專利名稱：麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程藥物制備領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺 激素釋放激素六聚體(GnRH6)的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasinghormone, GnRH),又稱促黃 體素釋放激素(Luteinizing hormone releasing hormone, LHRH)、促性腺釋放因子 (Gonadotropin-releasing factor, GnRF)，是由動物下丘腦分泌的一種十肽激素，其主要 生物學(xué)功能是控制腦下垂體前葉細(xì)胞合成和分泌促黃體激素(LH)及促卵泡激素(FSH)。促性腺激素釋放激素(GnRH)不但通過影響垂體促黃體生成激素(Luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的分泌，調(diào)節(jié)性腺功能， 而且還直接作用于性腺。但促性腺激素釋放激素(GnRH)對性腺的直接作用是抑制性的。在 鼠等動物發(fā)現(xiàn)，卵巢和睪丸上均存在促性腺激素釋放激素(GnRH)受體，促性腺激素釋放激 素(GnRH)可直接與這些受體結(jié)合，對生殖功能有抑制作用，所以通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄕ{(diào)控促性 腺激素釋放激素(GnRH)的分泌或干擾其功能，就能夠達(dá)到控制動物生殖器官發(fā)育和生殖功 能的目的。促性腺激素釋放激素(GnRH)免疫雄性動物可以使幼齡雄性動物睪丸停止發(fā)育 和成年雄性動物睪丸退化。用促性腺激素釋放激素(GnRH)免疫動物后，機體產(chǎn)生大量的抗 促性腺激素釋放激素(GnRH)的特異性抗體，與內(nèi)源性的促性腺激素釋放激素(GnRH)結(jié)合 使其失去生物活性，從而導(dǎo)致下丘腦_垂體_睪丸軸功能的破壞，抑制垂體促黃體生成激素 和卵泡刺激素的釋放，使被免疫的動物表現(xiàn)睪丸萎縮和重量減輕、血清睪酮水平下降。近年 來，國內(nèi)外學(xué)者在多種動物上用促性腺激素釋放激素(GnRH)主動免疫的方法使動物體內(nèi)產(chǎn) 生抗體以中和內(nèi)源的促性腺激素釋放激素(GnRH)，取得了一定的效果。這種免疫去勢方法 簡便，安全性高，可替代傳統(tǒng)手術(shù)去勢，控制動物性行為和繁殖能力，達(dá)到改善動物肉質(zhì)，促 進(jìn)動物生長，提高飼料利用率。目前合成促性腺激素釋放激素(GnRH)疫苗采用化學(xué)合成法，即將促性腺激素釋放 激素(GnRH)偶聯(lián)到一些載體蛋白上。但是化學(xué)合成法促性腺激素釋放激素(GnRH)與載體 蛋白的連接效率低，造成生產(chǎn)疫苗的成本增加，價格昂貴。另外，通過化學(xué)法合成的GnRH疫 苗，每一批次激素抗原的分子結(jié)構(gòu)很難保證是完全相同的，這就導(dǎo)致商業(yè)化生產(chǎn)時，批次間 差異較大。而通過基因工程法生產(chǎn)促性腺激素釋放激素(GnRH)疫苗可克服化學(xué)合成法的不 足，利用可操縱的表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))生產(chǎn)促性腺激素釋放激素(GnRH)疫苗， 表達(dá)量高，提取工藝簡便，這樣才能最終將促性腺激素釋放激素(GnRH)疫苗推向市場。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種生產(chǎn)麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺激素釋放激素六聚體 發(fā)酵優(yōu)化工藝，篩選出最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件，進(jìn)而達(dá)到外源目的蛋白高效表 達(dá)。
本發(fā)明麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的發(fā)酵工藝包括以下操作 步驟
(1)平板菌種的準(zhǔn)備
將大腸埃希氏菌-TBI (GnRH6-E. coli TBI)劃線接種于抗氨芐LB培養(yǎng)基平板，在溫度 37°C條件下培養(yǎng)24小時，得平板菌種作為原始種子；
(2)種子液的制備
將所述平板菌種直接接種于100 mL的液體培養(yǎng)基，裝液系數(shù)為0. 2，在溫度為37°C、搖 瓶轉(zhuǎn)速為200 rpm條件下培養(yǎng)16小時，得種子液；
所述液體培養(yǎng)基包括下列重量配比的原料葡萄糖2 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白 胨16 g/L，氯化鈉5 g/L，氨芐青霉素100 mg/L ；
(3)10L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
取步驟2獲得的種子液，按照3%的接種量接種于10 L發(fā)酵罐內(nèi)的2 L發(fā)酵培養(yǎng)基上， 在溫度為37°C，通氣量為8 L/min,轉(zhuǎn)速為500 rpm,用濃度lmol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH 值為7.0，培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0.3 mmol/L的異丙基硫代-0-0半乳糖(1 16)，溫度為 32°C，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，得誘導(dǎo)表達(dá)的菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方與液體培養(yǎng)基配方相同；
(4)麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺激素釋放激素六聚體的分離純化
將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體在溫度4°C、轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下，離心分離20 min,棄去上清 液，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體重新懸浮于磷酸鹽緩沖液中，在溫度-70°C冷凍菌液或于-20°C冷凍 菌液2(Γ24小時，再將其放于冰水上融化，將其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超聲波 細(xì)胞破碎儀，在電壓200V、工作4s，間隔3s條件下，以工作30次的方式破碎；在溫度4°C、 轉(zhuǎn)速12000 r/min條件下，離心分離20 min，取上清液即為粗提物；將粗提物進(jìn)行多糖樹 脂(amylose resin)親和層析分離提純，得到目的蛋白濃度可達(dá)1. 97 g/L的麥芽糖結(jié)合蛋 白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)。所述抗氨芐LB培養(yǎng)基平板中含100 yg/mL氨芐青霉素。本發(fā)明所指工程菌即促性腺激素釋放激素六聚體的大腸埃希氏菌-TB1，它可以表 達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體。麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素 六聚體與佐劑混合可直接應(yīng)用于動物去勢，而且與目前市場上的其他類似制劑相比，成本 較低，同時麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體安全、方便、作用效果溫和，與手 術(shù)去勢方法相比，可減少感染、應(yīng)激等優(yōu)點。且基因工程大腸桿菌易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有進(jìn) 一步研發(fā)的價值和良好的產(chǎn)業(yè)化前景。本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面
(1)通過在基因工程菌培養(yǎng)過程中控制溫度，誘導(dǎo)時機，誘導(dǎo)劑濃度等，優(yōu)化各項條件， 大大提高了促性腺激素釋放激素六聚體大腸埃希氏菌-TBl產(chǎn)麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激 素釋放激素六聚體的表達(dá)量。采用本發(fā)明的方法，麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素 六聚體的表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的359Γ50%，發(fā)酵所得菌液中麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激 素釋放激素六聚體的濃度平均可達(dá)1. 97 g/L。(2)通過本發(fā)明獲得麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體，發(fā)酵時間短， 從接種到發(fā)酵結(jié)束僅需要纊11小時。
(3)通過本發(fā)明獲得麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體大大降低了生 產(chǎn)成本。利用本發(fā)明所得的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體制備免疫去勢疫 苗，按照每頭豬兩針的劑量，完成免疫去勢，僅需10元人民幣，而目前國內(nèi)市場尚無此類產(chǎn) 品，國外輝瑞公司生產(chǎn)的免疫去勢疫苗目前每支約5美元。(4)通過本發(fā)明獲得的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體使用方便， 可直接用于肌肉注射，操作簡單易行。


圖1為重組蛋白的蛋白免疫印跡(Western blot)分析圖。圖2為小鼠睪丸組織學(xué)變化圖；圖2中A、C，實驗組；B、D，對照組；a，精原細(xì)胞；b， 精母細(xì)胞；c，精子細(xì)胞；d，精子；e，空泡變性；f，生精小管。圖3為免疫組和對照組睪丸圖。圖4對照組(a、c)和MBP_GnRH6免疫組(b、d)公豬睪丸組織學(xué)觀察圖；圖4中 a, b 睪丸組織整體結(jié)構(gòu)，ST指生精小管；短箭頭精原細(xì)胞；長箭頭初級精母細(xì)胞；橢圓 形精子細(xì)胞；正方形精子。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。以下實施例所用原料為市場采購產(chǎn)品
氨芐青霉素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 葡萄糖和IPTG購自索萊寶科技有限公司 蛋白胨和酵母提取物購自北京朋利馳科技有限公司
以下實施例中，麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)表達(dá)量測
定
將實施例中步驟(3)所得的誘導(dǎo)表達(dá)的菌體首先進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 電泳(SDS-PAGE)，再用條帶掃描軟件(bandscan 5. 0)測出麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋 放激素六聚體(MBP-GnRH6)占菌體總蛋白的百分含量。麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)濃度的測定
將實施例中步驟(4)所得的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體 (MBP-GnRH6)，用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)濃度。以下實施例中，用于發(fā)酵生產(chǎn)麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體 (MBP-GnRH6)的促性腺激素釋放激素六聚體重組的大腸埃希氏菌-TBI (GnRH6_E. coli TBI) 由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖胚胎工程實驗室提供。大腸埃希氏菌Escherichia coli保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No 3601 ； 保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期2010年01月20日。實施例
麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的發(fā)酵工藝包括以下操作步驟 (1)平板菌種的制備
劃線接種大腸埃希氏菌-TBI (GnRH6-E. coli TBI)于含100 μ g/mL Amp氨芐青霉素的抗氨芐LB培養(yǎng)基平板上，在溫度為37°C條件下培養(yǎng)24小時，得平板菌種作為原始種子；
(2)種子液的制備
挑步驟1中所得原始種子單菌落于500mL三角瓶的100 mL液體培養(yǎng)基上，裝液100 mL (裝液系數(shù)為0. 2)，在溫度為37°C、搖瓶轉(zhuǎn)速為200 rpm條件下培養(yǎng)16 h，得種子液；
液體培養(yǎng)基包括下列重量配比的原料葡萄糖2 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨16 g/L，氯化鈉5 g/L，氨芐青霉素100 mg/L ；
(3)10L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵放大工藝發(fā)酵促性腺激素釋放激素六聚體大腸埃希氏菌-TBl表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋 白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)，具體過程如下
取步驟2獲得的種子液，按照3%的接種量接種于10 L發(fā)酵罐的2 L發(fā)酵培養(yǎng)基上， 裝液2 L (裝液系數(shù)為0.2)，在溫度為37°C，通氣量為8 L/min，轉(zhuǎn)速為500 rpm，用濃度 lmol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為7.0，培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0.3 mmol/L的異丙基硫 代-β-D半乳糖(IPTG)，同時將誘導(dǎo)溫度設(shè)為32°C，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，發(fā)酵結(jié)束，得誘導(dǎo)表 達(dá)的菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方與液體培養(yǎng)基配方相同；
(4)麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺激素釋放激素六聚體的分離純化
取步驟3誘導(dǎo)表達(dá)的菌體于溫度4°C、轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下，離心分離20 min，棄去 上清液，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體重新懸浮于柱緩沖液中，在_70°C冷凍菌液或于-20°C冷凍菌液 2(Γ24小時，再將其放于冰水上融化后，將其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超聲波細(xì)胞 破碎儀，按照電壓200V，工作4s，間隔3s，工作30次的方式破碎；超聲破碎后于溫度4°C、轉(zhuǎn) 速12000 r/min條件下，離心分離20 min，取上清液即為粗提物。然后將粗提物進(jìn)行多糖樹 脂(amylose resin)親和層析分離提純，得到目的蛋白濃度可達(dá)1. 97 g/L的麥芽糖結(jié)合蛋 白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)；
(5)促性腺激素釋放激素六聚體大腸埃希氏菌-TBl發(fā)酵生產(chǎn)的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性 腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)的反應(yīng)原性和免疫去勢效果檢測
A、麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)反應(yīng)原性鑒定
將發(fā)酵產(chǎn)生的麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)進(jìn)行純化處 理，經(jīng)蛋白免疫印跡(Western blot)檢測顯示，可與GnRH抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，其分子量 大小為50kDa，見圖1。圖1中條帶1表示麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺激素釋放激素六聚體 (MBP-GnRH6)與GnRH抗體反應(yīng)條帶；條帶2為磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對照，沒有特異性 條帶產(chǎn)生；條帶3為標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)。由此可見，研制出的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺 激素釋放激素六聚體與GnRH抗體具有良好的反應(yīng)原性；
B、麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)對小鼠的免疫去勢效果
監(jiān)測
20只20日齡的雄性昆明系小鼠，隨機分為兩組試驗組和對照組，每組10只。試驗 組小鼠頸部皮下4個位點注射純化后的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體 (MBP-GnRH6)(純度為97%)，125 ？ L/只，對照組小鼠注射麥芽糖結(jié)合蛋白。每隔1周免疫 1次，共免疫3次。免疫結(jié)束后取睪丸組織，進(jìn)行組織切片觀察，如圖2。實驗組小鼠的睪丸 組織發(fā)生明顯空泡變性(圖2，A)。空泡變性的小鼠睪丸生精小管變化明顯，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及精子細(xì)胞層次不分明，且無精子產(chǎn)生(圖2，B)。對照組小鼠的睪丸生精小管結(jié)構(gòu)正 常，生精小管中有正常的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子，并且層次分明，有大量精子 產(chǎn)生(圖2，C、D)?？梢姡溠刻墙Y(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)抑制 小鼠睪丸的發(fā)育，最終發(fā)生萎縮，說明研制出的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六 聚體(MBP-GnRH6)具有很強的免疫原性；
C、麥芽糖結(jié)合蛋白-GnRH6對公豬的免疫去勢效果檢測
24頭初生公豬隨機分為對照組和試驗組，實驗組公豬分別在9周齡和17周齡免疫注 射。稱取麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6) 12mg溶于12mL生理 鹽水，再同12mL的Al (OH)3佐劑充分混勻后給每頭試驗組公豬頸部肌肉注射2mL;對照組 注射相同劑量的麥芽糖結(jié)合蛋白與Al (OH)3佐劑的混合物。所有公豬相同飼養(yǎng)管理，24周 齡屠宰。結(jié)果表明，麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)主動免疫 的公豬屠宰時睪丸重量與大小極顯著地低于對照組(圖3)。表明麥芽糖結(jié)合蛋白_促性腺 激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)主動免疫可使公豬睪丸重量降低、睪丸萎縮，組織學(xué)切片 顯示，免疫組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞發(fā)育不良，生精小管中無精子，MBP-GnRHB主動免疫 可顯著破壞睪丸間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，降低了生精細(xì)胞的數(shù)目(圖4)。這表明研制出的麥芽糖結(jié) 合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)主動免疫公豬具有很好的去勢作用。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原 則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的發(fā)酵工藝，其特征在于包括以下操 作步驟(1)平板菌種的準(zhǔn)備將大腸埃希氏菌-TBI (GnRH6-E. coli TBI)劃線接種于抗氨芐LB培養(yǎng)基平板，在溫度 37°C條件下培養(yǎng)M小時，得平板菌種作為原始種子；(2)種子液的制備將所述平板菌種直接接種于100 mL的液體培養(yǎng)基，裝液系數(shù)為0. 2，在溫度為37°C、搖 瓶轉(zhuǎn)速為200 rpm條件下培養(yǎng)16小時，得種子液；所述液體培養(yǎng)基包括下列重量配比的原料葡萄糖2 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白 胨16 g/L，氯化鈉5 g/L，氨芐青霉素100 mg/L ；(3)10L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)取步驟2獲得的種子液，按照3%的接種量接種于10 L發(fā)酵罐內(nèi)的2 L發(fā)酵培養(yǎng)基上， 在溫度為37°C，通氣量為8 L/min,轉(zhuǎn)速為500 rpm,用濃度lmol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH 值為7.0，培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0.3 mmol/L的異丙基硫代-0-0半乳糖(1 16)，溫度為 32°C，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，得誘導(dǎo)表達(dá)的菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方與液體培養(yǎng)基配方相同；(4)麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的分離純化將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體在溫度4°C、轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下，離心分離20 min,棄去上清 液，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體重新懸浮于磷酸鹽緩沖液中，在溫度_70°C冷凍菌液或于_20°C冷凍 菌液2014小時，再將其放于冰水上融化，將其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超聲波 細(xì)胞破碎儀，在電壓200V、工作4s，間隔3s條件下，以工作30次的方式破碎；在溫度4°C、 轉(zhuǎn)速12000 r/min條件下，離心分離20 min，取上清液即為粗提物；將粗提物進(jìn)行多糖樹 脂(amylose resin)親和層析分離提純，得到目的蛋白濃度可達(dá)1. 97 g/L的麥芽糖結(jié)合蛋 白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的發(fā)酵工藝， 其特征在于所述抗氨芐LB培養(yǎng)基平板中含100 μ g/mL氨芐青霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體的發(fā)酵工藝，該工藝包括以下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基包括酵母浸出物、蛋白胨、NaCl等組成，發(fā)酵工藝的優(yōu)化包括培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)后培養(yǎng)時間、發(fā)酵液酸堿度的調(diào)節(jié)方式、攪拌速率、通氣量等。本發(fā)明的發(fā)酵工藝生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)周期短，只需要9-11小時，同時，還提高了單位菌體的目的蛋白表達(dá)量，實現(xiàn)了目的蛋白的高效表達(dá)。本發(fā)明制得的麥芽糖結(jié)合蛋白-促性腺激素釋放激素六聚體(MBP-GnRH6)可用于各種哺乳動物的免疫去勢。
文檔編號C12P21/02GK102071238SQ20101056058
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者丁淑荃, 劉亞, 孫志輝, 方富貴, 曹鴻國, 王索路, 章孝榮, 蘇時萍, 陶勇 申請人:合肥博大牧業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司, 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)