專利名稱：一種N端特異的人Dbf4多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗用的生物制品，具體是一種N端特 異的Dbf4多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Dbf4 (activator of S phase kinase)做為CDC7的一個調(diào)節(jié)亞基在激活
其激酶活性的過程中發(fā)揮作用，它是細(xì)胞進(jìn)入S期必需的。CDC7-DBF4的復(fù) 合物選擇性地將染色質(zhì)相關(guān)的MCM復(fù)合物亞基MCM2進(jìn)行磷酸化，然后參與 調(diào)控細(xì)胞周期中DNA復(fù)制的啟動。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決通過免疫實驗特異性檢測Dbf4的表達(dá)與天然存在，并 建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問題，而提供的一種能特異性針 對Dbf4的N端的合成多肽、相應(yīng)抗體及其制備方法。本發(fā)明還可同時解決 目前使用的類似抗體價格高，親和力低，抗體結(jié)合蛋白的位置不特異且抗原性較差等問題。本發(fā)明所述的抗Dbf4合成多肽、相應(yīng)抗體，按照以下步驟
制備
抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預(yù)測軟件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等進(jìn)行綜合分析，主要考量指標(biāo)包括親水性結(jié)構(gòu)、抗原 指數(shù)、表面可及性等，再結(jié)合我們已有實際制備抗體的驗證經(jīng)驗，最終確定 第5到第19位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為AMRIHSKGHFQGGIQ。
多肽的合成耙標(biāo)多肽采用全自動多通道多肽合成儀合成，柱層析純化， 然后通過HPLC，用每分鐘1%的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來檢測純度。
多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小，在動物體內(nèi)不能誘 導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫，選擇鑰孔嘁 血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制備出人工免疫原。
免疫動物所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原，免疫 家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過適應(yīng)性詞養(yǎng)后進(jìn)行多點注射 免疫。反復(fù)加強免疫，至取血測抗體效價達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時停止免疫。
抗體純化達(dá)到要求的免疫動物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次使用 辛酸"^酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進(jìn)行抗血清純化，通過
SDS-PAGE和HPLC驗證純度，得到目標(biāo)抗體。
本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價高、親和力強，可與天然Dbf4分子 發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測和WB試驗 要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為Dbf4分子的研 究及其相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防和控制) 提供了一個重要的工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對相應(yīng)靶蛋白的特性、含量 測定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。


圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。 圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。
圖3是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對親和常數(shù)結(jié)果圖。
圖1表明經(jīng)過HPLC對合成的多肽進(jìn)行純化后，液相色譜鑒定純度為 93.7%。
圖2表明多肽分子量理論值為1769.1，質(zhì)譜鑒定實測值M+H+為 1770.3。
圖3中ELISA檢測制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為109-101。L/mol。
具體實施方式
實施例1: Dbf4抗原肽的合成。
用DNAstar, OMIGA， UWGCG等蛋白分析軟件，對Dbf4氨基酸序 列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面可及性 (surface probability)以及同源性(homology)等分析，再結(jié)合我們已有實 際制備抗體的驗證經(jīng)驗，最終確定第5到第19位為靶標(biāo)，其氨基酸序列為 AMRIHSKGHFQGGIQ。在全自動多肽合成儀上由同定羧基向氨基端遞減合 成后獲得粗品。經(jīng)30。/。乙睛溶解后，進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC)分析，計 算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽，質(zhì)譜鑒定。
實施例2:合成多肽與載體的偶聯(lián)。
載體蛋白選擇KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進(jìn)行偶聯(lián) 取KLH5mg (0.11pmol，含賴氨酸2.2pmo1)，溶于0.75mL偶聯(lián)緩沖液 1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mg MBS (11pmo)溶于75pL 二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，室溫下 作用30分鐘。迅速離心后，將反應(yīng)混合物(約0.8mL)加入預(yù)先用偶聯(lián)緩 沖液2 (0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA, pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫，收集洗脫液(即MBS-KLH溶液)。 溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶聯(lián)緩沖液2，加入MBS-KLH緩沖液0.56， 室溫下旋轉(zhuǎn)混合，作用2小時后置4。C過夜，將反應(yīng)混合物(約0.7mL) 加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將 KLH、 MBS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-PAGE (聚丙 烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯(lián)效率。實施例3:抗多肽抗體的制備。
取偶聯(lián)的KLH-多肽500jjg，溶于50(HjL磷酸緩沖液，加等體積完全福 氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標(biāo)準(zhǔn)為2-2.5公斤)，經(jīng)過適 應(yīng)性飼養(yǎng)后，背部皮內(nèi)不少于15點注射。2周后抗原量減半(25(Hig)，加 等體積不完全福氏佐劑，第一次加強免疫。2周后進(jìn)行第二次加強免疫，方 法同前。再2周后耳緣靜脈少量采血，用合成多肽(1pg/mL)包被酶標(biāo)板， 間接ELISA法檢測免疫血清效價。反復(fù)加強免疫，至取血測抗體效價達(dá)到1: 16萬時停止免疫，采用頸動脈放血收集抗體。
實施例4:親和層析純化抗多肽抗體。
① Dbf4合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化S印harose 4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯(lián)緩沖液洗2次，迅速 與溶于5mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500yg混合，室溫下旋轉(zhuǎn)混合2小時。 加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng)，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1小時。用偶聯(lián)緩沖 液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50mL磷酸鹽緩沖液洗凝膠，按 終止?jié)舛?.02%加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。
② 親和層析純化抗多肽抗體:將20mL兔抗多肽血清與1.6mL多肽偶聯(lián) 的Sepharose 4B共同加入50mL離心管，4°C旋轉(zhuǎn)混合6小時。將凝膠加 入層析柱，棄去流出液，用15mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加0.8mL pH2.9， 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別加入8支預(yù)先加 入80jiL 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) , 20mL磷酸鹽緩沖液洗凝膠。上述全部操作過程在4°C下完成。每管取洗脫液2|jL，稀釋50倍后測280nm 的OD值，計算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。
實施例5:抗體的鑒定，使用間接ELISA方法檢測抗體相對親和常數(shù)。
用合成肽交聯(lián)BSA，分別以5 ug/mL和10 u g/mL的濃度，在4度 下包被ELISA檢測板過夜，10%的山羊血清室溫封閉2小時后加入倍比稀釋 的已知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔lgG二抗 0.1mL， TMB顯色測定A45()。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以曲線達(dá)到水平 時的A45o值為100%，以其他相對于該濃度的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，求出A50 即50。/。A值對應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff-(n-1)/2(n[Ab' ] t-2[Abt)算出抗 體相對親和常數(shù)，其中[Ab' ]t Ab]t指的是A5o時即包被抗原分別為5 ug/mL和10ug/mL時抗體半飽和時抗體的摩爾濃度，[Ag] tAg' ]t指 的是包被的抗原濃度本實驗中即指10ug和5ug， n=Agt/Ag， ] t,本實 驗中n=2。
試驗效果
1. Dbf4合成多肽HPLC純化后，使用液相色譜鑒定純度為93.7%。 多肽分子量理論值為1769.1，質(zhì)譜鑒定實測值WI+H+為1770.3。
2. 多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回收 率大致相符，大于80%。
3. 抗體效價多只家兔得到的抗血清效價均在1:100萬以上。4. 抗體親和力相對親和常數(shù)為10、10"L/mo1。
5. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標(biāo)的實現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋白
印跡和各種酶免實驗，以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。序列表
<110>北京意宏安生物科技有限公司
<120> —種N端特異的人Dbf4多肽及其抗體制備方法 <160> 2
<210> 1 <211>674 <212> PRT <213>人
<400> 1
MNSGAMRIHSKGHFQGGIQVKNEKNRPSLKSLKTDNRPEKSKCKPL WGKVFYLDLPSVTISEKLQKDIKDLGGRVEEFLSKDISYLISNKKEAKFAQT LGRISPVPSPESAYTAETTSPHPSHDGSSFKSPDTVCLSRGKLLVEKAIKDH DFIPSNSILSNALSWGVKILHIDDIRYYIEQKKKELYLLKKSSTSVRDGGKRV GSGAQKTRTGRLKKPFVKVEDMSQLYRPFYLQLT剛PFINYSIQKPCSPFD VDKPSSMQKQTQVKLRIQTDGDKYGGTSIQLQLKEKKKKGYCECCLQKY EDLETHLLSEQHRNFAQSNQYQWDDIVSKLVFDFVEYEKDTPKKKRIKYS VGSLSPVSASVLKKTEQKEKVELQHISQKDCQEDDTTVKEQNFLYKETQE TEKKLLFISEPIPHPSNELRGLNEKMSNKCSMLSTAEDDIRQNFTQLPLHK NKQECILDISEHTLSENDLEELRVDHYKCNIQASVHVSDFSTDNSGSQPKQ KSDTVLFPAKDLKEKDLHSIFTHDSGLITINSSQEHLTVQAKAPFHTPPEEPNECDFKNMDSLPSGKIHRKVKIILGRNRKENLEPNAEFDKRTEFITQEENRI CSSPVQSLLDLFQTSEEKSEFLGFTSYTEKSGICNVLDIWEEENSDNLLTAF FSSPSTSTFTGF
<210> 2 <211>15 <212> PRT <213>人
<400> 2
AMRIHSKGHFQGGIQ
權(quán)利要求
1.一種N端特異的人Dbf4多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為AMRIHSKGHFQGGIQ。
2. —種特異的抗人Dbf4N端合成多肽抗體，其特征在于該抗體效價在l: 1000000以上，特 異性強，親和力高達(dá)109—101QL/mol。
3. —種特異的抗人Dbf4N端合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以人Dbf4氨基酸序列中 第5到第19位的AMRIHSKGHFQGGIQ肽段序列作為抗原肽合成人Dbf4抗原肽；純化 的抗原肽與蛋白載體偶聯(lián)，經(jīng)柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動物，制備多肽抗 體，并經(jīng)親和層析純化而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔嘁血藍(lán)素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯(lián)的KLH—多肽加福氏佐劑免疫后收集 抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，免疫家 兔制備兔抗人Dbf4合成多肽抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯(lián)Sepharose4B，制備親和層析 柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種N端特異的人Dbf4多肽及其抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外試驗用的生物制品。N端特異的人Dbf4多肽的氨基酸序列為AMRIHSKGHFQGGIQ。抗人Dbf4多肽抗體按以下方法制備(1)人Dbf4抗原表位的分析；(2)人Dbf4 N端多肽的合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人Dbf4多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人Dbf4多肽抗體。本發(fā)明制備的N端特異的抗人Dbf4合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人Dbf4發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)；制備成本低；純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為研究Dbf4在細(xì)胞周期中的生物學(xué)作用提供了較為有用的工具。
文檔編號C07K16/18GK101319006SQ20071010021
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者杜宏武, 陳光宇 申請人:北京意宏安生物科技有限公司