專利名稱：用于鑒定rho激酶(rok)調(diào)節(jié)物的高通量酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ht－elisa)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過生物素化的肽測(cè)量ROK(Rho激酶)蛋白活性的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于鑒定調(diào)節(jié)(刺激、減弱、維持)ROK蛋白活性的化合物的檢測(cè)方法，其中a]提供能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；b]提供ROK蛋白；c]提供抗體，此抗體能夠識(shí)別來自a]的被磷酸化的肽；d]提供化合物；e]在能夠使該肽發(fā)生磷酸化的條件下，孵育來自a]的肽與來自b]的ROK蛋白以及來自d]的化合物；f]按照e]的孵育完成之后，使用來自c]的抗體檢測(cè)該肽的磷酸化；g]可以將來自f]的結(jié)果與另一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，所述另一實(shí)驗(yàn)中對(duì)來自a]的肽與來自b]的ROK蛋白而不含d]所給的化合物進(jìn)行孵育。
可以以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或放射免疫測(cè)定(RadioImmun Assay，RIA)的形式容易地實(shí)現(xiàn)這樣的檢測(cè)。
至于如前所述測(cè)定步驟a]的肽可以由15至25個(gè)氨基酸之間的大小組成。此肽可以包含如下氨基酸序列或由其組成GGGGAKRRRLSSLRASTS?？梢砸曰瘜W(xué)修飾的形式(如生物素化或連接于DNA或抗體)使用測(cè)定步驟a]的該肽。
如前所述測(cè)定步驟b]的ROK蛋白可以包含人蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或者可以從人生物材料衍生或取得?？梢酝ㄟ^不同技術(shù)(例如通過對(duì)生物材料的操作或包括重組特性的加工步驟)來制備這樣的ROK蛋白?？梢岳鐚⑷缜懊婀_的本發(fā)明的檢測(cè)方法用于高通量篩選調(diào)節(jié)ROK蛋白活性的化合物。
本發(fā)明還涉及成套藥盒，其包括a]能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；b]ROK蛋白；c]能夠識(shí)別來自a]的被磷酸化的肽的抗體；d]可能的第二抗體，其能夠識(shí)別來自c]的抗體，和/或連接于標(biāo)記系統(tǒng)(如堿性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、過氧化物酶、其它酶)；e]可能的試劑、緩沖液和/或用于實(shí)現(xiàn)來自a]的肽磷酸化的設(shè)備和/或ELISA裝置。
以上提到的成套藥盒的步驟a]的肽由15至25個(gè)氨基酸之間的大小組成。該肽可以包含以下氨基酸序列或由組成GGGGAKRRRLSSLRASTS。根據(jù)測(cè)定步驟a]的肽可以以化學(xué)修飾的形式(如生物素化、或連接于DNA或抗體)使用。如前所述測(cè)定步驟b]的ROK蛋白可以包含人蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或者可以從人生物材料衍生或取得?？梢酝ㄟ^不同技術(shù)(例如通過生物材料的操作或包括重組特性的加工步驟)來制備這樣的ROK蛋白。
本發(fā)明還涉及如前面提到的成套藥盒的制備方法，其中a]提供能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；b]提供ROK蛋白；c]提供抗體，此抗體能夠識(shí)別來自a]的被磷酸化的肽；d]提供可能的第二抗體，其能夠識(shí)別來自c]的抗體和/或連接于標(biāo)記系統(tǒng)(如堿性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、過氧化物酶、其它酶)；
e]可能的試劑、緩沖液和/或用于實(shí)現(xiàn)來自a]的肽磷酸化的設(shè)備，和/或ELISA裝置。
f]來自a]至e]的組分被相應(yīng)地包裝并與說明書組合，所述說明書涉及成套藥盒的其它組分以及ROK蛋白檢測(cè)的操作步驟。
如前所述的成套藥盒可以例如用于確定ROK蛋白的活性，或用于鑒定調(diào)節(jié)ROK蛋白活性的化合物，或用于高通量篩選。
此發(fā)明還涉及肽，所述肽包含如下氨基酸序列或由其組成GGGGAKRRRLSSLRASTS?？梢詫?duì)這樣的肽進(jìn)行化學(xué)修飾，例如生物素化。本發(fā)明還涉及這樣的肽用于測(cè)量ROK蛋白活性的用途。
本發(fā)明的化合物應(yīng)該意指通過化學(xué)合成產(chǎn)生或從天然來源分離的任何有機(jī)化合物和/或碳水化合物。這樣的化合物的分子量可以在50至50 000道爾頓之間。
認(rèn)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)在處于其行使活性的生物學(xué)環(huán)境(特別是活細(xì)胞部分)中時(shí)是有功能的。能夠通過例如測(cè)定檢測(cè)到這樣的活性。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是有功能的，例如當(dāng)此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將化合物，特別是該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)底物從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室時(shí)(反之亦然)。離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)底物由例如單價(jià)和/或二價(jià)離子或其它離子組成。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物是例如葡萄糖。多種藥物抗性蛋白的底物是例如單獨(dú)的藥物或綴合于谷胱甘肽或葡糖酸鹽的藥物。
本發(fā)明中的蛋白質(zhì)操作可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用依據(jù)Hohn Wiley和Sons出版的《現(xiàn)代蛋白質(zhì)科學(xué)操作手冊(cè)》(編者John E.Coligan、Ben M.Dunn、Hidde L、Ploegh、David W.Speicher、Paul T.Wingfield；0-471-11184-8-Looseleaf；0-471-14098-8-CDROM)的操作手冊(cè)完成。
關(guān)于分子生物學(xué)技術(shù)的操作(如克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、測(cè)序、啟動(dòng)子修飾、蛋白質(zhì)表達(dá)或其它)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用依據(jù)JohnWiley和Sons出版的《現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)》(編者Fred M.Ausubel、Roger Brent、Robert E.Kingston、David D.Moore、J.G.Seidman、John A.Smith、Kevin Struhl；0-471-50338-X-Looseleaf；0-471-306614CDROM)的操作手冊(cè)完成。
生物材料意指含有遺傳信息并能夠自我增殖或在生物系統(tǒng)中增殖的任何材料。重組的生物材料是指通過重組技術(shù)改變或修飾而產(chǎn)生的任何生物材料。在John Wiley和Sons出版的《現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)》(ISBN0471-50338-X-Looseleaf or0-471-30661-4-CD-ROM)中定義了重組技術(shù)。
生物細(xì)胞的操作可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用依據(jù)JohnWiley和Sons出版的《現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)手冊(cè)》(編者Juan S.Bonifacino、Mary Dasso、Jennifer Lippincott-Schwartz、Joe B.Harford、Kenneth M.Yamada；0-471-24108-3-Looseleaf；0-471-24105-9-CDROM)的操作手冊(cè)完成。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例Rho激酶(ROK)代表高度確認(rèn)的心血管疾病的靶標(biāo)。因此，對(duì)特異性ROK抑制劑的研究是心血管領(lǐng)域工作的許多團(tuán)隊(duì)的焦點(diǎn)。在此，我們描述了對(duì)ELISA的改進(jìn)，使其對(duì)ROK活性具有特異性。ROK-ELISA檢測(cè)被ROK磷酸化的肽量。ROK抑制劑抑制ROK活性并且因此減少ROK介導(dǎo)的肽磷酸化的量。在中度通量的96孔板以及在高通量的384孔板發(fā)展了ROK-ELISA技術(shù)。
方案母液生物素化的S6肽在25mM PH 8.0的Tris緩沖液中以1ml的等分試樣保存于-20℃(5mg/ml)。
重組的有活性的ROK以10μl的等分試樣保存于-20℃(1mg/ml)。

1)在鏈霉素抗生物素蛋白包被的孔中向每孔加入0.5ng生物素化的S6肽，于室溫包被2小時(shí)或過夜2)每孔加入100μlPBS洗去過量的S6肽，洗3次3)在含有MgCl2的反應(yīng)緩沖液中將10×ATP溶液配制為期望濃度，冰上操作4)在反應(yīng)緩沖液中稀釋ROK至終濃度每孔10ng，冰上操作5)將10×底物溶液配制為期望的濃度ROK-ELISA 96孔板總體積＝100μl1)用80μl的ROK使抑制劑(10μl的10×濃縮液)以期望的終濃度預(yù)孵育10分鐘2)加入10μl的10×ATP溶液至期望的終濃度3)在30℃孵育該板一小時(shí)4)用100μl的500mM EDTA溶液終止激酶反應(yīng)5)移去所有孔的上清液6)每孔加入100μl的單克隆磷酸化特異性第一抗體(1∶1000)，室溫孵育15分鐘7)每孔加入100μl的第二抗體(1∶2000)，室溫孵育1小時(shí)8)移去上清液，每孔加入200μl PBS，洗5次9)向所有的孔加入100μl的底物溶液，并且在室溫孵育10分鐘10)向所有的孔每孔加入100μl終止溶液11)于492nm測(cè)量OD值ROK-ELISA 384孔板總體積＝10μl1)用8μl的ROK使抑制劑(1μl的10×濃縮液)以期望的終濃度預(yù)孵育10分鐘2)加入1μl的10×ATP濃縮液至期望終濃度3)將該板于30℃孵育1小時(shí)4)用10μl的500mM EDTA溶液終止激酶反應(yīng)5)移去所有孔的上清液6)每孔加人10μl的單克隆磷酸化特異性第一抗體(1∶1000)，并于室溫孵育15分鐘7)每孔加入100μl的第二抗體(1∶2000)，室溫孵育1小時(shí)8)移去上清液，每孔加入30μl PBS，洗滌5次
9)向所有的孔每孔加入10μl底物溶液，室溫孵育10分鐘10)向所有的孔每孔加入10μl終止溶液11)于492nm測(cè)量OD值。
材料ROK(ROKα/ROCK-II(活性重組體11-550個(gè)氨基酸或更長(zhǎng))、生物素化的S6肽(生物素-GGGGARRRLSSLRASTS)、鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板或384孔板(如，Roche StreptaWell，High Bind(transparent)1989685/198967，Roche Diagnostics，Mannheim)、來自Transduction Labs的磷酸化特異性的單克隆抗體(克隆22a，BD Biosciences，Heidelberg)、羊-抗-小鼠IgG-HRP200μg/0.5ml(Santa Cruz Cat#sc-2005)


圖1描述了根據(jù)SEQ ID NO.1的氨基酸序列圖2代表ROK ELISA的典型布局H行1-6孔作為激酶反應(yīng)的對(duì)照孔。H行1-3孔沒有激酶而含有ATP，并且呈現(xiàn)最低信號(hào)。H行4-6孔含有激酶及ATP，并且呈現(xiàn)最大信號(hào)。H行7-12孔作為參照化合物的濃度關(guān)系。使用所有其它的孔以獲得目的化合物的濃度關(guān)系。請(qǐng)注意在E行1-7孔為灰色，其表明高度有效的抑制劑在所使用的全部濃度范圍內(nèi)抑制ROK介導(dǎo)的底物磷酸化。對(duì)于用單個(gè)點(diǎn)確定的IC50評(píng)估，可以在96孔板同時(shí)檢測(cè)14種化合物和一個(gè)參照化合物。
圖3和圖4A和B表示來自ROK ELISA的結(jié)果(抑制百分率和IC50計(jì)算)。
序列表<110>塞諾菲-安萬特德國(guó)有限公司<120>用于鑒定RHO激酶(ROK)調(diào)節(jié)物的高通量酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(HT-ELISA)<130>DEAV2004/0080<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>18<212>PRT<213>人工<220>
<223>人工序列<400>1Gly Gly Gly Gly Ala Lys Arg Arg Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ala Ser1 5 10 15Thr Ser
權(quán)利要求
1.用于鑒定調(diào)節(jié)Rho激酶(ROK)蛋白活性的化合物的檢測(cè)方法，其中a]提供能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；b]提供ROK蛋白；c]提供抗體，此抗體能夠識(shí)別來自a]的被磷酸化的肽；d]提供化合物；e]在可以使所述肽磷酸化的條件下，孵育來自a]的肽與來自b]的ROK蛋白以及來自d]的化合物；f]當(dāng)根據(jù)e]進(jìn)行的孵育完成之后，使用來自c]的抗體檢測(cè)所述肽的磷酸化；g]可以將來自f]的結(jié)果與另一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，在所述另一實(shí)驗(yàn)中孵育來自a]的肽和來自b]的ROK蛋白而不含有d]的化合物。
2.如權(quán)利要求1所要求的檢測(cè)方法，其中按照ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行步驟e]、f]和g]的孵育。
3.如權(quán)利要求1所要求的檢測(cè)方法，其中按照RIA檢測(cè)方法進(jìn)行步驟e]、f]和g]的孵育。
4.如權(quán)利要求1至3中所要求的檢測(cè)方法，其中步驟a]的肽為15至25個(gè)氨基酸大小。
5.如權(quán)利要求1至4中所要求的檢測(cè)方法，其中步驟a]的肽具有以下氨基酸序列GGGGAKRRRLSSLRASTS。
6.如權(quán)利要求5所要求的檢測(cè)方法，其中所述肽是生物素化的。
7.如權(quán)利要求1至6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的檢測(cè)方法，其中所述ROK蛋白來自人。
8.如權(quán)利要求1至7中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的檢測(cè)方法，其中通過重組制備所述ROK蛋白。
9.權(quán)利要求1至8中的一項(xiàng)或多項(xiàng)檢測(cè)方法的用途，其用于高通量篩選調(diào)節(jié)ROK蛋白活性的化合物。
10.成套藥盒，其包括a]能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；b]ROK蛋白；c]能夠識(shí)別來自a]的被磷酸化的肽的抗體；d]可能的第二抗體，其能夠識(shí)別來自c]的抗體和/或連接于標(biāo)記系統(tǒng)；e]可能的試劑、緩沖液和/或用于實(shí)現(xiàn)來自a]的肽磷酸化的設(shè)備和/或ELISA裝置。
11.如權(quán)利要求10所要求的成套藥盒，其中來自a]的肽為15至25個(gè)氨基酸大小。
12.如權(quán)利要求10或11所要求的成套藥盒，其中來自a]的肽具有如下氨基酸序列GGGGAKRRRLSSLRASTS。
13.如權(quán)利要求12所要求的成套藥盒，其中所述肽是生物素化的。
14.如權(quán)利要求10至13中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的藥盒，其中所述ROK蛋白來源于人。
15.如權(quán)利要求10至14中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的藥盒，其中通過重組制備所述ROK蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15的成套藥盒的制備方法，其中a]提供能夠被ROK蛋白磷酸化的肽；b]提供ROK蛋白；c]提供抗體，此抗體能夠識(shí)別來自a]的被磷酸化的肽；d]提供可能的第二抗體，其能夠識(shí)別來自c]的抗體和/或連接于標(biāo)記系統(tǒng)；e]提供可能的試劑、緩沖液和/或用于實(shí)現(xiàn)來自a]的肽磷酸化的設(shè)備和/或ELISA裝置；f]將來自a]至e]的組分相應(yīng)地包裝并與說明書組合，所述說明書中提及成套藥盒的組分以及ROK蛋白檢測(cè)方法的操作步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16的成套藥盒的用途，其用于確定ROK蛋白的活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求10至16的成套藥盒的用途，其用于鑒定調(diào)節(jié)ROK蛋白活性的化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求10至16的成套藥盒的用途，其用于高通量篩選。
20.由以下氨基酸序列組成的肽GGGGAKRRRLSSLRASTS。
21.權(quán)利要求21的肽，其是生物素化的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20和21的肽的用途，其用于測(cè)量ROK蛋白的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過生物素化的肽測(cè)量ROK(Rho激酶)蛋白活性的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C07K7/08GK101076602SQ200580042758
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者M·勒恩, Y·伊瓦先科, E·凱斯勒 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬特德國(guó)有限公司