專利名稱：重組生產(chǎn)和純化蛋白激酶的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在原核生物中通過內(nèi)含體重組生產(chǎn)和純化蛋白激酶的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
蛋白激酶通過向蛋白質(zhì)添加磷酸基團(tuán)來調(diào)控許多不同的細(xì)胞增殖、分化、和信號過程(Hunter，T.，Cell，50(1987)823-829)。蛋白激酶常常以它們的底物、它們的調(diào)控分子、或突變表型的一些方面命名。就底物而言，蛋白激酶可以分成兩組；將酪氨酸殘基磷酸化的稱為蛋白質(zhì)酪氨酸激酶即PTK，和將絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化的稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶即STK。幾乎所有的激酶都包含類似250-300個(gè)氨基酸的催化結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并定向ATP(或GTP)供體分子。較大的C端部分結(jié)合蛋白質(zhì)底物，并執(zhí)行將磷酸由ATP轉(zhuǎn)移至絲氨酸、蘇氨酸、或酪氨酸殘基的羥基。
可以根據(jù)位于激酶結(jié)構(gòu)域的環(huán)的某一端或插入其環(huán)中的不同氨基酸序列(通常在5和100個(gè)殘基之間)將激酶分類成家族。這些外加氨基酸序列能夠調(diào)控各自激酶，因?yàn)樗R別其靶蛋白并與其相互作用。激酶結(jié)構(gòu)域的一級結(jié)構(gòu)是保守的，而且可以進(jìn)一步細(xì)分成11個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。這11個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)都包含特定殘基和基序或氨基酸樣式，它們是亞結(jié)構(gòu)域的特征，而且這些亞結(jié)構(gòu)域是高度保守的(Hardie，G.和Hanks，S.，TheProtein Kinase Facts Books I，Academic Press，San Diego，Calif，1995，第7-20頁)。
第二信使依賴性蛋白激酶主要介導(dǎo)第二信使諸如環(huán)AMP(cAMP)、環(huán)GMP、肌醇三磷酸、磷脂酰肌醇、3，4，5-三磷酸、環(huán)ADP核糖、花生四烯酸和二酰甘油的作用。例如，環(huán)AMP依賴性蛋白激酶(PKA)和促分裂原活化蛋白激酶(MAP)是STK家族的成員。在已經(jīng)研究過的所有原核和動(dòng)物細(xì)胞中，環(huán)AMP是激素作用的胞內(nèi)介導(dǎo)物。這些由激素誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答包括甲狀腺激素分泌、皮質(zhì)醇分泌、孕酮分泌、糖原分解、骨吸收、以及心率和心肌收縮力度的調(diào)控。PKA發(fā)現(xiàn)于所有動(dòng)物細(xì)胞中，而且認(rèn)為它負(fù)責(zé)環(huán)AMP在大多數(shù)這些細(xì)胞中的作用。PKA表達(dá)的改變涉及多種疾病和病癥，包括癌癥、甲狀腺疾病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、和心血管疾病。
MAP激酶像p38還調(diào)控胞內(nèi)信號途徑。它們通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)由細(xì)胞表面至細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已經(jīng)鑒定了幾個(gè)亞類，它們各自顯示不同的底物特異性并應(yīng)答不同的胞外刺激(Egan，S.E.和Weinberg，R.A.，Nature，365(1993)781-783)。
蛋白激酶B(PKB/Akt)是具有基礎(chǔ)重要性的胞內(nèi)信號途徑的成員，功能是發(fā)揮生長和存活因子的作用，并介導(dǎo)對胰島素和炎性信號的應(yīng)答(Datta，S.R.等人，Genes Dev.，13(1999)2905-2927；Brazil，D.P.和Hemmings，B.A.，Trends Biochem.Sci.，11(2001)657-664)。WO2003/016516描述了使用苯基TSK疏水相互作用層析的PKB的重組生產(chǎn)和純化。將PKB吸附到柱上，并在清洗PKB后使用線性梯度洗脫。
SRC激酶涉及癌癥、免疫系統(tǒng)機(jī)能失調(diào)和骨重建疾病。一般綜述可參閱Thomas，S.M.和Brugge，J.S.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，13(1997)513-609。Src家族的成員有例如Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、和Blk。這些是非受體蛋白激酶，分子量范圍為52-62kD。它們的特征是共同結(jié)構(gòu)組織，即包含六個(gè)不同功能結(jié)構(gòu)域Src同源結(jié)構(gòu)域4(SH4)、一個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(SH1)、和C端15調(diào)控區(qū)。
在原核生物體中，蛋白質(zhì)合成(也稱為翻譯)是在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上進(jìn)行的。在原核宿主生物體諸如大腸桿菌中表達(dá)重組DNA時(shí)，由此生成的重組基因產(chǎn)物/蛋白質(zhì)常常以不溶性內(nèi)含體的形式在細(xì)胞質(zhì)中沉淀。在完成發(fā)酵并裂解細(xì)胞后，分離并任選純化內(nèi)含體，通過添加變性劑諸如尿素或鹽酸胍溶解其中包含的重組蛋白，并通過還原變性條件實(shí)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)的復(fù)性。這些方法是眾所周知的，并且已經(jīng)長時(shí)間成功用于重組蛋白的工業(yè)生產(chǎn)(參閱如Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.，14(1996)98-105；Panda，A.K.等人，J.Biotechnol.，75(1999)161-172；Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.，27(2001)325-336；Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.，12(2001)202-207；Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51(1999)297-307；和Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.，9(1998)497-501)。
由于溶解性差、折疊不正確、缺乏穩(wěn)定性和其它問題，哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞如大腸桿菌中的表達(dá)常常是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。發(fā)明人在微生物宿主細(xì)胞中通過重組表達(dá)生產(chǎn)蛋白激酶的嘗試通常導(dǎo)致只有少量的有活性的可溶性激酶，但是產(chǎn)生大量的不需要的且無活性的二聚體和更高聚集體。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述現(xiàn)在，令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的方法可以在微生物宿主細(xì)胞中的重組生成后大量回收正確折疊的激酶。
因此，本發(fā)明的目的是一種重組生產(chǎn)和純化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶選自酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成的組，該方法通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述激酶的核酸，形成包含所述蛋白激酶的內(nèi)含體，分離，溶解，復(fù)性(naturing)，和純化所述蛋白激酶而進(jìn)行，其特征在于所述純化是通過在至少70％的所述正確折疊的蛋白激酶不結(jié)合于所述吸附劑的條件下與疏水吸附劑進(jìn)行疏水相互作用而進(jìn)行和回收不結(jié)合所述吸附劑的蛋白激酶。未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合吸附劑。
優(yōu)選的是，所述蛋白激酶是src、pkb、c-met、lck、aurora或p38。
依照本發(fā)明的吸附劑優(yōu)選固體或凝膠材料，有經(jīng)過疏水殘基如苯基、丁基、或辛基殘基修飾的纖維素、交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等組成(HIC吸附劑、疏水相互作用層析吸附劑)。
優(yōu)選的是，用包含至少0.1M KCl或NaCl、更優(yōu)選0.1-1M KCl或NaCl的水溶液中的疏水性吸附劑處理激酶。更高的KCl或NaCl濃度也是可能的，只要蛋白激酶不以超過蛋白激酶蛋白質(zhì)物質(zhì)總量70％的非期望大量發(fā)生結(jié)合。另外，高鹽濃度可能使蛋白激酶不穩(wěn)定。
另外，所述疏水相互作用處理優(yōu)選在存在至少1M精氨酸或具有通式I的化合物的條件下進(jìn)行R2-CO-NRR1(I)，其中R和R1是氫或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C4烷基鏈，且R2是氫、NHR1或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C3烷基鏈。
發(fā)明詳述上文已經(jīng)定義了可以依照本發(fā)明生產(chǎn)和純化的蛋白激酶。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的方法可用于SRC激酶和環(huán)AMP依賴性蛋白激酶(PKA)的生產(chǎn)和純化。Src家族的成員有例如Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、和Blk。這些是非受體蛋白激酶，分子量范圍為52-62kD。它們的特征是共同結(jié)構(gòu)組織，即包含六個(gè)不同功能結(jié)構(gòu)域Src同源結(jié)構(gòu)域4(SH4)、獨(dú)特結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域(SH1)、和C端15調(diào)控區(qū)。環(huán)AMP依賴性蛋白激酶(PKA)是STK家族的成員。在已經(jīng)研究過的所有原核和動(dòng)物細(xì)胞中，環(huán)AMP是激素作用的胞內(nèi)介導(dǎo)物。這些由激素誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答包括甲狀腺激素分泌、皮質(zhì)醇分泌、孕酮分泌、糖原分解、骨吸收、以及心率和心肌收縮力度的調(diào)控。PKA發(fā)現(xiàn)于所有動(dòng)物細(xì)胞中，而且認(rèn)為它負(fù)責(zé)環(huán)AMP在大多數(shù)這些細(xì)胞中的作用。
可以依照本發(fā)明生產(chǎn)的上文所述蛋白激酶都在生物化學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步說明代謝關(guān)聯(lián)，不僅關(guān)注天然的蛋白激酶，而且還關(guān)注這些天然存在蛋白激酶的突變體。
依照本發(fā)明有用的吸附劑(HIC吸附劑)優(yōu)選由被疏水配基取代的凝膠基質(zhì)組成。取代的程度通常在10-50μmol/ml凝膠的范圍內(nèi)。優(yōu)選的配基是例如C2-C8烷基殘基或簡單的芳基(像苯基)殘基。通常，疏水相互作用通過添加鹽而增強(qiáng)。如果使用HIC吸附劑進(jìn)行層析，那么正確折疊形式的激酶的結(jié)合程度并不高，因此在流出液中進(jìn)行回收。
尤其優(yōu)選使用由苯基、丁基、或辛基取代的交聯(lián)瓊脂糖。這樣的吸附劑是例如苯基、丁基、或辛基瓊脂糖(如交聯(lián)瓊脂糖，4％是球形的，平均顆粒大小為90μm，顆粒大小范圍為45-165μm，取代程度約為50μmol丁基/ml凝膠)。
疏水吸附劑的處理可以以常見方式進(jìn)行，如用吸附劑的懸浮液處理包含激酶的溶液或進(jìn)行層析(HIC)。
術(shù)語“至少70％的所述蛋白激酶不結(jié)合”指在重組生產(chǎn)和復(fù)性(naturation)后回收的蛋白質(zhì)中，它包含在含激酶的水溶液復(fù)性后存在的正確折疊形式、非正確折疊形式(如多聚體等)的所述蛋白激酶、以及來自宿主細(xì)胞的其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)，至少70％的正確折疊形式不結(jié)合吸附劑且發(fā)現(xiàn)于用吸附劑處理激酶溶液后的上清液中或如果將吸附劑用于層析HIC純化中而發(fā)現(xiàn)于流出液中。
術(shù)語“正確折疊”指蛋白質(zhì)在復(fù)性后采取天然的三維結(jié)構(gòu)。這不依賴催化活性，而且還包括無催化活性的突變體。優(yōu)選的是，活性蛋白激酶是依照本發(fā)明生產(chǎn)的。
可以通過在復(fù)性后用至少0.1M KCl或NaCl、更優(yōu)選0.1-1M KCl或NaCl處理這種激酶的水溶液來實(shí)現(xiàn)激酶與吸附劑的結(jié)合率低于30％。更高的KCl或NaCl濃度也是可能的，只要蛋白激酶不以超過蛋白激酶蛋白質(zhì)物質(zhì)總量70％的非期望大量發(fā)生結(jié)合。另外，很高的鹽濃度可能使蛋白激酶不穩(wěn)定。
對于具有通式I的化合物，優(yōu)選采用甲酰胺、乙酰胺、尿素或尿素衍生物諸如乙脲或甲脲。可以使用精氨酸，例如堿性精氨酸的鹽酸化物或另一種滴定形式。然而，優(yōu)選采用L-精氨酸，更優(yōu)選采用L-精氨酸的鹽酸化物形式。
多肽在微生物宿主細(xì)胞的重組表達(dá)過程中形成不溶性內(nèi)含體。內(nèi)含體是在編碼基因過度表達(dá)的情況中發(fā)生的蛋白酶抗性錯(cuò)誤折疊形式的期望蛋白質(zhì)的折射性聚集物(Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51297-307，1999)。
適于重組基因表達(dá)的原核宿主細(xì)胞是例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，諸如大腸桿菌和枯草桿菌。合適的大腸桿菌菌株是諸如UT5600、AB101、XL1、K12、X1776、和W3110等大腸桿菌菌株。然而，其它腸桿菌科以及諸如克雷伯氏桿菌屬、沙門氏菌屬、或枯草桿菌屬等微生物、假單胞菌屬、或鏈霉菌屬也適于作為宿主細(xì)胞。同樣適于作為宿主細(xì)胞的還有酵母菌株，諸如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)。
通常將編碼多肽的核酸插入表達(dá)載體。合適的載體對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的，例如質(zhì)?；蚴删w。
宿主細(xì)胞的發(fā)酵也是依照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行的。在達(dá)到預(yù)定的細(xì)胞數(shù)目后(通過發(fā)酵液/細(xì)胞懸浮液的光密度來測量)，誘導(dǎo)重組多肽的表達(dá)，并進(jìn)行培養(yǎng)直至達(dá)到穩(wěn)定期(在分批培養(yǎng)的情況中)。在細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收獲細(xì)胞，分離并處理內(nèi)含體，即依照已知方法的溶解和復(fù)性。
提供下面的實(shí)施例、附圖、和參考文獻(xiàn)是為了幫助理解本發(fā)明，所附權(quán)利要求書列出了本發(fā)明的真正范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以對所列流程進(jìn)行修改而不違背本發(fā)明的精神。


圖1如本文所述進(jìn)行復(fù)性和疏水層析后的Src活性?；钚园l(fā)現(xiàn)于上清液(SN)中(EL＝洗脫液)。
圖2復(fù)性和丁基層析級分的SDS-PAGE，考馬斯藍(lán)染色。雖然在丁基上清液(SN)中保持了活性，但是切出了大量的失活src蛋白。1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，2復(fù)性，3復(fù)性+KCl，4丁基SN，5超濾/濃縮。
圖3復(fù)性和添加KCl或硫酸銨后的src活性。添加在疏水層析中常用的硫酸銨造成上清液中活性src的喪失。高達(dá)1M的KCl使溶液中的src保持活性并能夠在丁基瓊脂糖上分離失活的src。
圖4SDS-PAGE，考馬斯藍(lán)染色。泳道1是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，泳道2是重新折疊和丁基瓊脂糖處理后的aurora激酶制劑。箭頭aurora激酶。
圖5重新折疊和丁基瓊脂糖處理后的aurora激酶的大小排阻層析。Superdex 75(Pharmacia)10/30。緩沖液50mM TRIS pH7.5，500mM NaCl，10％甘油，3mM Chaps。流速0.5ml/分鐘。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
src的重組生產(chǎn)a)克隆將Src激酶結(jié)構(gòu)域克隆到pQE32(QIAGEN GmbH)的BamHI/HindIII位點(diǎn)中，并通過PCR在其N端引入凝血酶切割位點(diǎn)。
b)發(fā)酵為了制備接種物，將包含重組激酶蛋白生產(chǎn)所用表達(dá)質(zhì)粒的適當(dāng)大腸桿菌菌株甘油保存物1ml加到100ml LB培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)搖床上于37℃培養(yǎng)8-10小時(shí)。將此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到裝有更多LB培養(yǎng)基和葡萄糖的經(jīng)滅菌發(fā)酵罐中。在期望蛋白激酶不溶性表達(dá)成內(nèi)含體時(shí)，將主要培養(yǎng)物的溫度維持于37℃。通過提高攪拌速度將整個(gè)發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的溶氧濃度保持在高于20％的飽和度。在pH值升高時(shí)添加葡萄糖并持續(xù)補(bǔ)充酵母-蛋白胨溶液(2ml/分鐘)進(jìn)行額外的養(yǎng)分輸送。當(dāng)檢測到光密度不再升高時(shí)，停止這種補(bǔ)料分批發(fā)酵。通過離心收獲培養(yǎng)肉湯。
c)IB制備將生物物質(zhì)懸浮于含Tris和MgSO4的緩沖液中。如果需要，添加溶菌酶和DNA酶(如來自Merck的Benzonase)。通過勻漿裂解細(xì)菌細(xì)胞以釋放其中的內(nèi)含體。補(bǔ)充的DNA酶使懸浮液保持液態(tài)，這對于進(jìn)一步的處理是至關(guān)重要的。于室溫培育期后，向懸浮液中添加含NaCl、EDTA、和Brij液的第二種緩沖液。于室溫培育期后，通過離心由上清液分離隱蔽的內(nèi)含體。然后將沉淀懸浮于含Tris和EDTA的第三種緩沖液以清洗IB(內(nèi)毒素釋放)，并于室溫?cái)噭?dòng)下溫育和離心。
d)src的復(fù)性將1.3g內(nèi)含體于室溫懸浮于100ml 0.1M TRIS pH8.0、8M鹽酸胍、10mM EDTA、10mM DTT。將此src溶解物邊攪動(dòng)邊滴加到含1M TRIS pH7.0、0.5M精氨酸、10mM DTT、10片Complete的10升重新折疊緩沖液中。重新折疊過程于8℃持續(xù)3-5天，無需攪動(dòng)。
由于失活的未折疊src的高度聚集和然后活性級分免疫共沉淀，因此在此階段用不同的緩沖液(含多種添加劑的醋酸鹽、磷酸鹽、MES、TRIS pH5-9)進(jìn)行透析是不成功的。必需在透析前通過疏水層析除去復(fù)性緩沖液中的失活的未折疊src。
e)分批疏水層析將重新折疊的蛋白質(zhì)溶液設(shè)為1M KCl。隨后加入40g丁基瓊脂糖4Fast Flow(Amersham)，并于8℃結(jié)合1小時(shí)。過濾除去丁基瓊脂糖后，上清液包含正確折疊的活性src蛋白。在這些條件下，未折疊的無活性蛋白質(zhì)結(jié)合丁基瓊脂糖。此方法使得有活性的和無活性的src得以分離(圖1和2)。如果需要，可以通過額外的層析步驟即Ni-鰲合層析和大小排阻層析實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的純化。
正如在圖3中能夠看到的，添加KCl(0.2M、0.5M、和1.0M)證實(shí)優(yōu)于硫酸銨。相同濃度的硫酸銨早就引起活性src的沉淀。因?yàn)樵谥由蠐p失了大量的活性，所以使用導(dǎo)致活性src結(jié)合疏水材料的條件是不合適的。洗脫液只顯示低水平的src蛋白和活性回收。
f)src檢測使用Eu標(biāo)記(PT66 Lance Eu-W1024(Wallac))的磷酸酪氨酸抗體，并檢測時(shí)間分辯熒光信號，由此測量src激酶對src底物肽YA133的磷酸化。
實(shí)施例2aurora的重組生產(chǎn)a)克隆依照以下流程設(shè)計(jì)并克隆用于在細(xì)菌中表達(dá)人全長野生型Aurora A激酶和衍生物的載體構(gòu)建體，所述激酶和衍生物用于激酶測定法(如Elisa、HTRF、FP)和生物結(jié)構(gòu)目的。
使用基因特異性寡核苷酸引物和Pwo DNA聚合酶(Roche DiagnosticsGmbH)通過標(biāo)準(zhǔn)PCR由人HeLa cDNA文庫(Clontech)擴(kuò)增編碼人全長Aurora A激酶(第1-403位殘基)的ORF，隨后亞克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中。以這些載體為模板，使用基因特異性寡核苷酸引物通過PCR生成截短形式的Aurora A，并通過定點(diǎn)誘變生成Aurora A突變型蛋白。對于最終的表達(dá)構(gòu)建體，使用基因特異性引物和Pwo DNA聚合酶通過PCR由相應(yīng)的Aurora A基礎(chǔ)載體擴(kuò)增野生型和突變型Aurora A激酶結(jié)構(gòu)域(第114-403位殘基)。通過NdeI和XhoI限制性位點(diǎn)將PCR產(chǎn)物亞克隆到含有或不含N端RGS-(His)6標(biāo)簽在T5啟動(dòng)子控制下的經(jīng)修飾的pQE40表達(dá)載體。通過測序證實(shí)了所有載體插入片段的序列。隨后將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21和UT5600菌株中，用于通過大規(guī)模發(fā)酵以內(nèi)含體形式表達(dá)蛋白質(zhì)。在用1mM異丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)于37℃過夜誘導(dǎo)前，將大腸桿菌菌株BL21和UT5600于37℃在補(bǔ)充氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至光吸收值達(dá)到0.5-0.8，在該菌株中表達(dá)蛋白質(zhì)。誘導(dǎo)后，通過離心收獲細(xì)胞，重懸，并依照給定流程制備內(nèi)含體。
b)發(fā)酵為了制備接種物，將包含重組激酶蛋白生產(chǎn)所用表達(dá)質(zhì)粒的適當(dāng)大腸桿菌菌株甘油保存物1ml加到100ml LB培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)搖床上于37℃培養(yǎng)8-10小時(shí)。將此預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到裝有更多LB培養(yǎng)基和葡萄糖的經(jīng)滅菌發(fā)酵罐中。將主要培養(yǎng)物的溫度維持于37℃。在pH值升高時(shí)添加葡萄糖并持續(xù)補(bǔ)充酵母—蛋白胨溶液(2ml/分鐘)進(jìn)行額外的養(yǎng)分輸送。當(dāng)檢測到光密度不再升高時(shí)，停止這種補(bǔ)料分批發(fā)酵。通過離心收獲培養(yǎng)肉湯。
c)IB制備將生物物質(zhì)懸浮于含Tris和MgSO4的緩沖液中。如果需要，添加溶菌酶和DNA酶(如來自Merck的Benzonase)。通過勻漿裂解細(xì)菌細(xì)胞以釋放其中的內(nèi)含體。于室溫培育期后，向懸浮液中添加含NaCl、EDTA、和Brij液的第二種緩沖液。于室溫另外的培育期后，通過離心由上清液分離隱蔽的內(nèi)含體。然后將沉淀懸浮于含Tris和EDTA的第三種緩沖液以清洗IB，并于室溫?cái)噭?dòng)溫育和離心。
d)aurora的復(fù)性將160mg內(nèi)含體于室溫懸浮于10ml 0.1M TRIS pH8.0、8M鹽酸胍、10mM EDTA、10mM DTT。將此aurora溶解物邊攪動(dòng)邊滴加到含1M TRISpH7.0、0.5M精氨酸、10mM DTT的1升重新折疊緩沖液中。重新折疊過程于8℃持續(xù)1天，無需攪動(dòng)。
e)分批疏水層析將重新折疊的蛋白質(zhì)溶液設(shè)成1M KCl。30分鐘后加入5g丁基瓊脂糖4 Fast Flow(Amersham)，并于8℃結(jié)合1小時(shí)。過濾除去丁基瓊脂糖后，上清液主要包含正確折疊的活性aurora蛋白。在這些條件下，未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合丁基瓊脂糖。如果需要，可以通過額外的層析步驟即離子交換和大小排阻層析實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的純化。
f)重新折疊蛋白質(zhì)的分析正如在SDS-PAGE和大小排阻層析中看到的，重新折疊后丁基瓊脂糖批次的上清液含有90％以上的單體aurora激酶。
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1.一種重組生產(chǎn)和純化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶選自由酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成的組，所述方法通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述激酶的核酸，形成包含所述激酶的內(nèi)含體，分離，溶解，復(fù)性，和純化所述激酶來進(jìn)行，其特征在于所述純化是通過在至少70％所述正確折疊的蛋白激酶不結(jié)合所述吸附劑的條件下與疏水吸附劑進(jìn)行疏水相互作用而進(jìn)行和回收不結(jié)合所述吸附劑的蛋白激酶。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述激酶是src、pkb、c-met、lck或p38。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述吸附劑是苯基-、辛基-或丁基-瓊脂糖。
4.依照權(quán)利要求1至3的方法，其特征在于將所述激酶施加到包含至少0.1M KCl或NaCl的水溶液中的層析物質(zhì)上。
5.依照權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述水溶液額外包含至少1M精氨酸或具有通式I的化合物R2-CO-NRR1(I)，其中R和R1是氫或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C4烷基鏈，和R2是氫、NHR1或飽和或不飽和的、支化或非支化的C1-C3烷基鏈。
全文摘要
一種重組生產(chǎn)和純化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶選自由酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成的組，所述方法通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述激酶的核酸，形成包含所述激酶的內(nèi)含體，分離，溶解，復(fù)性，和純化所述激酶來進(jìn)行，其特征在于所述純化是通過在至少70％所述蛋白激酶不結(jié)合所述吸附劑的條件下與疏水吸附劑進(jìn)行疏水相互作用而進(jìn)行和回收不結(jié)合所述吸附劑的蛋白激酶。
文檔編號C12N9/12GK1624123SQ20041009804
公開日2005年6月8日 申請日期2004年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者胡貝特·赫騰貝格爾, 康拉德·霍諾爾德, 克里斯蒂安·克萊因, 彼得拉·呂格爾 申請人:霍夫曼—拉羅奇有限公司