專利名稱：一種新型海洋微生物溶菌酶及其高產溶菌酶的芽孢桿菌s－12的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海洋微生物，特別涉及一種新型海洋微生物溶菌酶及其高產溶菌酶的芽孢桿菌S-12。
背景技術：
海洋遼闊，微生物資源十分豐富，但由于海洋獨特的環(huán)境，包括高鹽、高壓、低營養(yǎng)、低溫等，造就了海洋微生物有別于陸生微生物的許多特異性如不易培養(yǎng)、形態(tài)多樣且在保藏和移種過程中很容易死亡等，不利于海洋微生物研究和開發(fā)的深入，因而迫切需要建立一些簡單、方便、易于操作并能在一定程度上更科學、更精確、更快速地找到并能分離得到有用微生物菌株，為海洋微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎。目前，大分子rRNA己成為一個分子指標，廣泛地用于各種微生物的遺傳和分子差異的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被測定并輸入國際基因數據庫，成為微生物鑒定分類非常有用的參照系統(tǒng)，從而可以通過對未知微生物DNA序列的測定和比較分析，達到以其進行快速、有效的鑒定分類的確定新的菌株的目的。
近年來隨著生物技術的發(fā)展，尋找具有全新性質的酶已成為國際酶制劑研究的熱點。海洋生物由于生長在海洋這一獨特的環(huán)境中，特別是生活在極端環(huán)境下的海洋微生物和微藻，能產生豐富的極端酶，造就了海洋微生物有別于陸地微生物諸多特異性，與陸地微生物所產生的酶相比，海洋酶具有更為獨特的酶學性質，因此引起了國內外研究人員的極大關注。
目前，研究較為透徹的微生物源溶菌酶主要有來自Chalaropsis的ChL(Lyne J E 1990).Streptomyces globisporus產生的M1酶(Lichenstein HS 1990)、S.coelicolor產生的Cellosyl(Astid R 2001)等。在此溶菌體系中，至少含有3種具有溶菌作用的水解酶。在水解細菌細胞壁時，這些不同的溶菌酶分別作用于細胞壁肽聚糖的不同化學位點，共同完成“溶壁”這一生物學過程。整個溶菌體系的協同作用理論上遠大于幾種純酶作用的加和，因為像酰胺酶等，其本身并不表現溶菌活性，但它的作用能夠使肽聚糖結構松散，很大程度上促進了胞壁質酶、內肽酶的分解功能。由于金黃色葡萄球菌的細胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸的6位羥基被乙酰化，根據對金黃色葡萄球菌的高活性可推測海洋溶菌酶酶系至少含有N，O-二乙酰胞壁質酶。溶解細胞壁的過程并非單一的酶類作用就可以達到，需要有作用于不同位點的多種水解酶類共同作用。而單一溶菌酶尚未見報道。溶菌酶作為一種蛋白質，其用量在化妝品中應用不受限制，能真正做到無毒、無殘留，是一種綠色防腐劑，但作為化妝品防腐劑國內外還沒有報道過。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供在中國東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到的一種高產新型海洋微生物溶菌酶的芽孢桿菌S-12。
本發(fā)明的另一目的提供由上述芽孢桿菌S-12高產海洋微生物溶菌酶。
本發(fā)明提供的新型芽孢桿菌S-12是從東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到高產新型海洋微生物溶菌酶的芽孢桿菌S-12，菌株S-12單獨構成一個分支，確定為一新型菌株。該芽孢桿菌S-12于2004年12月1日保藏于中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NOM204089。
本發(fā)明提供的芽孢桿菌S-12形態(tài)特征與生理生化特征形態(tài)特征對菌株進行革蘭氏染色，為革蘭氏陽性菌。顯微鏡形態(tài)觀察發(fā)現形態(tài)特征隨著生長時期的不同而變化，在延遲期，菌體呈細長的桿狀；在對數生長期，菌體呈短而粗的桿狀；在靜止期，菌體呈細長的桿狀，偶爾能觀察到卵圓形的芽孢；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、邊緣不平滑；不透明、不產生色素，用1％H2SO4(pH6.8)對菌株進行復染，于HPCM120型透射電鏡下觀察菌體形狀和大小，為(0.6-1.0)um×(2.0-3.0)um(圖1)。
生理生化反應特征該菌生理生化特征如表1-2。菌株能很好地利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖做碳源，為嚴格好氧菌。最適生長pH值為7.0-7.5，最適培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)基中NaCl高于6％時生長受到抑制。
表1

注+陽性；-陰性。
表2菌種特征S-12葡萄糖產酸 +VP反應 a接觸酶 +檸檬酸鹽的利用 +丙二酸鹽的利用 -反硝化 +明膠水解+精氨酸雙水解-淀粉水解+7％Nacl +生長溫度5-50℃“+”反應呈陽性或者可以生長、利用“-”反應呈陰性或者不可以生長、利用aV.P反應為弱陽性菌株S-12 16SrDNA序列經測定，全長為1543bp。經酶切圖譜分析，發(fā)現在837-842處有一個Pstl酶切位點(圖2)，表明經PStl酶切后可得到大小分別為840bP和703bP的兩個小片斷，這與其重組克隆酶切產物的電泳結果相吻合(圖2的第1泳道)。將該16SrDNA序列遞交GenBank進行Blast同源序列檢索，結果發(fā)現，在親緣關系相近的前100個序列中，前36個均為芽抱桿菌屬的菌株，S-12與他們都具有98％以上的同源性，但都低于99％，單獨構成一個分支。菌株S-12發(fā)酵液中存在能夠有效分解細菌細胞壁的物質，將其命名為海洋微生物溶菌酶(稱溶菌酶)。
(3)菌株S-12 16srRNA全序列TTTTTGATCC TGGCTCAGGA TGAACGCTGG CGGCGTGCCT AATACATGCA AGTCGAGCGAATGGATTAAG AGCTTGCTCT TATGAAGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAACCTGCCCATA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT AACATTTTGAACCGCATGGT TCGAAATTGA AAGGCGGCTT CGGCTGTCAC TTATGGATGG ACCCGCGTCGCATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAGGGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCC AATGGACGAA AGTCTGACGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCTTTCGGGTCGTAAA ACTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTGCTAG TTGAATAAGC TGGCACCTTGACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGGTGGCAAGCGT TATCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGCGCGCG CAGGTGGTTT CTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCACGGCTCA ACCGTGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGAGAC TTGAGTGCAGAAGAGGAAAG TGGAATTCCA TGTGTACGGG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGAGCGCAACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGGTTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGCAAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC TCTGACAATC CTAGAGATAGGACAGAACCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGTTGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATCATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAACTCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGTTCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGTGAGGTAACCT TTTAGGAGCC AGCCGCCGAA GGTGGGACAG ATGATTGGGG TGAAGTCGTAACAAGGGTAT ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGC16SrRNA基因序列在某些位點會以不同的幾率發(fā)生突變，在種、屬等水平上表現出結構和功能的保守性，有“細菌化石”之稱，特別是其進化具有良好的時鐘性質，是生物進化史的計時器。應用16SrRNA作為分子指標，可以實現快速、微量、準確、簡便的對微生物進行分類鑒定。
發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明提供的芽孢桿菌S-12發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選采用經過芽孢桿菌S-12的原生質體紫外線(UV)、亞硝基胍(NTG)復合誘變得到的芽孢桿菌S-12-86突變株，該株比較穩(wěn)定，酶活由原來的90u/ml達到270u/ml左右，誘變效果顯著。
(1)酶穩(wěn)定性在液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨1％、牛肉浸出粉0.3％、NaCl 0.5％(wt)中連續(xù)轉種傳代44代，結果表明，隨著傳代次數的增加酶活略有下降，但超過10代以后酶活不再下降，結果見圖3。
(2)產酶時間隨著培養(yǎng)時間的延長酶的活性逐漸升高，20-26h達到最高，之后開始下降，從細菌生長曲線圖4分析，酶的積累主要發(fā)生在對數生長后期，說明對數后期菌體的能量不再用于大量繁殖，主要消耗在其代謝產物—溶菌酶的合成上，因此酶的收獲要控制在細菌生長的穩(wěn)定期。
(3)培養(yǎng)溫度不同的溫度對產酶量和活性影響很大，在25-30℃范圍內菌體生長量隨溫度的升高而增大，但酶的活性在28-32℃之間最高，結果見圖5。也就是說最適產酶溫度和最適生長溫度并不一致，綜合考慮生物量、產酶活性、比生產量，最優(yōu)發(fā)酵溫度選擇28-30℃。
(4)種齡圖6可見，8-18h隨種齡增大，菌體生長量增大，當種齡超過20h，菌體生長緩慢。
(5)接種量圖7可見，接種量對菌體生長影響較大，接種量小時(0.5％-4％)，比生長速率大，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7左右。
(6)培養(yǎng)基pH發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值對微生物生長和酶的產生具有非常明顯的影響，見圖8-圖9。一般認為培養(yǎng)基中的H+和OH-是間接對微生物的代謝產生影響，它首先作用于胞外的可解離的弱酸(或弱堿)，形成易透過細胞膜的游離態(tài)進入胞內再作用于參與代謝的各種酶類，從而影響菌體的生長和產物的合成。結果表明在pH 6.0-8.5時細菌的生長和酶的活性較好，而pH在6.0-7.0之間酶的活性最高，這可能與該酶在較低pH下更穩(wěn)定或微生物產生的有害代謝產物比堿性條件下對生長和產酶的抑制作用弱有關，故選用發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7左右。
(7)搖床轉速搖床轉速越高溶解在培養(yǎng)基中的氧氣越多，這對菌體生長和產酶影響較大，S-12-86的培養(yǎng)是需氧發(fā)酵，因此在100-300r/min范圍內轉速的提高帶來菌體密度的提高，同時酶產量也越高，見圖10。這表明氧氣是合成溶菌酶所必需的，并且溶解氧在該菌的生長和代謝中起著較為關鍵的作用，但也不能認為發(fā)酵過程中溶解氧越高越好，因為溶解氧過大不僅造成浪費而且還可能會改變代謝途徑，應以達到該菌的臨界氧濃度為宜，當搖床轉速在300r/min時，培養(yǎng)基的溶解氧處在其合適的范圍內，圖10同時表明酶的合成比細菌生長對溶解氧的依賴性大，只有在細胞生長狀態(tài)較好的前提下才能將代謝的能量消耗在溶菌酶的合成上。
(8)裝液量培養(yǎng)過程中，該菌產酶的能力在裝液量適當增加的情況會有顯著提高。如圖11所示，當培養(yǎng)基裝液量由10ml增加到40ml，產酶能力增加，但如繼續(xù)提高裝液量則產酶能力迅速降低。這主要是因為S-12-86菌株為好氧菌，當氧氣供應太少時會嚴重影響菌體的生長，而最終影響酶的產生?？疾炀w生長量與裝液量的關系可以發(fā)現隨著培養(yǎng)基裝液量的增加，菌體的生長量總是減少的。
(9)發(fā)酵培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基是實現高效產酶的關鍵，尤其碳的含量占微生物細胞干物質的50％左右，是發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要材料。培養(yǎng)基中各組分的濃度比例要適當，如果碳氮比偏小，會導致菌體生長過盛，易造成菌體提前衰老自溶；碳氮比過大，菌體繁殖數量少、發(fā)酵密度低，細菌代謝不平衡、不利于產物的積累；碳氮比例合適，但碳源、氮源濃度過低，則會影響菌體的繁殖；當碳源、氮源濃度過高，雖然發(fā)酵起始導致菌體的大量繁殖，但發(fā)酵后期菌體生長緩慢，代謝廢物過多而增加發(fā)酵液黏度，使溶解氧降低，引起菌體代謝異常，最終也影響產物的合成。因此在進行S-12-86大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)時，需要根據菌體生長及代謝產物的特點，選擇合理培養(yǎng)基。
氮源在液體培養(yǎng)基中，氮源為有機氮源(棉籽餅粉、豆餅粉、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、牛肉浸出粉)或無機氮源(尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4)，濃度均為1％，結果見圖12。結果表明菌株S-12-86利用無機氮源優(yōu)于有機氮源，最佳氮源為NH4Cl、(NH4)2SO4。
碳源以NH4Cl為氮源，碳源選用葡萄糖、蔗糖、糊精、淀粉、米糠、玉米粉、麩皮、花生粕，濃度均為1％，結果見圖13。表明當碳源為糊精、花生粕、蔗糖、淀粉時，酶活較高，但選用蔗糖時，酶活達到最高后下降的過快，不利于工業(yè)上大規(guī)模發(fā)酵；選用淀粉時，發(fā)酵周期過長，同樣不符合工業(yè)生產上節(jié)約成本的要求。而以糊精、花生粕為碳源時，酶活較高、下降緩慢、發(fā)酵周期短，二者都是較好的碳源，因此選擇糊精、花生粕最為該菌產酶的碳源。
碳氮比通過單因子實驗確定了糊精、花生粕為產酶最佳碳源，(NH4)2SO4、NH4Cl為最佳氮源，碳氮源最佳組合為糊精2％、花生粕2％、NH4Cl 1％、(NH4)2SO41％。
本發(fā)明提供的芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化是一個十分復雜的工作。貧瘠和加富的培養(yǎng)基對細菌的生長和產酶都有相當的影響，營養(yǎng)不足會導致細菌提前進入衰亡期，產量減少；營養(yǎng)過于豐富會導致細菌代謝途徑發(fā)生一定的變化，造成底物抑制，不僅細菌生物量減少，同時造成產酶量減少，對酶的合成有明顯的抑制作用。進一步證實了搖床轉速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)時間等培養(yǎng)條件對產酶有顯著性影響，對產酶影響顯著性的順序為培養(yǎng)溫度、種齡、培養(yǎng)時間、接種量、起始pH值?？紤]到酶的總活性并結合單因子實驗結果，通過三角瓶培養(yǎng)S-12-86菌溶菌酶的優(yōu)化發(fā)酵條件為以糊精2％、花生粕2％為碳源，以NH4Cl 1％、(NH4)2SO41％。為氮源，起始pH值7，接種20h種齡的種子6％，25℃、250r/min的條件下在旋轉搖床中培養(yǎng)27h。
海洋獨特的環(huán)境，造就了海洋微生物有別于陸地微生物的諸多特異性，本發(fā)明提供的溶菌酶生產菌株中海洋芽孢桿菌S-12-86與其它產酶菌株相比，對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件要求簡單，更利于大規(guī)模工業(yè)化生產。對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化后酶活有大幅度提高。
海洋微生物溶菌酶的純化新型海洋微生物溶菌酶的分離純化將溶菌酶發(fā)酵液經過如下步驟粗酶的制備將發(fā)酵液在4℃以下以4000r/min離心40min，獲得含溶菌酶的上清液。
超濾濃縮選取截留分子量為50kDa和10kDa的膜對溶菌酶進行初步純化。發(fā)酵液經超濾濃縮后，溶菌酶比活為286.9U/mg，純化倍數為3.0。
陽離子交換層析以CM Sepharose FF陽離子交換層析柱對超濾濃縮樣品進行層析，上樣緩沖液為pH 3.8，10mmol/L檸檬酸-1mmol/L Na2HPO4緩沖液，用含有NaCl緩沖液洗脫，NaCl濃度梯度為0～1.0mol/L，流速1.0ml/min，收集活性組分并進行透析濃縮。經CM-Sepharose FF陽離子柱層析純化后，溶菌酶比活達到了2078.2U/mg，純度提高了7.3倍，此步純化效果比較明顯，去除了大部分雜蛋白。
凝膠層析將CM-Sepharose FF陽離子交換柱層析純化所得濃縮樣品用Sephadex G-100凝膠層析柱進行層析，用pH為6.5的5mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速0.1ml/min，收集活性組分并進行透析濃縮。經Sephadex G-100凝膠層析純化后溶菌酶比活達到3279.5U/mg，純度提高了1.6倍。
海洋溶菌酶酶學性質①溶菌酶分子量為39KD②溶菌酶的分子由354個氨基酸組成③等電點為pI＞9④酶的最適pH和最適作用溫度以溶壁微球菌為底物測定純酶在不同pH緩沖液和不同溫度下的相對酶活，結果見圖14，該溶菌酶最適pH 8，最適作用溫度35℃，在5℃仍保持酶活力的25％，具有低溫酶的典型特征。
④金屬離子對酶活力的影響將酶液與各種金屬離子(濃度1×10-2mol/L)混合后置20℃，保溫30min，同時以不加金屬離子的酶液為對照，結果見圖15。表明，大部分金屬離子對酶活沒有影響，Co2+、Cu2+、Ag+對酶活略有激活作用，Mg2+、Zn2+、Ca2+有抑制作用。
⑤酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性將酶液分別置于一系列不同的pH緩沖液中，20℃保溫30min，然后于20℃、pH 6.0測定酶活力(圖16-17)，結果表明酶在pH 4.0-10.0之間穩(wěn)定性好。將酶液在20、25、35、40、45℃下保溫不同時間，測定酶活力(圖17)，結果表明酶在小于45℃時有較好的穩(wěn)定性。
⑥海洋溶菌酶抑菌譜以革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌共18株菌株作為檢測指示菌，采用MIC法測定溶菌酶對這些菌株的抑菌作用。結果表明(表3)該溶菌酶有較寬的抑菌譜，對18株菌種都有不同程度的抑制作用，其中以對革蘭氏陰性菌的抑菌效果最為明顯。
表3溶菌酶的抑菌譜

*青島大學醫(yī)學院提供的臨床分離菌海洋溶菌酶是一種應用前景很好的生物酶制劑。對進行溶菌特異性試驗的大部分菌株，它均有溶解能力，這一點是卵清溶菌酶無法比擬的。海洋溶菌酶能分解卵清溶菌酶不能分解的金黃色葡萄球菌，可能是一種內-N，O-二乙酰胞壁質酶。
⑦海洋溶菌酶與其他微生物溶菌酶抑菌譜表4不同來源微生物溶菌酶對細胞壁的作用


已有的微生物溶菌酶都是以HEWL不能分解的底物(如金黃色葡萄球菌)為底物篩選出來的，一般不能分解革蘭氏陰性菌，芽孢桿菌S-12-86產生的海洋溶菌酶為一種新型溶菌酶，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有強烈的抑菌作用。古伊森等人認為細菌細胞壁外膜上的脂多糖對HEWL有很強的親和性，從而阻止酶的滲透，使HEWL不能分解革蘭氏陰性菌。海洋溶菌酶可能與革蘭氏陰性菌外層成分的脂多糖無親和性，所以能很好的分解革蘭氏陰性菌。
⑧海洋溶菌酶與其他微生物來源溶菌酶性質的比較表5幾種微生物溶菌酶的性質比較

*SA金黃色葡萄球菌；CW細胞壁；MI溶壁小球菌；PA綠膿桿菌；⑨海洋溶菌酶與護膚化妝品重要原料的配伍性評價將護扶化妝品常用原料按所示濃度加到含海洋溶菌酶的緩沖液中，測定酶活力，結果見表6。表明橄欖油、貂油、凡士林對溶菌酶酶活略有抑制作用，山梨醇對酶活有明顯激活作用，其它原料對酶活基本沒有影響，由此可認為實際防腐過程中各種護膚化妝品常用原料與酶有良好的配伍性。同時本文考察了海洋溶菌酶在護膚化妝品原料中的穩(wěn)定性，研究表明該酶在原料溶液中作用1-30天，其酶活沒有明顯下降，說明該酶在化妝品防腐過程中不會失活。
表6護膚化妝品中主要原料對酶活性影響

⑩海洋溶菌酶與表面活性劑的配伍性護膚用化妝品直接涂敷在皮膚表面，具有清潔皮膚、保持皮膚濕潤、促進皮膚新陳代謝和維護皮膚健康等功能。因此，它的各種組份配制應盡量和皮脂相近，使其既能起到抵御外界的物理、化學刺激，又不防礙皮膚的正常生理功能。尤其重要的是它必須能防止因干性和脂性所引起的各種皮膚疾病，而且還能調節(jié)皮膚生理機能和美化肌膚。護膚化妝品中的表面活性劑與制品的功能無直接關系，作為乳化劑使用的表面活性劑以安全性較高的E0型非離子表面活性劑為主。將非離子表面活性劑月桂醇聚氧乙烯醚、硬脂醇聚氧乙烯醚、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯羊毛脂脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酰胺(圖中對應A、B、C、D、E)分別與海洋溶菌酶作用60min，按1.2.1方法所示測定酶剩余活力。結果表明(圖18)，非離子表面活性劑僅在高濃度時對酶活有抑制作用。


圖1對數生長期菌體形態(tài)(10000×)圖2 16SrDNA的PCR擴增及Pst I酶切鑒定圖3不同傳代次數對酶活的影響圖4培養(yǎng)時間對細胞生長、產酶的影響圖5培養(yǎng)溫度對細胞生長、產酶的影響圖6接種齡對酶活的影響圖7接種量對產酶的影響圖8起始pH值對最終pH值的影響圖9培養(yǎng)基起始pH對細胞生長、產酶的影響圖10搖床轉速對酶活的影響圖11裝液量對S-12-86菌株產酶能力及細胞生長量的影響圖12氮源對溶菌酶活性的影響圖13碳源對溶菌酶活性的影響圖14溫度和pH對酶活的影響圖15金屬離子對酶活性的影響圖16酶的pH穩(wěn)定性(20℃)圖17酶的熱穩(wěn)定性(pH 6.0)圖18非離子表面活性劑對酶活的影響本發(fā)明用下列實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下列實施例實施例1初篩將適當稀釋的東海海域海泥懸液涂布在含金黃色葡萄球菌的平板，30℃恒溫培養(yǎng)2天，將透明圈較大的菌株接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行復篩，挑選發(fā)酵液溶菌活力較強的菌株牛奶管保存，記為S-12，其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基％(wt)牛肉浸出粉0.3，蛋白胨0.5，NaCl0.5，自來水配制。
將菌S-12首先原生質體化并調整細胞濃度，先用亞硝酸基胍20h，然后用此外線照射1分鐘，涂再生平板培養(yǎng)篩選，最終得菌株S-12-86突變株。
粗酶液制備取斜面保存的S-12-86突變株菌株一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基，30℃，150r/min培養(yǎng)24h.發(fā)酵液4000r/min離心20min，所得上清液即為溶菌酶粗酶液。種子培養(yǎng)基為(％wt)牛肉浸出粉1，蛋白胨1，NaCl 0.5，瓊脂2，pH 7.5。
超濾濃縮將含溶菌酶的上清液用SCM杯式超濾系統(tǒng)進行分級，膜截留分子量為50kDa，壓力0.1MPa，再以截留分子量為10kDa的膜進行濃縮，濃縮倍數為5倍，溶菌酶比活為86.9u/mg。
陽離子交換柱層析以CM-Sepharose FF陽離子交換層析柱(2.5cm×10cm)對溶菌酶進行層析，分部收集洗脫液，并測定溶菌酶比活。上樣緩沖液pH 3.8，10mmol/L檸檬酸-1mmol/L Na2HPO4緩沖液，用含有NaCl緩沖液洗脫，NaCl濃度梯度為0～1.0mol/L，流速1.0ml/min，經CM-Sepharose FF陽離子柱層析純化后，溶菌酶比活達到了2078.2U/mg，純度提高了7.3倍，去除了大部分雜蛋白。
凝膠層析以Sephadex G-100凝膠層析柱(1.6cm×60cm)對溶菌酶進行層析，分部收集洗脫液，并測定溶菌酶比活3279.5U/mg，純度提高了1.6倍。其中用pH為6.5的5mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速0.1ml/min。
溶菌酶分子量測定采用SDS-PAGE方法測定，為39KD。
溶菌酶活性的測定用60mmol/L、pH6.2的磷酸緩沖液配制一定濁度(A450＝0.6-0.7)的溶壁微球菌為底物，取0.5ml酶液加入2.5ml底物(20℃)中，迅速混合，在波長450nm處讀取反應體系5min內每隔15s的吸光度。以ΔA450/min變化0.001個吸光度值為一個活性單位。
實施例2實施例2的方法步驟相同于實施例1，所不同是通過三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為以糊精2％、花生粕2％為碳源，以NH4CL 1％、(NH4)2SO41％。為氮源，起始pH值7，接種20h種齡的種子6％，25℃、250r/min的條件下在旋轉搖床中培養(yǎng)27h。
權利要求
1.一種芽孢桿菌S-12為從東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得高產海洋微生物溶菌酶的芽孢桿菌S-12，為芽孢桿菌的新種，該菌株保藏在中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM204089。
2.根據權利要求1的芽孢桿菌S-12，其特征在于該菌株形態(tài)特征與生物生化特征形態(tài)特征對菌株進行革蘭氏染色，為革蘭氏陽性菌，顯微鏡形態(tài)觀察發(fā)現形態(tài)特征隨著生長時期的不同而變化，在延遲期，菌體呈細長的桿狀；在對數生長期，菌體呈短而粗的桿狀；在靜止期，菌體呈細長的桿狀，偶爾能觀察到卵圓形的芽孢；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、邊緣不平滑；不透明、不產生色素，用1％H2SO4(pH6.8)對菌株進行復染，于HPCM120型透射電鏡下觀察菌體形狀和大小，為(0.6-1.0)um×(2.0-3.0)um；生理生化反應特征最適生長pH值為7.0-7.5，最適培養(yǎng)溫度為30℃，
3.根據權利要求1的芽孢桿菌S-12，其特征在于該菌株S-12 16srRNA全序列如下，全長為1543bp，TTTTTGATCC TGGCTCAGGA TGAACGCTGG CGGCGTGCCT AATACATGCA AGTCGAGCGAATGGATTAAG AGCTTGCTCT TATGAAGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAACCTGCCCATA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT AACATTTTGAACCGCATGGT TCGAAATTGA AAGGCGGCTT CGGCTGTCAC TTATGGATGG ACCCGCGTCGCATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAGGGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCC AATGGACGAA AGTCTGACGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCTTTCGGGTCGTAAA ACTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTGCTAG TTGAATAAGC TGGCACCTTGACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGGTGGCAAGCGT TATCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGCGCGCG CAGGTGGTTT CTTAAGTCTGATGTGAAAGC CCACGGCTCA ACCGTGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGAGAC TTGAGTGCAGAAGAGGAAAG TGGAATTCCA TGTGTACGGG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGAGCGCAACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGGTTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGCAAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC TCTGACAATC CTAGAGATAGGACAGAACCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGTTGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATCATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAACTCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGTTCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGTGAGGTAACCT TTTAGGAGCC AGCCGCCGAA GGTGGGACAG ATGATTGGGG TGAAGTCGTAACAAGGGTAT ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGC。
4.一種海洋微生物溶菌酶，其特征在于由芽孢桿菌S-12產生的海洋微生物溶菌酶。
5.根據權利要求4的海洋微生物溶菌酶，其特征在于海洋微生物溶菌酶的理化性質為溶菌酶的分子量為39KD；溶菌酶的分子由354個氨基酸組成；溶菌酶的等電點為pI＞9；溶菌酶最適pH為8；溶菌酶的最適作用溫度為35℃；金屬離子對酶活力的影響大部份金屬離子對酶活沒有影響，Co2+、Cu2+、Ag+對酶活略有激活作用，Mg2+、Zn2+、Ca2+有抑制作用；酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性酶在pH4.0-10.0之間穩(wěn)定性好，酶在45℃時較好的穩(wěn)定性；海洋溶菌酶抑菌譜該溶菌酶有較寬的抑菌譜，對下列18株菌種都有不同程度的抑制作用，對革蘭氏陰性菌的抑菌效果最為明顯，該溶菌酶對革蘭氏陽性或陰性菌都有強烈抑菌作用；菌株 MIC(％) 菌株 MIC(％)金黃色葡萄球菌JCM-24130.35 變形鏈球菌JCM-51750.088短小芽孢桿菌AS 1.594 0.35 藤黃微球菌CCGMC 1.02580.35白色葡萄球CCGMC 1.01840.175大腸桿菌ATCC 441040.175枯草芽孢桿菌CCGMC 1.0107 0.175*化膿性鏈球菌 0.175溶壁微球菌ATCC49861 0.35 *肺炎鏈球菌 0.044蠟狀芽孢桿菌ASI.126 0.088*肺炎克雷伯氏菌 0.088銅綠假單胞菌IFO-3446 0.175*白色念珠球菌 0.35黑曲霉0.35 *生孢梭菌 0.35*表葡萄球菌 0.175鼠傷寒沙門氏CCGMC 1.1190 0.35
溶菌酶與護膚化妝品重要原料的配伍性橄欖油、貂油、凡士林對溶菌酶酶活略有抑制作用，山梨醇對酶活有明顯激活作用，其它原料對酶活基本沒有影響，添加劑 質量％ 酶殘余活力1天2天15天 30天橄欖油 5.010010098 97玉米油 5.0100100100100葵花籽油5.0100100100100貂油5.010099 98 98卵磷脂 4.0100100100100羊毛脂 3.010010010099蜂蠟11.0 10010099 99鯨蠟5.010010010099凡士林 8.010098 98 97硅油5.0100100100100硬脂酸 1.510010099 99大豆甾醇3.0100100100100肉豆蔻酸異丙脂 5.010010010099硬脂酸單甘油脂 6.010010010099鯨醇5.010099 99 98甘油5.010010099 99丙二醇 5.010010010098聚乙烯醇5.0100100100100三乙醇胺(80％) 0.510099 99 99石蠟8.0100100100100山梨醇(70％)5.0108105105105。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到高產海洋微生物溶菌酶的芽孢桿菌S－12菌種，保藏在中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM204089，該菌株S－12與芽孢桿菌屬的菌種同源性高于98％，低于99％，單獨構成一個分支，為一新菌種。由該菌株產的溶菌酶分子量39KD，由354個氨基酸組成，對溶壁微球菌的最適作用溫度35℃，5℃仍能保持25％的溶菌活性，可廣泛應用于化妝品、醫(yī)藥、消毒劑和養(yǎng)殖等領域。
文檔編號C12N1/20GK1687397SQ20041009708
公開日2005年10月26日 申請日期2004年12月21日 優(yōu)先權日2004年12月21日
發(fā)明者孫謐, 王躍軍, 張琇, 袁翠 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所