專利名稱：腸激酶輕鏈基因的合成及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的牛腸激酶輕鏈蛋白，其關(guān)鍵是腸激酶輕鏈 基因的克隆以及產(chǎn)物的發(fā)酵表達(dá)與分離純化。重組表達(dá)的腸激酶，作為工具蛋白酶用于融 合蛋白的特異性切割，尤其適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研
背景技術(shù)：
腸激酶(Enterokinase)是存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的一種絲氨酸蛋白 酶，最早由Sch印owalnickow于1899年在Pavlov的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)(The Journal of BiologicalChemistry, Vol. 246，August 25，1971，PP. 5031-5039.)。1939 年，Kunitz 證實(shí) 了腸激酶是一種胰蛋白酶原激活劑(J Gen Physiol,March 30，1939)。迄今為止已從人、鼠、豬、牛等身上純化出天然的腸激酶，其中以牛腸激酶的理化 性質(zhì)研究的最為透徹。牛的腸激酶分子量為150KD，由一條115KD的重鏈(結(jié)構(gòu)亞基)和一 條35KD的輕鏈(催化亞基)以一個(gè)二硫鍵連接而成，在pH值4. 5-9. 5、4_45°C范圍內(nèi)特異性 水解蛋白底物，主要機(jī)理為重鏈把輕鏈附著在腸粘膜刷狀緣上并朝向腸腔，輕鏈基團(tuán)能特 異性識(shí)別胰蛋白酶原中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其C端水解肽鏈，釋放出活性胰蛋 白酶。1984年，Light A和Rmseca P證實(shí)牛腸激酶輕鏈仍具有全酶所具有的特異性切割 活性(Light A,Fonseca P. The Journal of Biological Chemistry, 1984，13195—13198.)。目前許多具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值的藥用蛋白質(zhì)和多肽，如抗骨質(zhì)疏松藥物重組人甲狀 旁腺素(rhPTHl-34)、腫瘤壞死因子-β、磷脂酶Α2、白細(xì)胞介素-11等，均采用融合蛋白 表達(dá)，工藝要求用蛋白酶切割融合蛋白，釋放出目的蛋白，這為腸激酶提供了廣闊的市場(chǎng)空 間。但天然腸激酶來(lái)源有限，并且從動(dòng)物組織提取的腸激酶污染有其他蛋白酶，這給實(shí)際應(yīng) 用帶來(lái)了困難。這就要求用基因工程方法生產(chǎn)高純度的腸激酶。基因工程方法生產(chǎn)的高純 度腸激酶活性與天然酶相似，但比天然腸激酶切割速率更快。牛腸激酶輕鏈EKl有4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，為保證二硫鍵的正確折疊，以Ε. coli作 為宿主菌表達(dá)EKl通常采用融合DsbA、thioredoxin等方法使得表達(dá)的腸激酶有活性。La Vallie等在E. coli中，融合表達(dá)促二硫鍵形成伴侶蛋白DsbA與EKl。將牛EKl 的cDNA序列以編碼EK的特異性識(shí)別位點(diǎn)的序列與DsbA序列3 ’端相連，通過(guò)自切割加工 就可以得到有活性的 rEKjThe Journal of Biological Chemistry，1993，268 :23311.)。 (Casparian等將EKcDNA序列融合在pET32 a Trx下游，在BL21 (DE3)中表達(dá)得到融合蛋白， 但無(wú)自切割活性，需要通過(guò)蛋白復(fù)溶和蛋白復(fù)性從包涵體中獲得了有活性的重組腸激酶催 化亞基(Protein ExprPurif, 2003, 31 :13)。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn) 行翻譯后修飾，保證表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。同時(shí)，避免了采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)引入內(nèi)毒素 的潛在危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種腸激酶專用編碼基因，它能夠通過(guò)分泌表達(dá)的方式進(jìn) 行大量生產(chǎn)，且具有較高的生物學(xué)活性。包括以下幾個(gè)步驟(1)腸激酶輕鏈基因的合成根據(jù)Genebank中公開的牛腸激酶輕鏈EKl核酸序 列(AY682203)(序列表序列1，簡(jiǎn)稱SEQ-1)和氨基酸序列(序列表序列2，簡(jiǎn)稱SEQ-2)，選 擇畢赤酵母偏好的密碼子，人工合成牛腸激酶輕鏈EKl的基因序列3 (序列表序列3，簡(jiǎn)稱 SEQ-3)。(2)表達(dá)載體的構(gòu)建在EKl基因序列SEQ-3的5，端加入Bio I位點(diǎn)，在Β ο I 位點(diǎn)和EKl基因序列間加入KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，確保EKl 蛋白分泌到發(fā)酵液中時(shí)能夠切除α-信號(hào)肽，在3’端加入TGA終止密碼子以及Not I位 點(diǎn)，將DNA片段和pPICZ α A載體經(jīng)Β ο I與Not I雙酶切、電泳回收、連接，構(gòu)建表達(dá)載體 pPICZ α A-ffiL。(3)rEKL表達(dá)菌株用&ic I或BstX 1線性化？？扣20々41^，電轉(zhuǎn)至乂-33或65115 感受態(tài)中，根據(jù)hvitrogen手冊(cè)進(jìn)行單克隆的鑒定和高表達(dá)菌株的篩選。(4)rEKL工程菌的發(fā)酵所述編碼基因電轉(zhuǎn)至畢赤酵母菌發(fā)酵表達(dá)的優(yōu)選方法為 16L發(fā)酵罐體系中，30°C，pH4. 0-6. 0，更優(yōu)的為pH5. 0，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-1 后，按 2. 5ml/min流加50%甘油約600ml，饑餓0. 2 0. 3h，菌體濕重為180_200g/L時(shí)開始甲醇 誘導(dǎo)，優(yōu)化的誘導(dǎo)PH為4. 0-5. 0，最優(yōu)誘導(dǎo)pH為4. 0，前1 誘導(dǎo)期內(nèi)共流加入10_20g甲 醇，加用少量山梨醇。穩(wěn)定誘導(dǎo)期內(nèi)按anl/min加入含有體積微量金屬鹽培養(yǎng)基(PTMl) 的甲醇誘導(dǎo)60-7池，每1 加入5g大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為甘油 40g/L, K2SO4 17. 5g/L, MgS0414g/L, KOH 3. 2g/L, CaSO4 0. 8g/L, PTMl 3ml/L。^rEKL蛋白的表達(dá)純化發(fā)酵上清經(jīng)PALL CentramateTM超濾系統(tǒng)置換緩沖液， 置換溶液為20-50mM Tris-HCl或者PBS緩沖液pH 7. 5-8. 5，NaCl濃度為0_50mM，膜包 選擇為漲分子量，面積為0.1m2。超濾后的溶液經(jīng)A液(緩沖液)20-50mM Tris-HCl或 者PBS緩沖液pH 7.5-8.5，NaCl濃度為0_50mM平衡過(guò)的陰離子層析填料(并不僅限于 Q FF 或 Capto Q)，B 液50_100mM Tris-HCl 或者 PBS 緩沖液 pH 7. 5-8. 5，NaCl 濃度為 100-500mM，洗脫 5-10 個(gè)柱體積。洗脫溶液經(jīng) 20_50mM Tris-HCl 0-150mM NaCl O-IOmM CaCl2 ρΗ7· 5_8· 5 平衡過(guò)白勺 Trypsin Inhibitor agarose (Sigma)或者 trypsin—Sepharose 4B(GE)層析柱料，B 液:50-200mM HAc-NaAc 或甲酸-甲酸鈉、I-IOmM CaCl2, ρΗ3· 0-4. 0 洗 脫 5-10 個(gè)柱體積。成品置換入 20mM Tris-HCl (pH7. 4)、50mM NaCl、2mM CaCl2 緩沖液中， 分裝保存。本發(fā)明選擇畢赤酵母偏好密碼子，人工合成了 EKl全長(zhǎng)基因序列，將該基因構(gòu)建到 畢赤酵母表達(dá)載體PPICZ α A上進(jìn)行分泌表達(dá)，成功的表達(dá)出具有較高生物學(xué)活性的rEKp 通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程中的一系列條件，如優(yōu)化了誘導(dǎo)階段的PH，前期誘導(dǎo)采用山梨醇與甲醇 混加，同時(shí)每隔1 加入一定量的酸水解酪蛋白，充當(dāng)酶解底物，減少在發(fā)酵上清中的 降解。通過(guò)優(yōu)化純化參數(shù)與選擇最適的介質(zhì)材料，純化后產(chǎn)量達(dá)到2 X 106U/L, 一個(gè)單 位(U)定義為 23°C和 20mM Tris-HCl (pH7. 4)、50mM NaCl、2mM CaCl2 緩沖液中，16 小時(shí)切 割50μ g融合蛋白所需要的酶量，表達(dá)量適合規(guī)?；a(chǎn)。


圖1 牛腸激酶輕鏈EKl基因重疊PCR-酶切合成示意圖。圖2 牛腸激酶輕鏈EKl不同誘導(dǎo)時(shí)間段發(fā)酵上清酶切結(jié)果圖。泳道1為誘導(dǎo)36h， 泳道2為誘導(dǎo)48h，泳道3為誘導(dǎo)60h,泳道4為誘導(dǎo)72h，M為蛋白Marker(Invitrogen)。 圖3 牛腸激酶輕鏈EKl純化SDS-PAGE電泳圖。M.蛋白Marker (Invitrogen) ；1.發(fā)酵上 清超濾濃縮后；2. QFF流穿；3. QFF洗脫；4. Trypsin親和流穿；5. Trypsin親和洗脫。圖4 不同酶量的牛腸激酶輕鏈tEKl酶切效果圖。底物量相同，M.蛋白Markeranvitrogen)； 1.加入 1/64U rEKL ；2.加入 1/32U rEKL ；3.加入 1/16U rEKL ；4.加入 1/8U rEKL ；5.加入 l/4UrEKL ；6.加入 1/2U rEKL ；7.加入 IU rEKL。
具體實(shí)施例方式一、重組腸激酶表達(dá)載體pPICZ a A-EKl的構(gòu)建1.重組腸激酶基因的人工合成根據(jù)Genebank中公開的牛腸激酶輕鏈EKl核酸序列(AY682203)和氨基酸序列， 選擇畢赤酵母偏好的密碼子，人工合成牛腸激酶輕鏈EKl的全長(zhǎng)基因序列(序列表中SEQ-3 的核苷酸序列)?；蛐蛄械娜铣刹捎弥丿BPCR的方法。利用DNAMAN分析序列SEQ-3的酶 切位點(diǎn)，找到2個(gè)天然的酶切位點(diǎn)NdeI (CA/TATG)、PstI (CTGCA/G)將其分割為3段，即 BSl (183bp)、BS2 (240bp)、BS3 (282bp)。各大段再設(shè)計(jì)為數(shù)個(gè)60_68bp的寡核苷酸片段進(jìn)行 合成，每段寡核苷酸片段相互有18_20bp的重疊堿基。對(duì)BS1、BS2、BS3分別設(shè)計(jì)一對(duì)接頭 引物(引物兩端分別帶有上述的天然的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。BSl與BS2用NdeI酶切后 連接，再用I3StI酶切與BS3連接得全長(zhǎng)基因片段(見(jiàn)圖1)。EKl基因序列的5’端帶有B10 I位點(diǎn)和KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAA AGA, 3'端引物加入TGA終止密 碼子以及Not I位點(diǎn)。在EKl基因序列SEQ-3的5，端添加限制性內(nèi)切酶Bio I位點(diǎn)，在Bio I位點(diǎn)和EKL 基因序列間加入KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，確保EKl蛋白分泌到 發(fā)酵液中時(shí)能夠切除α-信號(hào)肽，同時(shí)使工程菌表達(dá)的EKl具有同牛組織中提取的EKl蛋白 具有一樣的N-端氨基酸序列。在3’端加入TGA終止密碼子以及Not I位點(diǎn)，將DNA片段 和pPICZ a A載體經(jīng)Xho I與Not I雙酶切、電泳回收、連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPICZ a A-EKlo將表達(dá)載體pPICZ a A-EKl轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T0P10F，(購(gòu)自hvitrogen公司)中， 在含有25ng/ μ 1 Zeocin抗生素的低鹽LB (LLB)平板上進(jìn)行培養(yǎng)約16h，挑取單菌落，在含 有25ng/μ IZeocin的LLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用5，AOXl與3，AOXl引物進(jìn)行PCR鑒定， 再提取質(zhì)粒，經(jīng)》ιο I與Not I雙酶切出含有目的基因大小的片段，鑒定單菌落中為陽(yáng)性克 隆，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致。二、畢赤酵母 GS115 Stab 或 X-33 生產(chǎn) rEKLl.pPICZ α A-EKl高表達(dá)菌株的篩選將pPICZ α A-EKl 用 &ic I 或 BstX I 線性化，按照 hvitrogen 公司 Eas於elect Pichia ExpressionKit中的方法制備酵母宿主菌感受態(tài)，并電轉(zhuǎn)至畢赤酵母宿主菌GSl 15Mab或者X-33中，涂布于含有l(wèi)OOng/μ 1 kocin抗生素的YPDS平板上，30°C下放置3_4天 長(zhǎng)出單菌落。挑選大而飽滿的單菌落，用5’A0X1與3’A0X1引物進(jìn)行PCR鑒定。20μ IPCR反 應(yīng)體系為5，Α0Χ1(10μΜ)與 3，Α0Χ1(10μΜ)引物各 0·5μ 1，dNTP (各 2. 5Mm) 2 μ l，10*Taq buffer 2 μ 1，TaqDNApolymerase (2. 5U/μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 14·5μ1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C，8min ；95°C、lmin, 55°C、lmin, 72°C、lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 根據(jù) Invitrogen 手 冊(cè)中，pPICZ α A等載體整合到酵母基因組的原理，如果pPICZ α A-EKl插入到野生型GSl 15 Mab或者Χ-33自身醇氧化酶基因5，AOXl或3，AOXl中，會(huì)形成Mut+，即甲醇利用正常表 型；如果pPICZ α A-EKl替代野生型GSl 15 Mab或者Χ-33自身醇氧化酶基因，會(huì)形成Muts， 即甲醇利用慢表型。2200bp條帶為野生型GS115 Mab或者X-33自身醇氧化酶基因的PCR 產(chǎn)物，1300bp左右條帶為插入的載體的PCR產(chǎn)物，即Mut+有2200bp和1300bp左右的條帶， Muts僅有1300bp左右的條帶。對(duì)單克隆菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)酶活鑒定，是篩選高表達(dá)菌株最直接有效地方式。將 PCR驗(yàn)證含有 pPICZ α A-EKl 的陽(yáng)性克隆菌株分別在 BMGY(1 % hast extract, 2% peptone, lOOmMpotassium phosphate,pH 6. 0，1. 34% YNB,4x10-5% biotin，4x10-5% biotin)30°C 過(guò)夜培養(yǎng)，接種至含有50ml BMMY培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，0D600約為1-1. 2，30°C培養(yǎng)， 每隔M小時(shí)，補(bǔ)加體積的甲醇誘導(dǎo)72小時(shí)。EKl發(fā)酵上清的測(cè)活，誘導(dǎo)不同時(shí)間段的 發(fā)酵液離心過(guò)濾后取40ul上清添加40ul Trx-T α 1 (lmg/ml)，23°C酶切16小時(shí)，如圖2所示。2. EKl的發(fā)酵生產(chǎn)因EKl—級(jí)結(jié)構(gòu)中有多個(gè)堿性蛋白聚集區(qū)，畢赤酵母分泌的1 在發(fā)酵液上清 中易發(fā)生降解。我們優(yōu)化了發(fā)酵條件，前期酵母菌生長(zhǎng)約16-1 后，流加適量甘油后饑餓 0. 2 0. 3h，改變誘導(dǎo)pH值，以及在誘導(dǎo)過(guò)程中添加一些蛋白胨如大豆蛋白胨或酸水解酪 蛋白，充當(dāng)酶解底物，減少上清中的降解，在誘導(dǎo)前期加入適量山梨醇，有利于酵母分 泌rEKp同時(shí)，在流加甲醇的過(guò)程中補(bǔ)加1 %體積PTMl的甲醇誘導(dǎo)。具體方法為以篩選到的含有pPICZ α A-EKl酶活為5Χ 105U/L的陽(yáng)性克隆為例，上 16L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。種子液接種量為6%-10%，轉(zhuǎn)接至裝有10L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(甘油40g/ L, K2S0417. 5g/L, MgSO4 14g/L, KOH 3. 2g/L, CaSO4 0. 8g/L, PTMl 3ml/L)的 16L 發(fā)酵罐中， 30°C，pH4. 0-6. 0，更優(yōu)的為ρΗ5· 0，發(fā)酵16_18h，待溶氧從接近0%上升到70-80%，按^il/ min加入50%甘油約600ml，饑餓30mins，菌體濕重為180_200g/L時(shí)開始誘導(dǎo)，優(yōu)化的誘導(dǎo) PH為4. 0-5. 0，最優(yōu)誘導(dǎo)pH為4. 0，前1 誘導(dǎo)期內(nèi)共流加入10_20g山梨醇，穩(wěn)定誘導(dǎo)期內(nèi) 按aiil/min加入含有體積PTMl的甲醇誘導(dǎo)60_7池，每1 加入5g大豆蛋白胨或酸水 解酪蛋白充當(dāng)酶解底物，每隔1 取發(fā)酵液測(cè)濕重和發(fā)酵上清，檢測(cè)酶活。 三、rEKL的純化與活性檢測(cè) 發(fā)酵上清經(jīng)PALL CentramateTM超濾系統(tǒng)置換緩沖液，置換溶液為20_50mM Tris-HCl或者PBS緩沖液pH 7. 5-8. 5，NaCl濃度為0_50mM，膜包選擇為漲分子量，面積 為0. Im2。超濾后EKL的溶液經(jīng)A液(緩沖液)20_50mM Tris-HCl或者PBS緩沖液pH 7. 5-8. 5，NaCl濃度為0_50mM平衡過(guò)的陰離子層析填料(并不僅限于Q FF或Capto Q)，B 液:50-100mMTris-HCl 或者 PBS 緩沖液 pH 7. 5-8. 5，NaCl 濃度為 100_500mM，洗脫 5-10 個(gè) 柱體積。洗脫溶液經(jīng) 20-50mM Tris-HCl 0-150mM NaCl O-IOmM CaC12pH7. 5-8. 5 平衡過(guò)的 Trypsin Inhibitor(Sigma)或者 trypsin-S印harose 4B (GE)層析柱料，B 液50_200mM HAc-NaAc或甲酸-甲酸鈉、I-IOmM CaC12、pH3. 0-4. O洗脫5_10個(gè)柱體積。成品置換入20mM Tris-HCl (pH7. 4)、50mM NaCl、2mM CaCl2緩沖液中。純化結(jié)果如圖3所示。
取 50μ1 lmg/ml Trx-T α 1 融合蛋白，分別加入 1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 單位(U)的rEKL, 23°C，酶切16h，如圖4所示。
權(quán)利要求
1.根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化的牛腸激酶輕鏈基因序列，為序列表中序列3。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因，所用表達(dá)載體為pPICZaA，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)在5’端加 入Β ο I位點(diǎn)，在Bio I位點(diǎn)和牛腸激酶輕鏈基因序列間加入KEX2蛋白酶酶切位點(diǎn)Lys-Arg 對(duì)應(yīng)的密碼子AAAAGA，在3，端加入TGA終止密碼子以及Not I位點(diǎn)，將DNA片段和pPICZ α A 載體經(jīng)Β ο I與Not I雙酶切、電泳回收、連接、電轉(zhuǎn)至宿主菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述，其特征在于構(gòu)建的表達(dá)載體宿主菌為畢赤酵母，優(yōu)選為畢赤 酵母 GS115stab 或者 X-33。
4.一種發(fā)酵制備牛腸激酶輕鏈蛋白的方法，其特征在于所述編碼基因電轉(zhuǎn)至畢赤酵 母菌發(fā)酵表達(dá)的優(yōu)選方法為16L發(fā)酵罐體系中，30°C，pH4. 0-6. 0，更優(yōu)的為pH5. 0，在基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-18h后，按2. 5ml/min流加50%甘油約600ml，饑餓0. 2 0. 3h，菌體 濕重為180-200g/L時(shí)開始誘導(dǎo)，優(yōu)化的誘導(dǎo)pH為4. 0-5. 0，最優(yōu)誘導(dǎo)pH為4. 0，前1 誘 導(dǎo)期內(nèi)共流加入10_20g甲醇，穩(wěn)定誘導(dǎo)期內(nèi)按aiil/min加入含有體積PTMl的甲醇誘 導(dǎo)60-7池，每1 加入5g大豆蛋白胨或酸水解酪蛋白；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為甘油40g/L， K2SO417. 5g/L, MgSO4 14g/L, KOH 3. 2g/L, CaSO4O. 8g/L, PTM 13ml/L。
5.一種牛腸激酶輕鏈蛋白的純化方法，其特征在于發(fā)酵上清經(jīng)PALL CentramateTM 超濾系統(tǒng)置換緩沖液，置換溶液為20-50mM Tris-HCl或者PBS緩沖液pH 7. 5_8. 5，NaCl濃 度為0-50mM，膜包選擇為漲分子量，面積為0. Im2 ；超濾后的溶液經(jīng)A液(緩沖液)20_50mM Tris-HCl或者PBS緩沖液pH 7. 5-8. 5, NaCl濃度為0_50mM平衡過(guò)的陰離子層析填料(并 不僅限于 Q FF 或 Capto Q)，B 液50_100mM Tris-HCl 或者 PBS 緩沖液 pH7. 5-8. 5，NaCl 濃 度為 100-500mM，洗脫5-10個(gè)柱體積；洗脫溶液經(jīng)20-50mM Tris-HC10-150mM NaCl O-IOmM CaCl2p]T7· 5_8· 5 平衡過(guò)白勺 Trypsin Inhibitor agarose (Sigma)或者 trypsin—Sepharose 4B(GE)層析柱料，B 液50-200mM HAc-NaAc 或甲酸-甲酸鈉、l-10mMCaCl2、pH3. 0-4. 0 洗脫 5-10 個(gè)柱體積；成品置換入 20mM Tris-HCl (pH7. 4)、50mM NaCl、2mM CaCljl沖液中，分裝 保存。
全文摘要
腸激酶輕鏈基因的合成及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法。本發(fā)明是有關(guān)采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的牛腸激酶輕鏈蛋白。該蛋白的編碼基因，具有如序列表中序列3所示，并進(jìn)一步公開了牛腸激酶輕鏈蛋白的發(fā)酵和純化工藝。利用本發(fā)明優(yōu)化后的發(fā)酵與純化方法，以分泌表達(dá)的方式成功地表達(dá)出高生物活性的牛腸激酶輕鏈蛋白蛋白。作為工具蛋白酶用于融合蛋白的特異性切割，尤其適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102061302SQ20101056036
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者姜松, 岳妙殊, 張同, 李光偉, 李曉雯, 楊子義 申請(qǐng)人:揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司