專利名稱：麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重組蛋白制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人工合成改造的麥芽寡糖基海藻糖水解酶基 因序列及其重組蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
海藻糖[α-D-葡萄糖-(l，l)-a-D-葡萄糖苷]是一種廣泛存在于低等植物、藻 類、細(xì)菌、真菌、酵母和昆蟲等的具有多種功能的非還原性二糖。在自然界中，海藻糖既是 一種貯藏性糖類，又是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物，具有保護(hù)生物細(xì)胞和生物活性物質(zhì)在脫水、干 旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能。海藻糖還具 有良好的保濕性能，其甜度只有蔗糖的一半，且無還原性醛基，因此海藻糖被廣泛應(yīng)用于食 品和飲料的冷凍和保藏、用作化妝品的保濕劑以及藥物的穩(wěn)定劑等，在生物制品和食品行 業(yè)的用途越來越廣泛。由于它具有獨(dú)特的功能，吸引科研人員對(duì)其進(jìn)行了大量的研究。早期 是從生物體內(nèi)提取海藻糖，但成本太高，無法進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，阻礙了其大規(guī)模的應(yīng)用。 但是后來，科學(xué)家Kato從高溫菌株Sulfolobus solfataricus KMl中分離到了麥芽寡糖基 海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)兩個(gè)酶，在這兩個(gè)酶的作用 下，以淀粉為原料，可分解轉(zhuǎn)化為海藻糖。用此方法生產(chǎn)海藻糖具有成本低，效率高，是最有 競(jìng)爭(zhēng)力的方法。目前科研人員對(duì)兩個(gè)酶進(jìn)行了基因克隆和重組表達(dá)，但在大腸桿菌表達(dá)這 兩個(gè)酶的效果均不理想，限制了酶法途徑在海藻糖合成中的運(yùn)用?；诖耍l(fā)明人在分析了 MTHase基因密碼子的成分后，以芝田硫化葉菌 (Sulfolobusshibatae)B12 嗜熱嗜酸古細(xì)菌 MTHase 基因(GeneBank :AF201335)為基礎(chǔ)， 優(yōu)化密碼子結(jié)構(gòu)，合成酵母偏愛密碼子和修改基因遺傳密碼子中的A/T含量，得到了一條 基因密碼子結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，A/T含量降低的MTHase基因序列，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)， 將完整的MTHase基因克隆到酵母表達(dá)載體pPICZ α Α,篩選出重組載體并將其導(dǎo)入Pichia pastoris細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)。獲得了一株高效穩(wěn)定表達(dá)MTHase的酵母菌株，分泌到表達(dá)培 養(yǎng)基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，為工業(yè)化用酶法以淀粉為原料生產(chǎn)海藻糖打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上所述，本發(fā)明的一個(gè)目的是通過人工合成改造麥芽寡糖基海藻糖水解酶 基因，使其基因密碼子結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，A/T含量降低，提供一種優(yōu)化的編碼這種酶的多核苷 酸序列。因此，本發(fā)明涉及這樣一種經(jīng)人工合成改造的多核苷酸序列，該序列選自SEQ ID NO :4中的序列，其全長(zhǎng)為1683bp，編碼559個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明還涉及用于人工合成改 造該基因的全部引物序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有編碼這種麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重組 表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有編碼這種麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的基因工程化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過基因工程化宿主細(xì)胞，建立這種酶的重組表達(dá)制備方 法。本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的重組表達(dá)質(zhì)粒；一種用該重組表達(dá)質(zhì) 粒進(jìn)行基因工程化的宿主細(xì)胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和重組表達(dá)該酶的方法。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明直接用該人工改造基因經(jīng)過基因工程方法產(chǎn)生的宿主 細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法。本發(fā)明中，編碼麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的多核苷酸序列可插入到載體中， 以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組表達(dá)質(zhì)粒。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、 噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在 本發(fā)明中適用的載體包括但不限于pPICZ α A。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì) 粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明中，編碼的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組表達(dá)質(zhì)?？赊D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿 主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組表達(dá)質(zhì)粒的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞” 指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，入哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。代表性的例子有大腸桿菌、酵母細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS等。用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物，如大腸桿菌等，可采用本領(lǐng)域眾 所周知的方法和電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為酵母細(xì)胞時(shí)，一般采用電轉(zhuǎn)化方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984，224 :1431)，利用本發(fā)明的多核苷酸序 列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的麥芽寡糖基海藻糖水解酶。一般說來有以下步驟(1)得到編碼麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因。(2)用編碼本發(fā)明的麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列，或用含有該序列的重組 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。(3)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。(4)在合適的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的表達(dá)。(5)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。在步驟⑴中編碼本發(fā)明的基因克隆通過合成合適的引物，通過PCR人工拼接合 成靶基因。在步驟(2)中，為了構(gòu)建包括上述編碼麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重組表達(dá) 質(zhì)粒，所述的基因可結(jié)合到適于在目的宿主中進(jìn)行基因表達(dá)的任意載體中。這些載體的實(shí) 施例包括但不局限于畢赤酵母作宿主時(shí)使用的pPICZaAdnvitrogen公司)。使用由此獲 得的重組表達(dá)質(zhì)粒，通過一定的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在本發(fā)明中，人工合成的基因經(jīng) DNA重組技術(shù)，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A/MTHase,并通過合適的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 Pichia pastorisSMD1168H。在步驟(3)中，任何能夠使產(chǎn)生本發(fā)明麥芽寡糖基海藻糖水解酶的微生物生長(zhǎng)并 產(chǎn)生所述的麥芽寡糖基海藻糖水解酶的培養(yǎng)基都可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的麥芽寡糖基海藻 糖水解酶。在本發(fā)明中，將培養(yǎng)物在不同條件下培養(yǎng)，其中優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí) 間為72h，即可得到最高的表達(dá)量。
在步驟(4)中，所用誘導(dǎo)劑為甲醇，誘導(dǎo)濃度為0.5-1%，誘導(dǎo)溫度為18-25°C。 在本發(fā)明中，誘導(dǎo)劑為甲醇，誘導(dǎo)濃度為0. 5 %。所述基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)溫度為 25 °C。在步驟(5)中，任何能夠使產(chǎn)生本發(fā)明麥芽寡糖基海藻糖水解酶的分離純化技術(shù) 均可用于生產(chǎn)本發(fā)明的麥芽寡糖基海藻糖水解酶。在本發(fā)明中，通過直接對(duì)培養(yǎng)物離心的 方法，在培養(yǎng)基上清液中得到大部分的重組麥芽寡糖基海藻糖水解酶。通過本方法得到的 麥芽寡糖基海藻糖水解酶，按下述方法進(jìn)行酶活測(cè)定。其活性測(cè)定方法為將麥芽六糖溶于 50mmol/LpH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配制成5. Ommol/L的溶液，取ImL該溶液，加入 MTSase酶制劑50 μ L，75°C反應(yīng)2h，沸水中煮沸IOmin終止反應(yīng)。待溶液冷卻后，加入10 μ L MTHase表達(dá)上清液，75°C反應(yīng)15min，用HPLC測(cè)定糖化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活 單位定義為每分鐘水解1 μ mol麥芽四糖基海藻糖生成海藻糖所需要的酶量。


圖1重組MTHase基因工程菌的構(gòu)建流程2重組子鑒定結(jié)果Ml :1Kb DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen 公司)；M2 :1Kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(MBI公司)；1 :pMD18-T/MTHase 雙酶切(EcoRI/XhoI)鑒定；2 =MTHase 基因 PCR 產(chǎn)物雙酶切(EcoRI/XhoI)片段；3 :pPICZ α A 載體雙酶切(EcoRI/XhoI)片段；4 重組質(zhì)粒 pPICZ α A/MTHase 雙酶切(EcoRI/XhoI)鑒定；5 以Pichia pastoris基因組DNA為模板擴(kuò)增AOXl基因(副對(duì)照)；6 以重組Pichia pastoris基因組DNA為模板擴(kuò)增AOXl基因；7:以重組Pichia pastoris基因組DNA為模板擴(kuò)增麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因 片段.圖3MTHase表達(dá)產(chǎn)物電泳分析1 誘導(dǎo)前；2:24h 誘導(dǎo);3 :48h 誘導(dǎo)；4:72h 誘導(dǎo);M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 圖4重組工程菌傳代后的穩(wěn)定率下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通暢按照 常規(guī)條件如Sambrook等人所著的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因的人工改造和合成
根據(jù)上面的編碼氨基酸序列，按照酵母菌密碼子偏好性原則設(shè)計(jì)用于基因拼接的 正、反鏈DNA引物(如SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 47所示)。其中5，端加入XhoI酶切位 點(diǎn)，3’端加入EcoR I酶切位點(diǎn)序列，便于與載體連接。用超純水配制引物，使引物濃度為dOOpmol/y L，分別取引物1 μ L，混合后100°C 沸水中作用 15 分鐘，立即冰浴；加入 5μ L IOX T4DNA ligase Buffer,Τ4 Polynucleotide Kinase 5 μ L，加水至總體積為45 μ L，37°C作用30分鐘；65°C 20分鐘，冰浴2分鐘；加入 5μ L T4 DNALigase，16°C反應(yīng) 2 小時(shí)，65°C 20 分鐘。取上述混合反應(yīng)液IyL作為PCR反應(yīng)的模板，以SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3 為擴(kuò)增引物，按下述PCR擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C預(yù)變性5min ；循環(huán)30次94°C，30s ； 55°C，30s ;72°C，2min。最終延伸:72°C，10min。實(shí)施例2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性克隆的篩選將實(shí)施例1最終獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收，連接到pMD18-T vector (Takara，大 連寶生物工程公司)，經(jīng)過序列分析并選擇正確的陽性克隆pMDS-T/MTHase，獲得的序列是 SEQID NO :4，用XhoI/EcoRI進(jìn)行雙酶切，分離、回收1. 7kb左右的MTHase基因片段，將其 連接到經(jīng)XhoI/EcoRI雙酶切的pPICZ α A酵母表達(dá)載體(美國(guó)Invitrogen公司)，并篩選 出陽性克隆pPICZa A/MTHase。將陽性克隆載體經(jīng)BglII單酶切后，轉(zhuǎn)化Pichia pastoris SMD1168H酵母菌，并在高濃度的Zeocin-YPD固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆菌株(Pichia pastorisSMD1168H/pPICZ α A-MTHase)，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的 PCR 鑒定確認(rèn)。實(shí)施例3培養(yǎng)基及培養(yǎng)表達(dá)條件將實(shí)施例2 中描述的陽性菌株(Pichia pastoris MD1168H/pPICZ α A-MTHase)接 種于YPD培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)12-24h，搖床轉(zhuǎn)速為240rpm ；當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)0D_ = 5. 0時(shí)， 按體積比1 100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速為240rpm，培養(yǎng) 28-35h ；5000g離心5min，收集菌體，用PBS洗滌菌體1_2次，轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中，使 發(fā)酵液濃度達(dá)OD = 0. 5-1. 0時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，每隔12h向 培養(yǎng)基中加入5-10mL/L量的0. 5%甲醇，培養(yǎng)72小時(shí)；實(shí)施例4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將在實(shí)施例3中獲得的培養(yǎng)物經(jīng)5，OOOrpm離心lOmin，直接取上清液按分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南(第三版)所述操作步驟進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。分析結(jié)果見附圖3。實(shí)施例5基因工程菌遺傳穩(wěn)定性研究連續(xù)傳代將鑒定后的基因工程菌(Pichiapastoris SMD1168H/pPICZ α A-MTHase)進(jìn)行適 當(dāng)稀釋，涂布在YPD (+)平板上(含1000 μ g/ml Zeocin)，于30°C恒溫培養(yǎng)2天，隨機(jī)挑取 50個(gè)單菌落，同一個(gè)菌落分別接種于YPD (+)和YPD (-)(不含1000 μ g/ml Zeocin)上，于 30°C恒溫培養(yǎng)2天(稱為第1代)。將YPD (+)上的菌接種于YPD (+)平板上，YPD (-)上的 菌接種于YPD (-)平板上，于30°C恒溫培養(yǎng)2天(稱為第2代)。依次進(jìn)行連續(xù)傳代50次， 對(duì)兩個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。平板傳代穩(wěn)定性鑒定在傳代過程中，每隔一定天數(shù)將YPD (_)平板上的菌落接種于YPD (+)平板上(含 1000 μ g/mL Zeocin)，菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算該基因工程重組菌種在無選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率。
發(fā)酵條件下穩(wěn)定性鑒定發(fā)酵液稀釋IO6倍，分別涂布于YPD(+)和YPD(-)平板，30°C恒溫培養(yǎng)2天，以兩 種平板菌落數(shù)上的比值YPD (+) /YPD (-)間接表示該條件下菌株的穩(wěn)定率。實(shí)施例6麥芽寡糖基海藻糖水解酶酶活性測(cè)定將麥芽六糖溶于50mmol/L pH5. 0的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配制成5. Ommol/L的 溶液，取ImL該溶液，加入MTSase酶制劑50 μ L，75°C反應(yīng)2h，沸水中煮沸IOmin終止反應(yīng)。 待溶液冷卻后，加入10 μ L MTHase表達(dá)上清液，75°C反應(yīng)15min，用HPLC測(cè)定糖化液中海藻 糖的含量。MTHase的酶活單位定義為每分鐘水解1 μ mol麥芽四糖基海藻糖生成海藻糖所 需要的酶量。測(cè)定的MTHase酶活為843mg/L。
權(quán)利要求
一種人工合成改造的全長(zhǎng)麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因，其堿基序列如SEQID NO4所示。
2.人工合成權(quán)利要求1所述全長(zhǎng)麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的引物，其序列如SEQ IDNO 6 至 SEQ ID NO 47 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的基因工程菌。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
6.一種制備麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，是將權(quán)利要求1所述的麥芽寡糖基海藻 糖水解酶基因插入畢赤酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌酵母菌，篩選得到表達(dá)麥芽寡糖基海藻 糖水解酶基因的基因工程菌，培養(yǎng)該基因工程菌，得到重組表達(dá)的麥芽寡糖基海藻糖水解 酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述畢赤酵母表達(dá)載體為PPICZα A。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因插入 到pPICZ α A載體的XhoI和EcoRI的酶切位點(diǎn)間。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主酵母菌為Pichia pastorisSMD1168H。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因工程 菌為 Pichia pastoris SMD 1168H/pPICZ α A-MTHase。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所用誘導(dǎo)劑為甲 醇，誘導(dǎo)濃度為0.5% (ν/ν) 0
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述基因工程菌的培養(yǎng)溫度為30°C，誘 導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)溫度為18-25°C。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)溫度 為 25 0C ο
全文摘要
本發(fā)明通過對(duì)麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因的遺傳密碼子進(jìn)行人工改造，合成酵母偏愛密碼子并修改基因遺傳密碼子中的A/T含量，得到了一條基因密碼子結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，A/T含量降低的MTHase基因序列。然后將完整的MTHase基因克隆到酵母表達(dá)載體pPICZαA，篩選出重組載體并將其導(dǎo)入Pichia pastoris細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)。獲得了一株高效穩(wěn)定表達(dá)MTHase的酵母菌株，其分泌到表達(dá)培養(yǎng)基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，為用酶法以淀粉為原料工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖打下了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101880681SQ20101016133
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者劉達(dá)玉, 唐仁勇, 張佳敏, 李德華, 王衛(wèi), 胡海洋, 茍興華, 郭秀蘭 申請(qǐng)人:成都大學(xué)