便所述融合蛋白在體內(nèi)被溶解到大于在不存在突變MBP的情況下可 觀察到的程度，并且被溶解到大于使用非突變MBP所觀察到的程度。
24. 根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述修飾的MBP具有 A313V突變或S146T突變。
25. 根據(jù)權利要求24所述的方法，其中所述修飾的MBP具有 A313V突變和S146T突變。
全文摘要
提供了用于提高以下至少一種的方法和組合物(i)靶蛋白對麥芽糖糊精底物的結合親和力和/或(ii)靶蛋白的溶解度。所述方法和組合物涉及修飾的麥芽糖結合蛋白。
文檔編號C07K14/195GK101443354SQ200780017631
公開日2009年5月27日 申請日期2007年4月14日 優(yōu)先權日2006年4月14日
發(fā)明者C·H·塔龍, I·沃克, M·加奈特拉, P·A·科盧西, P·D·里格斯, P-C·赫斯 申請人:新英格蘭生物實驗室公司