專利名稱：Tev蛋白酶突變體及編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種煙草蝕斑病毒(TEV)蛋白酶突變體，該突變體的編碼基因以及制備該突變體的方法。
背景技術(shù)：
在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白重組表達(dá)時，很多蛋白質(zhì)不是表達(dá)量不高就是可溶性很 低。要使得目的蛋白的表達(dá)量上升或可溶性提高，也可將目的蛋白和一些特定的蛋白標(biāo)簽 融合表達(dá)，在基因水平上對目標(biāo)蛋白進(jìn)行改造，產(chǎn)生含有蛋白標(biāo)簽的重組蛋白。目前用到的 蛋白標(biāo)簽有很多，包括常用的麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP)，谷胱甘肽 轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)，硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)，小泛素相關(guān) 修飾物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)等。這些蛋白標(biāo)簽可以使重組蛋白 的表達(dá)量上升，可溶性顯著提高，為目的蛋白的表達(dá)、純化提供了便利。然而這些在N-端或 C-端的融合標(biāo)簽可能對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生一定的影響。因此在研究蛋白質(zhì)或酶的 結(jié)構(gòu)或功能時常需要將這些標(biāo)簽在純化完成后除去。雖然化學(xué)和酶學(xué)方法都能夠?qū)⒌鞍讟?biāo)簽切除，但是，化學(xué)法專一性不高，而且，切 割條件不夠溫和，常常會導(dǎo)致目的蛋白不可逆失活。只有使用酶學(xué)方法，才能達(dá)到較高的特 異性，因此切除蛋白標(biāo)簽常用的方法是在標(biāo)簽與目的蛋白之間引入一段蛋白酶酶切序列， 使用特異的蛋白酶將蛋白標(biāo)簽切除。以往選用的蛋白酶主要包括凝血酶(Thrombin)，凝血 因子Xa (Factor Xa)，腸激酶(Enterokinase)等，其中凝血因子Xa和腸激酶切割時，不會在 目的蛋白的N-端留下多余的氨基酸殘基，有利于天然蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究。但據(jù)文獻(xiàn)報 道這些蛋白酶都存在著酶切位點(diǎn)不專一，酶切時常常會導(dǎo)致目的蛋白降解等缺點(diǎn)。而TEV 蛋白酶由于它高度的序列識別專一性，得到人們越來越多的重視。TEV 蛋白酶(tobacco etch virus protease)是煙草蝕斑病毒 NIa 蛋白中 27kD 的催化區(qū)域，可以特異地識別蛋白序Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Gly/Ser (最常用序列為 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)，并在最后兩個氨基酸殘基Gln (Pl)與Gly (Pl ‘)之間切 開，其序列專一性遠(yuǎn)比Thrombin、Factor Xa,Enterokinase等蛋白酶高。雖然TEV蛋白對目 的蛋白切割后，會在目的蛋白的N-端留下一個氨基酸殘基，但是酶切位點(diǎn)的PΓ位置，并 非專一性的是Gly或Ser，Pl ‘位置除Pro非常明顯地影響TEV蛋白酶的切割效果外，其它 氨基酸不會明顯影響TEV蛋白酶對的融合蛋白的切割，通過延長切割時間或增加TEV蛋白 酶的濃度，都會使得大部分的融合蛋白得以切割。因此，通過設(shè)計可以在酶切后得到N-端 不含有多余氨基酸殘基的天然氨基酸。同時，TEV蛋白酶能夠耐受多種常見的蛋白酶抑制 齊U，而且TEV蛋白酶的切割效率即使在4°C時也較高，因此TEV蛋白酶在蛋白質(zhì)研究中得到 廣泛的應(yīng)用。但是TEV蛋白酶自身的表達(dá)和純化存在一定的缺陷。首先，天然的TEV蛋白酶會發(fā) 生分子內(nèi)自水解，在表達(dá)和純化天然TEV蛋白酶的過程中，它會不斷由于其它TEV蛋白酶的 碰撞而發(fā)生構(gòu)象變化，將其自身的特定位點(diǎn)切開，從而使完整的蛋白酶被截短，活性大大降低。生化和結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明這一特定的切割位點(diǎn)離酶活性中心相當(dāng)近。為克服這一困難， Lucast等人得到了 S219N突變體，其穩(wěn)定性得到很大的提高，但是S219N突變體在表達(dá)時和 原始TEV蛋白酶一樣，可溶性并不高，有大約95%的蛋白是以包涵體的形式存在于沉淀中。 Kapust等人使用基因工程點(diǎn)突變了天然TEV蛋白酶的基因序列，得到S219V這一穩(wěn)定性較 高并且酶活性也有稍微提高的突變體，其穩(wěn)定性比S219N要高出約100倍。
其次，TEV蛋白酶表達(dá)產(chǎn)量不高，溶解度也非常低。大約只有5%的TEV蛋白酶 存在于細(xì)胞破碎液的上清中，產(chǎn)量為12. 5mg/L。Van denBerg等人通過基因改組(DNA shuffling)、易錯PCR(error-prone PCR)發(fā)現(xiàn)了一種可以將產(chǎn)量提高到54mg/L的突變體 TEVsh，其溶解度比S219N有很大提高，但仍有大量TEV蛋白酶以不可溶的形式存在于沉淀 中，并且酶活性變化不大。Lei Fang等人將TEV蛋白酶和分子伴侶分別克隆入兩個不同的 載體，在低溫下進(jìn)行共表達(dá)，使TEV蛋白酶產(chǎn)量提高到65mg/L，而且酶活性得到一定程度的 保留。Cabrita，L. D.等人使用PoPMuSiC軟件設(shè)計，對TEV蛋白酶單點(diǎn)突變體進(jìn)行穩(wěn)定性分 析，篩選出了五個突變體，它們的可溶性和酶活性相對于野生型TEV蛋白酶都得到提升，同 時還得到一個雙突變體，其可溶性及酶活性相對于單突變體有顯著提高。Blommel，P. G等 人將TEV蛋白酶與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合表達(dá)，吳旭東等人將TEV蛋白酶與超折疊綠 色熒光蛋白(sfGFP)融合表達(dá)，融合蛋白的表達(dá)量都得到了明顯的提高。Kraft等人通過熒 光底物，發(fā)展出一套能夠?qū)嵱玫姆椒?，它可以有效地檢測TEV蛋白酶在體內(nèi)的表達(dá)與折疊， 為TEV蛋白酶的進(jìn)一步研究提供了一種快捷有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對以上提及的TEV蛋白酶自身不足，提供了一種可溶性和酶活性均較原 始TEV蛋白酶得到顯著提高的突變體，以及該突變體的編碼基因和制備該突變體的方法。本發(fā)明是能過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的第一目的是提供一種TEV蛋白酶突變體，與原始TEV蛋白酶相比，第17 位由絲氨酸(Ser)取代蘇氨酸(Thr)，第56位由纈氨酸(Val)取代亮氨酸(Leu)，第68位由 天冬氨酸(Asp)取代天冬酰胺(Asn)，第77位由纈氨酸(Val)取代異亮氨酸(lie)，第135 位由甘氨酸(Gly)取代絲氨酸(Ser)。所述TEV蛋白酶突變體具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的第二目的是提供編碼TEV蛋白酶突變體的基因，其核苷酸序列如序列表 中序列ι所示。本發(fā)明的第三目的是提供一種含有前述基因的表達(dá)載體pET28b。本發(fā)明的第四目的是提供一種含有前述基因和前述載體的宿主細(xì)胞大腸桿菌 Rosetta(DE3)感受態(tài)。本發(fā)明第五目的是TEV蛋白酶突變體在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白重組表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明的制備原理為體外定點(diǎn)突變(site-directed mutagenesis)技術(shù)是研究 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是改造/優(yōu)化基因常用的手段，其原理 是設(shè)計兩對5'端鄰接，3'端方向相反的引物，用以導(dǎo)入變異點(diǎn)。本發(fā)明的有益效果為采用定點(diǎn)突變技術(shù)改造TEV蛋白酶基因，特異性的改變TEV 蛋白酶中的五個氨基酸殘基，以獲得可溶性和酶活性更高的TEV蛋白酶的突變體，強(qiáng)化其在大腸桿菌中蛋白重組表達(dá)的應(yīng)用。


圖1為TEV蛋白酶突變體TEVq (五突變體)與TEV蛋白酶TEVf三突變體可溶性比 較。圖2為GSTcys融合蛋白及TEV蛋白酶作用示意圖。圖3為TEVf與TEVq酶活性比較。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1利用定點(diǎn)突變得到TEV蛋白酶突變體 設(shè)計定點(diǎn)突變引物，以含有煙草蝕斑病毒蛋白酶基因的載體(pET-TEV)為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 6. 5min，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI 消化后，瓊脂糖凝膠電泳。切膠純化，對已經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端平滑及5'磷酸 (P)化處理，再用高效連接試劑Ligation Solution I進(jìn)行自身連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感 受態(tài)細(xì)胞，提取突變體質(zhì)粒DNA。同時將五突變體命名為TEVq,三突變體命名為TEVf。實施例2突變體基因測序及序列比對將通過上述方法得到的突變體克隆DH5a送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 測序，測序結(jié)果輸入BioEdit軟件，比較突變前后基因堿基序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列的差
已結(jié)果顯示，突變體蛋白與原始TEV蛋白酶共五處發(fā)生突變。突變體的DNA堿基及 氨基酸序列改變情況如下堿基變化為第50位由G(鳥嘌呤)替代C(胞嘧啶)，第166位由G(鳥嘌呤)替 代T (胸腺嘧啶)，第202位由G (鳥嘌呤)替代A (腺嘌呤)，第229位由G (鳥嘌呤)替代 A(腺嘌呤)，第403位由G(鳥嘌呤)替代T (胸腺嘧啶)，第404位由G(鳥嘌呤)替代C(胞 嘧啶)。相應(yīng)地，氨基酸變化為第17位由絲氨酸(S，Ser)取代蘇氨酸(T，Thr)，第56位 由纈氨酸(V，Val)取代亮氨酸(L，Leu)，第68位由天冬氨酸(D，Asp)取代天冬酰胺(N， Asn)，第77位由纈氨酸(V，Val)取代異亮氨酸(I，He)，第135位由甘氨酸(G，Gly)取代 絲氨酸(S，Ser)。實施例3 TEVq蛋白酶與TEVf蛋白酶可溶性及表達(dá)量比較將PET-TEVq和pET_TEVF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態(tài)。1、小量誘導(dǎo)表達(dá)，比較TEVq蛋白酶突變體與TEVf蛋白酶可溶性的變化(1)挑取單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(含硫酸卡那霉素25mg/mL，氯霉素25mg/ mL)中，在37°C恒溫?fù)u床中220r/min振蕩培養(yǎng)過夜；(2)加入IPTG(終濃度為1. Ommol/L)，在20°C恒溫?fù)u床220r/min誘導(dǎo)表達(dá)20h。(3)用1. 5mL道夫管收集菌體，洗滌并將菌體重新懸浮于0. SmL裂解緩沖液中。(4)重懸液經(jīng)超聲破碎后離心，取上清120 μ L力卩30 μ L5 X SDS-PAGE上樣緩沖液制 備蛋白電泳樣品(上清)。
(5)將破碎后的沉淀經(jīng)裂解緩沖液洗滌后，重新溶解于0. 8mL 8mol/L尿素溶液，再次離心后取上清120 μ L加30 μ L 5 X SDS-PAGE上樣緩沖液制備蛋白電泳樣品(沉淀)。(6) 12% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)結(jié)果?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，TEV蛋白酶突變前后可溶性有明顯改變，TEVq蛋白 酶突變體的可溶性得到提高。2、大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化，比較TEVq蛋白酶突變體與TEVf蛋白酶表達(dá)量的變化(1)挑取單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基中，在37°C恒溫?fù)u床中220r/min振蕩培養(yǎng) 過夜。(2)以1 100轉(zhuǎn)接到IL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD6tltl = 0.6左右。(3)加入IPTG(終濃度為1. Ommol/L)，在20°C恒溫?fù)u床誘導(dǎo)表達(dá)20h。(4)收集菌體，重新懸浮于30mL Lysis Buffer中，重懸液經(jīng)超聲破碎后離心， Ni-NTA柱純化。(5)先用Lysis Buffer平衡Ni-NTA層析柱，然后將上步得到的細(xì)胞破碎上清液加 入Ni-NTA層析柱中，控制流速在lmL/min。(6)等上清液流完后，以Lysis Buffer沖洗，再用Washing buffer洗去雜蛋白。(7)最后用Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集目的蛋白約30mL。(8) Elution Buffer 洗脫完后，用 Lysis Buffer 平衡 Ni-NTA 柱，備用。(9)用Bradford法分別測定TEVq蛋白酶與TEVf蛋白酶的蛋白濃度，計算各自的
表達(dá)量。大量誘導(dǎo)表達(dá)并用Ni-NTA柱純化后，用Bradford法分別測定TEVq蛋白酶與TEVf 蛋白酶的蛋白濃度，計算各自的表達(dá)量。計算結(jié)果顯示每升菌液中蛋白酶表達(dá)量分別為 165mg(TEVq蛋白酶)和108mg(TEVf蛋白酶)。TEVq蛋白酶的表達(dá)量明顯高于TEVf蛋白酶。實施例4 TEVq蛋白酶突變體與TEVf蛋白酶酶活性比較TEV蛋白酶的酶活性通過其切割含有TEV蛋白酶識別序列的底物來測定，我們以 融合蛋白GST-Cys為底物。酶切反應(yīng)在30°C恒溫水浴鍋進(jìn)行，TEV蛋白酶與GST-Cys融合 蛋白比例為1 10。(1)吸取等體積的融合蛋白GST-Cys溶液(200 μ L)于兩個2mL道夫管中，分別標(biāo)
注①和②。(2)分別加入等量的TEV蛋白酶TEVF蛋白酶(16 μ L)，TEVq蛋白酶(12 μ L)。(3)補(bǔ)充 50mM Tris-HCl 緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8. 0,0. 5mMEDTA, ImM DTT)至 1600 μ L0(4)在30°C恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶切反應(yīng)(5)每隔20min分別取出120 μ L制備蛋白電泳樣品。(6)等量上樣，12% SDS-PAGE分析酶切結(jié)果。電泳結(jié)果顯示TEVq蛋白酶突變體2h后幾乎已經(jīng)將GST-Cys融合蛋白切割完全，而 TEVf蛋白酶要達(dá)到同樣的效果需要3h。所以TEVq蛋白酶突變體不僅可溶性得到提高，而且 酶活性也有了很大的改善。
權(quán)利要求
TEV蛋白酶突變體，其特征在于與原始TEV蛋白酶相比，第17位由絲氨酸(Ser)取代蘇氨酸(Thr)，第56位由纈氨酸(Val)取代亮氨酸(Leu)，第68位由天冬氨酸(Asp)取代天冬酰胺(Asn)，第77位由纈氨酸(Val)取代異亮氨酸(Ile)，第135位由甘氨酸(Gly)取代絲氨酸(Ser)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TEV蛋白酶突變體，其特征在于所述突變體具有序列表中序 列2所示的氨基酸序列。
3.編碼如權(quán)利要求1所述的TEV蛋白酶突變體的基因，其核苷酸序列如序列表中序列 1所示。
4.一種含有如權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pET28b。
5.一種含有權(quán)利要求3所述基因和權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞，其特征在于所述 宿主細(xì)胞為大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)。
6.權(quán)利要求1所述的TEV蛋白酶突變體在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白重組表達(dá)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種TEV蛋白酶突變體，與原始TEV蛋白酶相比，第17位由絲氨酸(Ser)取代蘇氨酸(Thr)，第56位由纈氨酸(Val)取代亮氨酸(Leu)，第68位由天冬氨酸(Asp)取代天冬酰胺(Asn)，第77位由纈氨酸(Val)取代異亮氨酸(Ile)，第135位由甘氨酸(Gly)取代絲氨酸(Ser)。本發(fā)明還提供了突變體的編碼基因及其含有編碼基因的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞以及突變體在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白重組表達(dá)的應(yīng)用。采用定點(diǎn)突變技術(shù)改造TEV蛋白酶基因，特異性的改變TEV蛋白酶中的五個氨基酸殘基，獲得的TEV蛋白酶的突變體可溶性和酶活性均得到顯著的提高。
文檔編號C12N15/70GK101864407SQ20101020470
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者亓振國, 范軍 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)