專利名稱：富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)還原糖還原末端的半縮醛ROH，以糖苷鍵的形式共價(jià)偶聯(lián)到羥基(-OH)衍生化的微納米磁性微粒上，利用這種固定在微納米磁性微粒上的糖特異地結(jié)合糖結(jié)合蛋白，對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化的方法。
背景技術(shù)：
糖結(jié)合蛋白是一類蛋白，能與糖類轉(zhuǎn)移的非共價(jià)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)含有糖類識(shí)別域，而不含糖基。糖結(jié)合蛋白具有重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞間的通訊和識(shí)別，細(xì)胞與病原微生物的相互作用，細(xì)胞內(nèi)蛋白的運(yùn)輸，蛋白間的相互作用，蛋白與受體的特異性結(jié)合等等。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)展，人們已逐漸認(rèn)識(shí)到糖結(jié)合蛋白的重要性。但目前對(duì)于糖結(jié)合蛋白的研究相對(duì)滯后。主要原因是缺乏高效率的能對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化的技術(shù)和手段。
目前，糖結(jié)合蛋白分離富集技術(shù)，有用親和層析柱分離富集糖結(jié)合蛋白的方法，但親和層析柱對(duì)糖結(jié)合蛋白的回收率較低，且方法復(fù)雜，使用不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于微納米磁性技術(shù)分離、富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其解決了背景技術(shù)中方法復(fù)雜，使用不便，回收率較低的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特殊之處在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括1)糖與微納米磁性微粒偶聯(lián)(1)偶聯(lián)劑的活化①按1∶5∶5的物質(zhì)的量之比取偶聯(lián)劑4-羥基苯基戊酸、N-羥基琥珀酰亞胺與二環(huán)已基碳二亞胺，分別溶解于有機(jī)溶劑中；②先將4-羥基苯基戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺混合；再加入二環(huán)已基碳二亞胺混合；用有機(jī)溶劑溶到使三者濃度分別為20mM、100mM和100mM；③于攝氏35～40℃，溫育8～16小時(shí)；所述的偶聯(lián)劑是含有一個(gè)羧基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑；(2)氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒的預(yù)處理取氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒于離心管中，加入活化的4-羥基苯基戊酸溶液的上清，物質(zhì)的比為1∶10；于攝氏35～40℃，溫育4～6小時(shí)；
(3)清洗磁性分離，棄上清；用乙醇清洗3次，再用緩沖液清洗3次；(4)偶聯(lián)加入2ml用偶聯(lián)緩沖液配制的100mM的糖溶液，于攝氏35～40℃，溫育8～16小時(shí)，糖被連接到氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上，得連接有糖的微納米磁性微粒；(5)清洗磁性分離、棄上清，用緩沖液清洗3次；(6)保存加入保存緩沖液，于2～6℃保存；2)對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化(1)糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理用水配制10mg/ml的糖結(jié)合蛋白，用結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml；(2)結(jié)合反應(yīng)取連接有糖的微納米磁性微粒于1號(hào)離心管中，加入0.5mg/ml的糖結(jié)合蛋白，于攝氏35～40℃反應(yīng)1～3小時(shí)，磁性分離、棄上清液；(3)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液1清洗，磁性分離、棄上清液；重復(fù)清洗一次；(4)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液2清洗，磁性分離、棄上清液；再重復(fù)清洗二次；(5)洗脫向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液3，清洗20～30分鐘，磁性分離、取上清液于2號(hào)離心管中；再重復(fù)清洗一次，取上清液合并于2號(hào)離心管中，得到富集純化的糖結(jié)合蛋白；(6)保存向1號(hào)離心管中加保存緩沖液，于2～6℃保存。
上述有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯或二甲基甲酰胺；所述的偶聯(lián)劑可采用4-羥基苯基戊酸或16-羥基十六羧酸。
上述緩沖液及偶聯(lián)緩沖液可采用乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液等；所述的結(jié)合緩沖液可采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液等；所述清洗緩沖液1、2均可采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH6.5的緩沖液等；所述的清洗緩沖液3可采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液等；所述的保存緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HCl pH6.0的緩沖液等。
上述偶聯(lián)劑的活化反應(yīng)中，溫育時(shí)以充氮?dú)獗Ｗo(hù)氣為宜。
上述偶聯(lián)劑的活化反應(yīng)中，溫育溫度以攝氏37℃為宜，溫育時(shí)間以12小時(shí)為宜；所述氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒的預(yù)處理中，溫育溫度以攝氏37℃為宜，溫育時(shí)間以5小時(shí)為宜；所述的結(jié)合反應(yīng)中，溫育溫度以攝氏37℃為宜，溫育時(shí)間以12小時(shí)為宜；所述的結(jié)合反應(yīng)中連接有糖的微納米磁性微粒加入糖結(jié)合蛋白的反應(yīng)溫度以37℃為宜，反應(yīng)時(shí)間以2小時(shí)為宜；所述的保存溫度以攝氏4℃為宜。
上述糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理、結(jié)合反應(yīng)、兩次清洗及洗脫反應(yīng)中，結(jié)合效率、回收率的檢測(cè)步驟包括1)測(cè)OD值(1)測(cè)糖結(jié)合蛋白的的預(yù)處理中，糖結(jié)合蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml的OD值為OD1；(1)測(cè)結(jié)合反應(yīng)中，連接有糖的微納米磁性微粒加入糖結(jié)合蛋白反應(yīng)后，磁性分離所棄上清液的OD值為OD2；(1)測(cè)兩次清洗反應(yīng)中，磁性分離所棄上清液的OD值分別為OD3、OD4；(1)測(cè)洗脫反應(yīng)中，所得富集純化的糖結(jié)合蛋白的OD值為OD5；2)計(jì)算結(jié)合效率％＝(OD1-OD2-OD3-OD4)/OD1；回收率％＝OD5/OD1。
一種富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特殊之處在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括1)糖與微納米磁性微粒偶聯(lián)(1)偶聯(lián)劑的活化①將偶聯(lián)劑溶解于有機(jī)溶劑中，配制成20～50mol/L的偶聯(lián)劑溶液；②按1∶10的物質(zhì)的量之比將環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒加入偶聯(lián)劑溶液中；③室溫下孵育2～4小時(shí)；所述的偶聯(lián)劑是含有一個(gè)氨基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑；(2)清洗磁性分離、棄上清；用乙醇清洗3次，再用pH5.6的緩沖液清洗3次；(3)偶聯(lián)加入2ml用pH5.6偶聯(lián)緩沖液配制的100mM的糖溶液，于攝氏35～40℃，溫育8～16小時(shí)，則糖被連接到環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上，得連接有糖的微納米磁性微粒；(4)清洗磁性分離、棄上清；用pH5.6的緩沖液清洗3次；(5)保存加入保存緩沖液，于2～6℃保存；2)對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化(1)糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理用水配制10mg/ml的糖結(jié)合蛋白，用結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml；(2)結(jié)合反應(yīng)取連接有糖的微納米磁性微粒于1號(hào)離心管中，加入0.5mg/ml的糖結(jié)合蛋白，于攝氏35～40℃反應(yīng)1～3小時(shí)，磁性分離、棄上清液；(3)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液1清洗，磁性分離、棄上清液；重復(fù)清洗一次；(4)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液2清洗，磁性分離、棄上清液；再重復(fù)清洗二次；(5)洗脫向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液3，清洗20～30分鐘，磁性分離、取上清液于2號(hào)離心管中；再重復(fù)清洗一次，取上清液合并于2號(hào)離心管中，得到富集純化的糖結(jié)合蛋白；(6)保存向1號(hào)離心管中加保存緩沖液，于2～6℃保存。
上述有機(jī)溶劑可采用二甲基甲酰胺或乙酸乙酯等；所述的偶聯(lián)劑可采用4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼等。
上述緩沖液及偶聯(lián)緩沖液可采用乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鹽或Tris-HCl等；所述的結(jié)合緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液等；所述清洗緩沖液1、2均為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH6.5的緩沖液等；所述的清洗緩沖液3為1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液等；所述的保存緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HCl pH6.0的緩沖液等。
上述偶聯(lián)劑的活化反應(yīng)中，環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒加入偶聯(lián)劑的孵育時(shí)間以3小時(shí)為宜；所述的結(jié)合反應(yīng)中的溫育溫度以攝氏37℃為宜，溫育時(shí)間以12小時(shí)為宜；所述的結(jié)合反應(yīng)中連接有糖的微納米磁性微粒加入糖結(jié)合蛋白的反應(yīng)溫度以37℃為宜，反應(yīng)時(shí)間以2小時(shí)為宜；所述的保存溫度以攝氏4℃為宜。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.利用糖的還原末端即半縮醛ROH，以糖苷鍵的形式共價(jià)偶聯(lián)到羥基(-OH)衍生化的微納米磁性微粒上，這樣固定化糖的連接方式簡(jiǎn)單、快速，且成本較低。
2.糖結(jié)合蛋白的生物活性穩(wěn)定，可在室溫條件下長(zhǎng)期保存生物活性不變。
3.對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化的效率高。


圖1、2分別為本發(fā)明的原理示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用了兩種方法對(duì)微納米磁性微粒進(jìn)行羥基(-OH)衍生化，將還原糖即單糖、寡糖或多糖還原末端的半縮醛ROH，以糖苷鍵的形式共價(jià)偶聯(lián)到羥基(-OH)衍生化的微納米磁性微粒上，利用這種固定在微納米磁性微粒上的糖特異地結(jié)合糖結(jié)合蛋白，對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。
參見(jiàn)圖1。實(shí)施例1是利用氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。由于氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒的表面含有一層氨基基團(tuán)，可與偶聯(lián)劑的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)活化的酸基共價(jià)偶聯(lián)，偶聯(lián)劑另一端的羥基(-OH)可與糖的1位醛基即還原末端發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成糖苷鍵，使糖以共價(jià)的方式連在微納米磁性微粒上，以對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。偶聯(lián)劑是含有一個(gè)羧基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑，如4-羥基苯基戊酸、16-羥基十六羧酸等。
實(shí)施例1的實(shí)現(xiàn)步驟如下1)糖與微納米磁性微粒偶聯(lián)(1)偶聯(lián)劑的活化①按1∶5∶5的物質(zhì)的量之比取偶聯(lián)劑4-羥基苯基戊酸、N-羥基琥珀酰亞胺與二環(huán)已基碳二亞胺，分別溶解于有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯、二甲基甲酰胺(DMF)等。
②先將4-羥基苯基戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺混合，全部溶解；再加入二環(huán)已基碳二亞胺混合；用乙酸乙酯定溶到25ml，使三者濃度分別為20mM、100mM和100mM。
③充氮?dú)獗Ｗo(hù)，于攝氏37℃，溫育12小時(shí)，有白色沉淀生成。
(2)氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒的預(yù)處理取15.58mg/ml的氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒于5ml離心管中，加入活化的4-羥基苯基戊酸的乙酸乙酯溶液的上清，比率1∶10；于攝氏37℃，溫育反應(yīng)5小時(shí)。
(3)清洗磁性分離，棄上清；用乙醇清洗3次，再用pH5.6的乙酸鈉緩沖液清洗3次。
(4)偶聯(lián)加入2ml用pH5.6的乙酸鈉緩沖液配制的100mM的D-甘露糖溶液，于攝氏37℃，溫育12小時(shí)，則糖被連接到氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上，得連接有糖的微納米磁性微粒。
(5)清洗磁性分離、棄上清。用pH5.6的乙酸鈉清洗緩沖液清洗3次。
(6)保存加入1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HCl pH6.0保存緩沖液，于4℃保存。
2)對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化(1)糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理用超純水配制10mg/ml的糖結(jié)合蛋白，用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml，測(cè)其OD值為OD1。配制糖結(jié)合蛋白的水還可使用高純水、離子水、純凈水等。
(2)結(jié)合反應(yīng)取0.5ml連接有糖的微納米磁性微粒于1.5ml的1號(hào)離心管中，加入300μl 0.5mg/ml的糖結(jié)合蛋白，如刀豆凝集素，于攝氏37℃反應(yīng)1～3小時(shí)。磁性分離、取上清于2號(hào)離心管中，測(cè)其OD值為OD2。
(3)清洗向1號(hào)離心管中加0.5ml的1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH6.5的清洗緩沖液1，于搖床上搖動(dòng)2分鐘，于磁性分離器上分離3分鐘，取上清液置于3號(hào)離心管中。重復(fù)清洗一次，測(cè)其OD值為OD3。
(4)清洗向1號(hào)離心管中加500μl的1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、10mMTris-HCl、pH6.5的清洗緩沖液2，清洗2分鐘，于磁性分離器上分離3分鐘，取上清置于4號(hào)離心管中。再重復(fù)清洗二次，測(cè)其OD值為OD4。清洗緩沖液1、2用于除去非特異性結(jié)合的蛋白。
(5)洗脫向1號(hào)離心管中加1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖(a-methyl mannose)、10mM Tris-HCl、pH7.0的清洗緩沖液3，清洗20～30分鐘。于磁性分離器上分離3分鐘，取上清置于5號(hào)離心管中。再重復(fù)清洗一次，上清合并于5號(hào)離心管中，即為富集純化的糖結(jié)合蛋白。測(cè)其OD值為OD5。
(6)效率的檢測(cè)結(jié)合效率％＝(OD1-OD2-OD3-OD4)/OD1；回收率％＝OD5/OD1。
(7)保存向1號(hào)離心管中加1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HClpH 6.0的保存緩沖液，于4℃保存。
該連連接有糖的微納米磁性微粒可重復(fù)使用，富集純化糖蛋白的次數(shù)至少為10次。
用SDS-PAGE電泳檢測(cè)富集純化的糖結(jié)合蛋白。
洗液清洗緩沖液3中有α-甲基甘露糖，其與刀豆凝集素的特異結(jié)合能力要比D-甘露糖與刀豆凝集素特異結(jié)合能力強(qiáng)。在此發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，而將刀豆凝集素洗下。具體是向5號(hào)離心管中加入1ml的10mM Tris-HCl pH2.0的分離緩沖液1，于攝氏25℃在搖床上搖動(dòng)30分鐘，所有溶液裝入透析袋中用1L水于攝氏4℃透析過(guò)2h后，換水重復(fù)透析三次。
參見(jiàn)圖2。實(shí)施例2是利用環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。由于環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒表面含有一層環(huán)氧乙烷基團(tuán)，可與偶聯(lián)劑的的氨基共價(jià)偶聯(lián)；偶聯(lián)劑另一端的羥基(-OH)可與糖的1位醛基即還原末端發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成糖苷鍵，使糖以共價(jià)的方式連在微納米磁性微粒上。以對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。偶聯(lián)劑是含有一個(gè)氨基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑，如4-羥基苯甲酰胺、4-羥基丁酸肼等。
實(shí)施例2的實(shí)現(xiàn)步驟如下1)糖與微納米磁性微粒的偶聯(lián)(1)偶聯(lián)劑的活化①將偶聯(lián)劑4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼溶解于有機(jī)溶劑中，配制成20～50mol/L的偶聯(lián)劑溶液。有機(jī)溶劑可采用二甲基甲酰胺(DMF)或乙酸乙酯等。
②按1∶10的物質(zhì)的量之比將環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒加入偶聯(lián)劑溶液中。
③室溫下孵育3小時(shí)。
(2)清洗磁性分離、棄上清。用乙醇清洗3次，再用pH5.6的乙酸鈉清洗緩沖液清洗3次。
(3)偶聯(lián)加入2ml用pH5.6的乙酸鈉緩沖液配制的100mM的D-甘露糖溶液，于攝氏37℃，溫育12小時(shí)，則糖被連接到環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上，得連接有糖的微納米磁性微粒。
(4)清洗磁性分離、棄上清。用pH5.6的乙酸鈉清洗緩沖液清洗3次。
(5)保存加入1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HCl pH6.0的保存緩沖液，于4℃保存。
2)對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括1)糖與微納米磁性微粒偶聯(lián)(1)偶聯(lián)劑的活化①按1∶5∶5的物質(zhì)的量之比取偶聯(lián)劑4-羥基苯基戊酸、N-羥基琥珀酰亞胺與二環(huán)己基碳二亞胺，分別溶解于有機(jī)溶劑中；②先將4-羥基苯基戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺混合；再加入二環(huán)己基碳二亞胺混合；用有機(jī)溶劑溶到使三者濃度分別為20mM、100mM和100mM；③于攝氏35～40℃，溫育8～16小時(shí)；所述的偶聯(lián)劑是含有一個(gè)羧基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑；(2)氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒的預(yù)處理取氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒于離心管中，加入活化的4-羥基苯基戊酸溶液的上清，物質(zhì)的比為1∶10；于攝氏35～40℃，溫育4～6小時(shí)；(3)清洗磁性分離，棄上清；用乙醇清洗3次，再用緩沖液清洗3次；(4)偶聯(lián)加入2ml用偶聯(lián)緩沖液配制的100mM的糖溶液，于攝氏35～40℃，溫育8～16小時(shí)，糖被連接到氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上，得連接有糖的微納米磁性微粒；(5)清洗磁性分離、棄上清，用緩沖液清洗3次；(6)保存加入保存緩沖液，于2～6℃保存；2)對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化(1)糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理用水配制10mg/ml的糖結(jié)合蛋白，用結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml；(2)結(jié)合反應(yīng)取連接有糖的微納米磁性微粒于1號(hào)離心管中，加入0.5mg/ml的糖結(jié)合蛋白，于攝氏35～40℃反應(yīng)1～3小時(shí)，磁性分離、棄上清液；(3)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液1清洗，磁性分離、棄上清液；重復(fù)清洗一次；(4)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液2清洗，磁性分離、棄上清液；再重復(fù)清洗二次；(5)洗脫向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液3，清洗20～30分鐘，磁性分離、取上清液于2號(hào)離心管中；再重復(fù)清洗一次，取上清液合并于2號(hào)離心管中，得到富集純化的糖結(jié)合蛋白；(6)保存向1號(hào)離心管中加保存緩沖液，于2～6℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯或二甲基甲酰胺；所述的偶聯(lián)劑為4-羥基苯基戊酸或16-羥基十六羧酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述的緩沖液及偶聯(lián)緩沖液為乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鹽或Tris-HCl；所述的結(jié)合緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液；所述清洗緩沖液1、2均為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH6.5的緩沖液等；所述的清洗緩沖液3為1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液等；所述的保存緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HCl pH6.0的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑的活化反應(yīng)中，溫育時(shí)充有氮?dú)獗Ｗo(hù)氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑的活化反應(yīng)中，溫育溫度為攝氏37℃，溫育時(shí)間為12小時(shí)；所述氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒的預(yù)處理中，溫育溫度為攝氏37℃，溫育時(shí)間為5小時(shí)；所述的結(jié)合反應(yīng)中，溫育溫度為攝氏37℃，溫育時(shí)間為12小時(shí)；所述的結(jié)合反應(yīng)中連接有糖的微納米磁性微粒加入糖結(jié)合蛋白的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)；所述的保存溫度為攝氏4℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理、結(jié)合反應(yīng)、兩次清洗及洗脫反應(yīng)中，結(jié)合效率、回收率的檢測(cè)步驟包括1)測(cè)OD值(1)測(cè)糖結(jié)合蛋白的的預(yù)處理中，糖結(jié)合蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml的OD值為OD1；(1)測(cè)結(jié)合反應(yīng)中，連接有糖的微納米磁性微粒加入糖結(jié)合蛋白反應(yīng)后，磁性分離所棄上清液的OD值為OD2；(1)測(cè)兩次清洗反應(yīng)中，磁性分離所棄上清液的OD值分別為OD3、OD4；(1)測(cè)洗脫反應(yīng)中，所得富集純化的糖結(jié)合蛋白的OD值為OD5；2)計(jì)算結(jié)合效率％＝(OD1-OD2-OD3-OD4)/OD1；回收率％＝OD5/OD1。
7.一種富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括1)糖與微納米磁性微粒偶聯(lián)(1)偶聯(lián)劑的活化①將偶聯(lián)劑溶解于有機(jī)溶劑中，配制成20～50mol/L的偶聯(lián)劑溶液；②按1∶10的物質(zhì)的量之比將環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒加入偶聯(lián)劑溶液中；③室溫下孵育2～4小時(shí)；所述的偶聯(lián)劑是含有一個(gè)氨基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑；(2)清洗磁性分離、棄上清；用乙醇清洗3次，再用pH5.6的緩沖液清洗3次；(3)偶聯(lián)加入2ml用pH5.6偶聯(lián)緩沖液配制的100mM的糖溶液，于攝氏35～40℃，溫育8～16小時(shí)，則糖被連接到環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上，得連接有糖的微納米磁性微粒；(4)清洗磁性分離、棄上清；用pH5.6的緩沖液清洗3次；(5)保存加入保存緩沖液，于2～6℃保存；2)對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化(1)糖結(jié)合蛋白的預(yù)處理用水配制10mg/ml的糖結(jié)合蛋白，用結(jié)合緩沖液稀釋至0.5mg/ml；(2)結(jié)合反應(yīng)取連接有糖的微納米磁性微粒于1號(hào)離心管中，加入0.5mg/ml的糖結(jié)合蛋白，于攝氏35～40℃反應(yīng)1～3小時(shí)，磁性分離、棄上清液；(3)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液1清洗，磁性分離、棄上清液；重復(fù)清洗一次；(4)清洗向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液2清洗，磁性分離、棄上清液；再重復(fù)清洗二次；(5)洗脫向1號(hào)離心管中加清洗緩沖液3，清洗20～30分鐘，磁性分離、取上清液于2號(hào)離心管中；再重復(fù)清洗一次，取上清液合并于2號(hào)離心管中，得到富集純化的糖結(jié)合蛋白；(6)保存向1號(hào)離心管中加保存緩沖液，于2～6℃保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺或乙酸乙酯；所述的偶聯(lián)劑為4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述的緩沖液及偶聯(lián)緩沖液為乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鹽或Tris-HCl；所述的結(jié)合緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液；所述清洗緩沖液1、2均為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH6.5的緩沖液等；所述的清洗緩沖液3為1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液等；所述的保存緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris-HCl pH6.0的緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑的活化反應(yīng)中，環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒加入偶聯(lián)劑的孵育時(shí)間為3小時(shí)；所述的結(jié)合反應(yīng)中的溫育溫度為攝氏37℃，溫育時(shí)間為12小時(shí)；所述的結(jié)合反應(yīng)中連接有糖的微納米磁性微粒加入糖結(jié)合蛋白的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)；所述的保存溫度為攝氏4℃。
全文摘要
一種富集和純化糖結(jié)合蛋白的方法，其糖與微納米磁性微粒偶聯(lián)是活化偶聯(lián)劑，將糖連接到氨基基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上或環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的微納米磁性微粒上。對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化是加入連接有糖的微納米磁性微粒和先預(yù)處理的糖結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，清洗、洗脫，得到富集純化的糖結(jié)合蛋白。本發(fā)明解決了背景技術(shù)中方法復(fù)雜，使用不便，回收率較低的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明固定化糖的連接方式簡(jiǎn)單、快速，且成本較低。糖結(jié)合蛋白的生物活性穩(wěn)定，對(duì)糖結(jié)合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化的效率高。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1958600SQ20051009627
公開(kāi)日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者李錚, 陳超, 楊剛龍, 崔亞麗, 惠文利 申請(qǐng)人:陜西西大北美基因股份有限公司