專利名稱：一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人 乳鐵蛋白的方法。
背景技術(shù)：
人乳鐵蛋白(Human lactoferrin， HLF )是一種屬于鐵結(jié)合蛋白家族的糖 基化蛋白，由Sorensen首次發(fā)現(xiàn)，并由Blanc和Isliker命名。一系列研究表明乳鐵蛋白具有多種重要的生理功能(1)乳鐵蛋白在結(jié) 構(gòu)上和生物化學(xué)特征上與轉(zhuǎn)鐵蛋白的高度相似性表明，乳鐵蛋白作為鐵轉(zhuǎn)移 分子在鐵代謝中可能起著很重要的作用；(2)乳鐵蛋白通過各種不同的機制 實現(xiàn)其抗菌作用，它是一種鐵結(jié)合蛋白，能限制可利用自由鐵的含量，而鐵 是微生物生長所必須的一種生長因子，故能抑制細菌生長，此外它還可以破 壞革蘭氏陰性細菌的外膜，釋放抗菌活性肽；(3)乳鐵蛋白具有非常強的抑 制各種具有包膜的病毒侵染的能力，如人細胞巨化病毒、HIV、簡單皰麥病 毒和人的丙型肝炎病毒等；(4)乳鐵蛋白能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；(5)乳鐵蛋白可 以通過絡(luò)合鐵離子來降低含氧自由基對細胞的損害；(6)乳鐵蛋白還具有抗 癌作用；(7)乳鐵蛋白對免疫系統(tǒng)的作用非常廣泛，它對抗體生成、T細胞 成熟等都有一定的調(diào)控作用；(8)乳鐵蛋白除了上述功能之外，還有一些其 他的功能，如RNA酶活性、蛋白酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能等。在過去的二十年時間里，人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因研究已取得了很大進展。一 些成功的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可得到較高表達量的重組人乳鐵蛋白(高于l克/升)。 重組人乳鐵蛋白的許多屬性都與人乳鐵蛋白相同。關(guān)于從乳中純化乳鐵蛋白方法的專利比較多，例如美國專利US 4,436,658描述了從脫脂和去除了酪蛋白的乳清中純化牛乳鐵蛋白的方法，采 用pH7.7-8.8的微堿性介質(zhì)，讓乳清通過硅膠顆粒，然后用0.5MMaCl/0.1N乙 酸洗脫，得到乳鐵蛋白。美國專利US4,791，193和歐洲專利No.EP.0 253 395
(Okonogi等)報道了相似的方法，采用偶聯(lián)了羥甲基的弱酸性陽離子交換 樹脂，吸附的乳鐵蛋白用10。/。NaCl梯度洗脫。美國專利US4,668,771釆用單 克隆抗體純化牛的乳鐵蛋白。而專利W089/04608則描述了一種從牛的乳清 中獲得牛乳過氧化物酶和乳鐵蛋白的方法，用濾過的牛乳清通過強陽離子交 換劑，在pH〈6.0條件下，采用較高的流速，選擇性吸附牛乳過氧化物酶和乳 鐵蛋白，然后用0.5-2.0MNaCl溶液洗脫。美國專利US4,997,914描述了 一種 從人初乳或生鮮乳中純化人乳鐵蛋白的方法，釆用交聯(lián)多糖的硫酯吸附人乳 鐵蛋白，然后0.4-1.5MNaCl溶液洗脫。中國專利CN03152940.2描述了從牛 初乳中分離牛乳鐵蛋白的方法，釆用肝素一瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B) 親和層析柱，用緩沖液(0~ 1MNaCl， pH6.5~8.5， 0.05 ~ 0.005摩爾磷酸鉀) 洗脫。中國專利CN200410016117.5描述了一種從牛初乳、牛奶或乳漿中提取 乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的方法，應(yīng)用陽離子交換樹脂吸附乳鐵蛋白和乳過 氧化物酶，用高滲離子滲透液洗脫吸附的乳鐵蛋白和乳過氧化物酶，低濃度 的緩沖液(02-0.5MNaCl)洗脫乳過氧化物酶，高濃度的緩沖液(2.5MNaCl) 洗脫乳鐵蛋白，中濃度的緩沖液(>0.7MNaCl)同時洗脫乳鐵蛋白和乳過氧 化物酶。中國專利CN200410080264.9將活化的羥甲基弱酸性陽離子交換樹脂 與脫脂初乳(或初乳乳清)混合，在0-5(TC范圍內(nèi)，輕輕攪拌2-20h，用濾布將 樹脂分離，用去離子水洗脫樹脂來除去雜蛋白，然后用0.1%-15%的鹽溶液 (NaCl, KC1， CaCl2， MgCl2, Na2C03等)洗脫樹脂，得到乳鐵蛋白。美國專 利US 5,849,885采用Mono S瓊脂糖或S Sepharose， 20mM磷酸鈉緩沖液， 0-1M NaCl溶液梯度洗脫，從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化人乳鐵蛋白。美國專利 5,861,491則釆用疏水相互作用色譜，從人和牛乳鐵蛋白混合物中分離人乳鐵 蛋白。Querinjean等(1971)釆用CM Sephadex C-50從人乳中純化人乳鐵蛋白， 用0.33MNaCl洗脫。Johannson(1969)釆用CM Sephadex C-50,并且報道了使 用磷酸鈣緩沖液。Torres(1979)報道從豚鼠乳中純化乳鐵蛋白，預(yù)先脫脂和去 酪蛋白，釆用Whatman CM-52，0.5MNaCl/5mM磷酸鈉，pH7.5,洗脫。Roberts 和Boursnell (1975)報道了從豬乳中純化乳鐵蛋白的方法，釆用CM-Sephadex柱子，0.5M NaCl/20mM磷酸鹽(pH7)洗脫，然后又上CM-Sephadex,用 0.4MNaCl洗脫。Zagulski(1979)釆用CM-SephadexC國50， 0.5M NaCl/0.02M 磷酸鈉(pH7)洗脫，從脫脂牛乳中純化乳鐵蛋白。Moguilevsky(1975)采用 CM-Sephadex， 1M NaCl洗脫，從人乳中純化乳鐵蛋白。Ekstrand和Bjorck(1986)報道了從牛乳或人初乳中純化乳鐵蛋白的方法，脫脂的乳汁酸化，再調(diào) pH = 7.8，上Mono S柱，然后用線性NaCl濃度梯度洗脫。Foley和Bates (1987) 報道了從人初乳乳清中分離乳鐵蛋白，乳清與弱離子交換樹脂(磷酸纖維素) 混勻，然后用stepped鹽濃度和pH梯度(0.25M NaCl/0.2M sodium phosphate ) 洗脫。Yoshida和Ye-Xiuyun (1991)采用羧甲基陽離子交換樹脂分離乳鐵蛋 白，0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.7),線性梯度(0-0.55M NaCl)洗脫。羧甲 基Toyopeari柱子只結(jié)合牛乳清中的乳鐵蛋白和乳過氧化物酶，然后用 0.4-0.55M NaCl洗脫，得到乳鐵蛋白A和乳鐵蛋白B。此外，還有報道采用 親和層析的方法，例如Kawakami(1987)報道釆用人或牛乳鐵蛋白的單克隆抗 體純化乳鐵蛋白，Hutchens(1989)采用單鏈DNA親和柱從母乳喂養(yǎng)嬰兒的尿 中分離乳鐵蛋白。Chen和Wang (1991)釆用親和層析和過濾結(jié)合的方法從牛 奶酪中純化乳鐵蛋白，他們使用肝素-瓊脂糖結(jié)合乳鐵蛋白，Bezwoda等(1986) 報道Cibacron Blue F3GA樹脂純化乳鐵蛋白的方法。對于從牛乳鐵蛋白中純 化人乳鐵蛋白的方法并未見報道。綜上所述，純化人乳鐵蛋白的方法主要有吸附色譜法、離子交換色譜法、 親和色譜法、超濾和鹽析法，這些方法在應(yīng)用上都存在一定的局限性，例如 吸附色譜法操作簡單，但吸附容量小、效率低；親和色譜法的優(yōu)點是分離效 果好、純度高，但柱的制備工藝復(fù)雜，成本昂貴；而超濾和鹽析法不能實現(xiàn) 規(guī)?；a(chǎn)。隨著轉(zhuǎn)基因大家畜的成功，從這些轉(zhuǎn)基因大動物的乳中規(guī)模化生產(chǎn)人乳 鐵蛋白已經(jīng)成為可能。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的空白，建立了從轉(zhuǎn)基因牛乳中 分離有生物活性的重組人乳鐵蛋白的方法。發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟高效的從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋 白的方法，并且使純化的目的蛋白具有正常的理化特性和生理功能。 (二)技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋白的方法，它包括如下步驟(l)制備乳清將轉(zhuǎn)基因牛乳在4。C下離心15min，轉(zhuǎn)數(shù)為4500rpm, 去除乳脂。然后調(diào)節(jié)pH值去除酪蛋白先用1MHCl將乳樣pH值調(diào)至3.8-4.6， 脫脂乳與1MHC1的體積比為25:1;待酪蛋白沉淀后，再用1MNaOH將pH 值調(diào)回至7.5，乳清與1MNaOH的體積比為25:1。離心，得到備用乳清；(2 )用陽離子交換色譜進行純化，釆用的介質(zhì)為偶聯(lián)了磺酸基的瓊脂糖 凝膠(SP Sepharose )，所用緩沖液Na3P04的pH是7.5。并用0.4-1M NaCl、 20mMNa3PO4梯度洗脫，得到兩個洗脫峰Pl和P2，分別是在0.6MNaCl和 0.7MNaCl被洗脫，收集合并同一峰值的洗脫液；(3)對洗脫液進行超濾或透析處理，制得高純度的重組人乳鐵蛋白。 其中，超濾的操作為先將洗脫液經(jīng)5KD的超濾管5000rpm、 15min離 心濃縮，然后加雙蒸水恢復(fù)至原體積，再經(jīng)超濾管5000rpm、 15min離心濃縮。 透析的操作采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法。純化得到的重組人乳鐵蛋白可在-55'C冷凍干燥48h，然后于4'C下保存。 本發(fā)明所述的方法可應(yīng)用于從轉(zhuǎn)基因家畜乳中分離轉(zhuǎn)基因蛋白。 (三)有益效果釆用本發(fā)明所述方法得到的重組人乳鐵蛋白純度高達95%以上，具有和 天然人乳鐵蛋白相似的抵抗胰蛋白酶消化和結(jié)合鐵離子的能力，而且純化成 本低，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。


圖l是梯度洗脫結(jié)果圖，其中UB表示未結(jié)合到柱子上的其它乳蛋白，Pl、 P2分別表示洗脫下來的重組人乳鐵蛋白；
圖2是純度測定結(jié)果圖，其中M表示低分子量蛋白標準，hLF表示標準人乳 鐵蛋白，P1表示純化的P1峰，P2表示純化的P2峰，W表示上柱前的乳清， U表示未結(jié)合到柱子上的乳清； 圖3是MOLDI-TOF質(zhì)譜結(jié)果圖；圖4是LC-ESI-MS質(zhì)譜結(jié)果圖，上圖為P1結(jié)果，下圖為P2結(jié)果； 圖5是糖基化實驗結(jié)果圖，其中M表示分子量標準，LF' 、 Pl' 、 P2'分別 表示糖苷酶處理的標準LF、純化的P1 、純化的P2，而LF 、 Pl、 P2分別 表示標準LF、純化的Pl、純化的P2, A表示10% SDS-PAGE減性(reducing) 電泳結(jié)果，B表示對應(yīng)A的WESTERN結(jié)果，C表示10°/。 SDS-PAGE非減性 (non-reducing)電泳結(jié)果，D表示對應(yīng)C的WESTERN結(jié)果； 圖6是胰蛋白酶消化結(jié)果圖，其中M表示低分子量標準，l表示去糖基化重 組人乳鐵蛋白，2表示Trypsin處理的去糖基化重組人乳鐵蛋白，3表示去糖 基化LF, 4表示Trypsin處理的去糖基化LF， 5表示重組人乳鐵蛋白，6表示 Trypsin處理的重組人乳鐵蛋白，7表示LF， 8表示Trypsin處理的LF, A表 示12% SDS-PAGE減性電泳結(jié)果，B表示W(wǎng)ESTERN結(jié)果； 圖7是結(jié)合鐵的乳鐵蛋白波長掃描結(jié)果圖，其中A表示結(jié)合鐵的重組人乳鐵 蛋白，B表示結(jié)合鐵的人乳鐵蛋白標準品，C表示未結(jié)合鐵的人乳鐵蛋白標 準品。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中所用的主要試驗儀器與試劑如下 試劑配置30%丙烯酰胺稱29g丙烯酰胺和lgN，N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于60ml水中，加 熱助溶，加水定容至100ml， 0.22um濾器過濾，4。C避光保存。
10%過硫酸胺稱lg過硫酸胺溶于水，定容至10ml，于fC保存數(shù)周。 1.5M Tris.Cl (pH8,8):溶解18g Tris于80ml水中，調(diào)pH值至8.8,定容至100ml。 1M Tris.Cl (pH6.8):溶解12.1g Tris于80ml水中，調(diào)pH值至6.8，定容至100ml。 染色液考馬斯亮藍R25olg ,甲醇450ml，冰醋酸100ml，加水450ml ，溶解后過濾使用。脫色液醋酸70ml ,甲醇200ml，加水1730ml，混勻使用。25%甲醇，10% 乙酸，現(xiàn)配2x蛋白電泳上樣緩沖液SDS 500mg ，巰基乙醇lml ，甘油3ml , lmol/L Tris.Cl (pH6.8) 2ml ,用蒸餾水溶解并定容至10ml。電極緩沖液(pH8,3): Tris3.03g，甘氨酸14.4g， SDS l.Og, 溶于水，定容 至1000ml。10x蛋白電泳緩沖液(pH8,3): Tris30.3g ，甘氨酸144.2g ， SDS10g ，溶于蒸餾水并定容至1000mL。TEMED: Sigma7A司產(chǎn)品。濃縮膠緩沖液Tris6.0g, SDS 0.4g，溶于水，用3NHCl調(diào)至pH6.8，定容至 廳ml。分離膠緩沖液Trisl8.17g, SDS 0.4g，溶于水，用3NHCl調(diào)至pH8.8，定容 至100ml。轉(zhuǎn)移電泳緩沖液(pH83): Tris5.8g，甘氨酸2.9g, SDS 0.39g，溶于水，甲 醇200ml，定容至1000ml。10x麗春紅儲存液麗春紅2g，三氯乙酸30g，磺基水楊酸30g，溶于1000ml 水中。TBS: 20mM TrisCl(pH7.5), 150mMNaCl。 TBST: 20mNTrisCl(pH7.5)， 10mMNaCl， 0.05% Tween20。 10% 4-氯-l-萘酴0.1g4-氯-l —萘酚溶于甲醇中，—20。C保存 12.5%分離膠 30%丙烯酰胺 12.5mllmol/L Tris.Cl(pH 8.8) 11.2ml 10%SDS 0.3ml10%過硫酸銨 0.2mlTEMED 20ulH20 6.2ml;7.5%分離膠 30%丙烯酰胺 2.5ml1 mol/L Tris.Cl(pH 8.8) 2ml薩SDS 100ml10%過硫酸銨 0.1mlTEMED 5ulH20 5,4ml;濃縮膠 30%丙烯酰胺 1.67ml1 mol/L Tris.Cl(pH6.8) 1.25ml腦SDS 0.1ml10%過硫酸銨 0.1mlTEMED 10ulH20 7.03ml 。蛋白質(zhì)Marker:購自華美生物工程公司，其六條帶的大小分別是(Da): 14400， 20100, 31000， 43000, 66200， 97400。
實驗儀器
(1) 電泳儀DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠；(2) 超凈工作臺北京凈化設(shè)備廠；(3 ) -80°(:超低溫冰箱日本SANYO公司；(4)制冰機日本SANYO公司；(5 )超純水儀美國MILLIPORE公司；(6) 低溫離心機HETTICH公司；(7) 高速冷凍離心機BECKMAN公司；(8) 凝膠成像系統(tǒng)ALPHAINNOTECH公司；(9) PHS-3C酸度計上海虹益儀器廠；
(10) 自動滅菌鍋曰本SANYO公司；
(11) 真空離心沉淀機E-C公司；
(12 ) 37。C恒溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司； (13) AKTA purifer 10液相色譜儀AMERSHAM公司； (14 ) HiLoad 16/10 SP Sepharose High performance色譜柱 AMERSHAM公司。
實施例1 從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋白
1.1動物催乳及乳樣采集
釆用國營西安草灘制藥廠生產(chǎn)的不孕牛催乳針。該產(chǎn)品為盒裝，I號針 10支，1I號針3支。I號針連續(xù)肌肉注射10天，每日一次，劑量按說明書 的1/2做兩組6-8月齡普通牛和轉(zhuǎn)基因牛。1I號針在第13、 15、 17天各注射 一支。從注射7天開始每天溫水按摩乳房，II號針注射完畢后開始人工擠乳 兩周，每天兩次，乳樣收集到50ml離心管中，每次奶樣裝1.5ml離心管，-20 。C保存。 1.2制備乳清
將奶樣于4。C、 4500rpm離心15min。取出，可見上層為凝固的乳脂，將 下層液體吸出并轉(zhuǎn)移到另一個離心管。將脫脂乳用1M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至 3.8-4.6，使得酪蛋白沉淀出來，其中脫脂乳與1MHC1的體積比為25:1;然后 將調(diào)好pH值的奶樣于4。C、 5000rpm離心12min。取出，沉淀為酪蛋白，上 清液為乳清蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管。用1MNaOH將乳清pH值調(diào) 回至7.5，其中乳清與1M NaOH的體積比為25:1。將調(diào)好pH值的奶樣于4 °C、 5000rpm離心15min，將上清收集到一個新離心管，即為備用乳清。 1.3用陽離子交換色譜進行純化，并進行梯度洗脫
HiLoadTM 16/10 SP Sepharose High performance色譜柱預(yù)先用0.4M NaCl、 20mMNa3PO4(pH7.5)平衡5個柱體積。15ml脫脂乳通過注射器上樣， 進入上樣環(huán)。用0.4MNaCl、 20mMNa3PO4(pH7.5)平衡5個柱體積，未結(jié)合
的蛋白收集到一離心管中，用0.4M-lMNaCl 、 20mMNa3PO4(pH7.5)洗脫15 個柱體積，收集分離到的各個峰值蛋白，并合并同一峰值的洗脫液。再用1M NaCl、 20mMNa3PO4(pH7.5)繼續(xù)洗脫2個柱體積，最后用1MNaCl、 20mM Na3P04( pH7.5)洗脫5個柱體積。上述操作均在AKTApuriferlO液相色譜儀上 進行。最后得到兩個洗脫峰Pl和P2，分別是在0.6 M NaCl和0.7 M NaCl 被洗脫，如附圖1所示。收集合并同一峰值的洗脫液。對P1和P2做了N端 測序，證明P1和P2確實是重組人乳鐵蛋白。 1.4對洗脫液進行超濾處理，制得高純度的重組人乳鐵蛋白將洗脫液經(jīng)5KD的超濾管5000rpm、 15min離心濃縮，然后加雙蒸水恢 復(fù)至原體積，再經(jīng)超濾管5000rpm、 15min離心濃縮。 1.5冷凍干燥純化得到的重組人乳鐵蛋白可在-55t:冷凍干燥48h，然后于4'C下保存。實施例2 重組人乳鐵蛋白純度測定實驗將實施例l得到的純化產(chǎn)物用超純水配成lmg/ml，與蛋白上樣緩沖液按體積比l: l稀釋，10(TC水洛5min，使之充分變性，取出后立即冰浴5min，然后5000rpm離心30秒，準備上樣。配制15%SDS-PAGE，上樣，電泳參數(shù)濃縮膠，50V, 30min;分離膠90V, 1.5h。電泳結(jié)東后用考馬斯亮藍G-250染色，檢測純度。結(jié)果如附圖2所示，結(jié)果證明得到了純度很高的重組人乳鐵蛋白，而且未結(jié)合到柱子上的乳清中基本不含重組人乳鐵蛋白，說明柱子 的結(jié)合效率非常高。并采用MOLDI-TOF質(zhì)譜實驗(搡作見說明書)進行驗證，結(jié)果重組人 乳鐵蛋白的分子量為79494道爾頓，并且只有一個峰，充分說明得到的重組 人乳鐵蛋白純度相當(dāng)高，結(jié)果如附圖3所示。同時，采用LC-ESI-MS質(zhì)譜檢 觀'J，結(jié)果如附圖4所示，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫檢索證明Pl和P2均為重組人乳鐵 蛋白。實施例3糖基化分析實驗
PNGaseF消化按說明書操作，各取10M 1純化的重組人乳鐵蛋白和標 準LF,加入終濃度為5°/。的SDS, IO(TC水洛IO分鐘，然后冰洛5分鐘。依 次加入10xNP-40緩沖液1 Ml， 10x G7緩沖液1 ial，糖苷酶F。 37。C水浴lh， 取出終止反應(yīng)。用不連續(xù)15。/。SDS-PAGE檢測，電泳完后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜 上，做WESTERNBLOTING(具體搡作參見《分子克隆》第三版，科學(xué)出版 社，2002年8月出版)。EndoH消化按說明書操作，各取10 m 1純化的重組人乳鐵蛋白和標準 LF，加入終濃度為5°/。的SDS, IO(TC水浴10分鐘，然后冰洛5分鐘。依次 加入10xG5緩沖液ljul, EndoH糖苷酶。37。C水浴lh，取出終止反應(yīng)。用 不連續(xù)15。/。SDS-PAGE檢測，電泳完后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，做WESTERN BLOTTING。結(jié)果如附圖5所示，重組人乳鐵蛋白比標準人乳鐵蛋白略微小一些，經(jīng) 人乳鐵蛋白在被糖苷酶消化后表現(xiàn)為相同條帶，說明這種差異是由不同的糖 基化引起的。實施例4蛋白酶消化實驗胰蛋白酶消化胰蛋白酶購自sigma公司。各取10|a 1去糖基重組人乳鐵 蛋白、純化重組人乳鐵蛋白、標準LF(乳鐵蛋白)，加入終濃度為200Mg/ml 的胰蛋白酶，37。C水洛15min。從每組中取出2.5lil消化液，加入等體積的 上樣緩沖液，100。C水浴5分鐘后終止反應(yīng)。用不連續(xù)12。/。SDS-PAGE檢觀iJ, 電泳完后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，做WESTERNBLOTING。胃蛋白酶消化胃蛋白酶購自sigma公司。各取10 p 1去糖基重組人乳鐵 蛋白、純化重組人乳鐵蛋白、標準LF,加入10ialHCl (終濃度50mM),胃 蛋白酶(終濃度ljag/ml)， 37。C水浴lh。從每組中取出5 m 1消化液，加入等 體積的上樣緩沖液，10(TC水浴5分鐘后終止反應(yīng)。用不連續(xù)12%SDS-PAGE 檢測，電泳完后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，做WESTERNBLOTING。結(jié)果如附圖6所示，表明轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白糖基化與人乳鐵蛋白相似， 具有一定的抗胰蛋白酶消化作用，但是相比較而言人乳鐵蛋白更容易被胰蛋
白酶消化。實施例5鐵結(jié)合能力分析實驗新鮮配置FeNTA溶液(10mM硝酸鐵，8.5mM NTA,用固體NaHC03 調(diào)pH-7.0),將重組人乳鐵蛋白溶解到FeNTA溶液中，使乳鐵蛋白與Fe離 子的摩爾比為1:4， 2(TC下反應(yīng)1小時，然后用0.15 M NaCl溶液透析36小 時。所得到的蛋白溶液用分光光度計測量260到700nm的波長。同時在7.5% SDS-PAGE上檢測鐵結(jié)合情況。結(jié)果如附圖7所示，結(jié)合鐵的乳鐵蛋白在 465nm處會出現(xiàn)一個明顯的峰，由此可知重組人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白 一樣都具有結(jié)合鐵的能力。
權(quán)利要求
1、一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋白的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)制備乳清將轉(zhuǎn)基因牛乳離心去除乳脂，然后調(diào)節(jié)pH值去除酪蛋白，得到備用乳清；(2)用陽離子交換色譜進行純化，并用0.4-1M NaCl、20mM Na3PO4梯度洗脫，收集合并同一峰值的洗脫液；(3)對洗脫液進行超濾或透析處理，制得高純度的重組人乳鐵蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中去除乳脂時離 心參數(shù)為在4"C下離心15min,轉(zhuǎn)數(shù)為4500rpm。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中去除酪蛋白時 是先將乳樣pH值調(diào)至3.8-4.6,待酪蛋白沉淀后再將pH值調(diào)至7.5。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于當(dāng)調(diào)節(jié)乳樣pH值至3.8-4.6 時，脫脂乳與1MHC1的體積比為25:1;當(dāng)乳樣pH值調(diào)回至7.5時，乳清與 1MNaOH的體積比為25:1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中用陽離子交換 色譜進行純化時采用的介質(zhì)為偶聯(lián)了磺酸基的瓊脂糖凝膠。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2 )中所用緩沖液Na3P04 的pH是7.5。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中得到兩個洗脫 峰P1和P2，分別是在0.6MNaCl和0.7 M NaCl被洗脫。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(3)中超濾的操作為 先將洗脫液經(jīng)5KD的超濾管5000rpm、 15min離心濃縮，然后加雙蒸水恢復(fù) 至原體積，再經(jīng)超濾管5000rpm、 15min離心濃縮。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于得到的重組人乳鐵蛋白可在 -551:冷凍干燥4811,然后于4。C下保存。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l-9之任一項所述的方法在從轉(zhuǎn)基因家畜乳中分離轉(zhuǎn) 基因蛋白上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從轉(zhuǎn)基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋白的方法，該方法首先制得去除乳脂和酪蛋白的乳清，然后用陽離子交換色譜進行純化，并用0.4-1M NaCl、20mM Na₃PO₄梯度洗脫，最后對洗脫液進行超濾或透析處理得到高純度的重組人乳鐵蛋白。采用本發(fā)明所述方法得到的重組人乳鐵蛋白純度高達95％以上，具有和天然人乳鐵蛋白相似的抵抗胰蛋白酶消化和結(jié)合鐵離子的能力，而且純化成本低，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/34GK101117351SQ20071010203
公開日2008年2月6日 申請日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者寧 李, 楊鵬華, 波 湯, 王建武 申請人:北京濟普霖生物技術(shù)有限公司;李 寧