專利名稱：調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白的制作方法
本申請為中國專利申請No.99810135.4的分案申請發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明部分涉及調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白(MLK)家族成員的方法，鑒定能夠調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和有助于細(xì)胞存活或者促進(jìn)細(xì)胞死亡的化合物的方法，鑒定能夠用于治療神經(jīng)變性疾病和/或炎癥的化合物的方法，以及應(yīng)用能夠抑制多譜系激酶蛋白的化合物治療神經(jīng)變性疾病的方法。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
MLK家族包括一組蛋白，其中家族成員激酶區(qū)的蛋白質(zhì)序列與MAPKKKs極為相似，但是和其它的MAPKKKs相互之間更為相似。MLK的家族成員包含有很復(fù)雜激酶串部分，例如產(chǎn)生緊張信號的激酶串，該激酶串特別涉及c-Jun N-終止的激酶(JNK)的調(diào)變，所述的調(diào)變可依次調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，這包括c-Jun、ATF2和ELK-1。JNK在USP5,534,426、5,593,884、5,605,808和WO 95/03324中已有描述，本發(fā)明引用上述各篇專利全文作為參考。
MLK家族有部分包括下述各組1)多譜系激酶1(MLK1)；2)多譜系激酶2(MLK2)；3)多譜系激酶3(MLK3)；4)亮氨酸拉鏈攜帶激酶(LZK)；5)雙亮氨酸拉鏈攜帶激酶(DLK)；和6)多譜系激酶6(MLK6)。MLK1具有和對Tyr和Ser/Thr有特異性的兩種激酶類似的催化區(qū)。Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也具有和對Tyr或Ser/Thr有特異性的兩種激酶類似的催化區(qū)。Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。已知MLK2也如同是MST。Katoh等人，Oncogene，1995，10，1447-1451。MLK3含有的蛋白質(zhì)附加于激酶區(qū)，其中含有兩個亮氨酸拉鏈，帶有相鄰的羧基終止的基本區(qū)域，并富含有脯氨酸區(qū)。Ing等人，Oncogene，1994，9，1745-1750。已知MLK3也是SPRK(Gallo等人，J.BioL Chem.，1994，269，15092-15100)，和PTKI(Eeoe等人，Oncogene，1994，9，935-938)。LZK是亮氨酸拉鏈支撐的激酶。Sakuma等人，J.Biol.Chem.，1997，272，28622-28629。DLK具有激酶區(qū)和兩種推定的亮氨酸拉鏈基序。Holzman、等人，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817。已知DLK也是ZPK(Reddy、等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1994，202，613-620)和MUK(Hirai等人，Oncogene，1996，12，641-650)。MLK家族的成員在例如下述專利和文獻(xiàn)中已有描述U.S.P5,676,945；5,554,523；WO 93/15201；CA 2,148,898；Diener，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，9687-9692；DeAizpurua等人，J.Biol.Chem.，1997，272，16364-16373；Tung等人，Oncogene，1997，14，653-659；Sells等人，Trends in Cell Biol.，1997，7，161-167；Mata，等人，J.BioLChem.，1996，271，16888-16896；Hirai等人，J.BioL Chem.，1997，272，15167-15173；Fan等人，].Biol Chem.，1996，271，24788-24793；Blouin等人，DNA and Cell Biol.，1996，15，631-642；Pombo等人，Nature，1995，377，750-754；Kiefer等人，EMBO 1，1996，15，7013-7025；Hu等人，Genes & Dev.，1996，10，2251-2264；Su等人，EMBO J.，1997，16，1279-1290；和Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500。最近，在EST數(shù)據(jù)庫中還鑒定出其它MLK相關(guān)的激酶。此克隆體MLK6的序列用七個重疊的通道(entries)表述。這些克隆體的ID數(shù)目是1007489，1460085，510915，666323，F(xiàn)5555，482188和178522，本發(fā)明引用本段各篇文獻(xiàn)全文作為參考。
最近，如群體形成試驗(yàn)所測定的，已指出ZPK的穩(wěn)定表達(dá)可減少NIH3T3成纖維細(xì)胞的增生能力。Bergeron等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，153-155。但是，Bergeron等人沒有提供任何數(shù)據(jù)來說明ZPK可調(diào)節(jié)ZPK基質(zhì)的活性，或者說明ZPK是否能夠促進(jìn)細(xì)胞的死亡。
已有人指出在Swiss 3T3細(xì)胞中構(gòu)成編碼Myc-MLK2的表達(dá)在注射后大約20小時是能夠?qū)е戮幊绦约?xì)胞死亡，Nagata等人，EMBOI，1998，17，149-158。
申請人研究了某些吲哚并和茚并化合物，它們可抑制與過度增生狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞生長，以及在各種胚胎培養(yǎng)物，如脊神經(jīng)節(jié)、紋狀體、高級頸神經(jīng)中樞和運(yùn)動神經(jīng)元中抑制細(xì)胞死亡。USP 5,475,110、5,591,855、5,594,009、5,461,146、5,621,100、5,621,101、5,705,511和5,756,494，它們已經(jīng)轉(zhuǎn)讓給本申請人的受讓人，本申請引用上述全文作為參考。U.S.P 5,705,511中所述的化合物具有式G結(jié)構(gòu)，本申請引用作為參考，為式I。申請人還指出K-252a衍生物可抑制運(yùn)動神經(jīng)元編程性細(xì)胞死亡，所述化合物是吲哚并咔唑，它還可以調(diào)節(jié)緊張信號級聯(lián)擴(kuò)增。Maroney等人，J.Neurosci.，1998，18，104-111，本申請引用上述全文作為參考。
由于篩選的調(diào)節(jié)緊張信號級聯(lián)擴(kuò)增以及促進(jìn)細(xì)胞死亡和存活的化合物功能不全，因此仍然需要得到新的，篩選化合物的選擇性方法。此外，也需要有用于治療炎癥和神經(jīng)變性疾病的治療篩選試驗(yàn)方法。本發(fā)明就涉及了上述目的，以及其它一些重要的目的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和促進(jìn)細(xì)胞存活的化合物的鑒定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細(xì)胞與所述化合物接觸，測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的下降，和測定化合物是不是有助于細(xì)胞的存活的步驟。
本發(fā)明還提供了能夠調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白和促進(jìn)細(xì)胞死亡的化合物的鑒定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細(xì)胞與所述化合物接觸，測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的提高，和測定化合物是不是促進(jìn)了細(xì)胞的死亡的步驟。
本發(fā)明還提供了用于治療神經(jīng)變性疾病的化合物的鑒定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞萃取物與所述化合物接觸，并測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的下降。
本發(fā)明還提供了用于治療炎癥的化合物的鑒定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞萃取物與所述化合物接觸，并測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的下降。
本發(fā)明還提供了哺乳動物已有或疑有神經(jīng)變性疾病的治療方法，該方法包括給所述的哺乳動物施用能夠抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。
本發(fā)明還提供了哺乳動物已有或疑有炎癥的治療方法，該方法包括給所述的哺乳動物施用能夠抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，該方法包括使所述的蛋白或含有該蛋白的細(xì)胞與下述式II化合物接觸 式中環(huán)B和環(huán)F都與它們所連接的碳原子成環(huán)，并分別各自選自下述基團(tuán)，不飽和的6元芳香碳環(huán)，環(huán)上的1-3個碳原子可被氮原子置換；不飽和的5元芳香碳環(huán)；和不飽和的5元芳香碳環(huán)，在環(huán)上或1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；2個碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或兩個氮原子置換；或3個碳原子被3個氮原子置換；R1選自下述基團(tuán)H，取代或未取代的1-4個碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的雜芳基，或取代或未取代的雜芳烷基；-C(＝O)R9，其中R9選自烷基、芳基或雜芳基；-OR10，其中 R10選自H和1-4個碳原子的烷基；-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-O(CH2)POR10和-O(CH)PNR11R12，其中p為1-4；和其中或R11和R12分別各自選自H和1-4個碳原子的烷基；或R11和R12一起構(gòu)成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1選自-O-，-S-和-CH2-；R2選自下述基團(tuán)H，1-4個碳原子的烷基，-OH，1-4個碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10個碳原子的芳烷基，取代或未取代的雜芳烷基；R3，R4，R5和R6各自分別選自下述基團(tuán)H，芳基，雜芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；-CH2OR14，其中R14是在羧基的羥基脫除后的氨基酸殘基；
-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14其中y是0，1或2；1-8個碳原子的烷基，2-8個碳原子的烯基，2-8個碳原子的炔基，其中每個烷基、烯基、炔基是未取代的，或每個烷基、烯基、炔基是由下述1-3個基團(tuán)取代的6-10個碳原子的芳基、雜芳基、芳基烷氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基-烷硫基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氫吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)，-OR14，和5-7個碳原子的單糖，其中單糖的每個羥基各自分別或未取代或由H、1-4個碳原子的烷基、2-5個碳原子的烷基酰氧基或1-4個碳原子的烷氧基；X2是O，S或NR10；R7和R8是各自分別選自H、1-4個碳原子的烷基、1-4個碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10個碳原子的芳烷基或取代或未取代的雜芳烷基、-(CH2)POR10、-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12；或R7和R8一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)式-CH2-X3-CH2-的連結(jié)基團(tuán)，其中X3是X2或單鍵；m和n各自分別是0，1，或2；Y選自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；Z選自單鍵、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；R15和R16各自分別選自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10；R17選自H，烷基，芳基，和雜芳基；A1和A2選自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1與A2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；B1和B2選自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1與B2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；同時以A1與A2或B1與B2中的至少一對形成＝O為條件。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，包括使該蛋白或包含該蛋白的細(xì)胞同式III化合物接觸 式中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同構(gòu)成＝O；R1選自下述基團(tuán)H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
R2選自下述基團(tuán)H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X選自下述基團(tuán)H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述結(jié)構(gòu)式之一 和
R選自O(shè)H和OCH3。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，包括使該蛋白或包含該蛋白的細(xì)胞同式IV化合物接觸 其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構(gòu)體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
附圖的簡要說明為了說明本發(fā)明的實(shí)施方案，在附圖中說明了某些技術(shù)特征。可以理解的是，本發(fā)明并不限于副圖所示確定的實(shí)施方案。


圖1是橋連的茚并吡咯并咔唑的一般制備方法示意圖。
圖2是橋連的茚并吡咯并咔唑的一般制備方法示意圖。
圖3是樹脂鍵連的茚并吡咯并咔唑的一般制備方法示意圖。
圖4是被保護(hù)的、可溶解的茚并吡咯并咔唑的一般制備方法示意圖。
圖5是中間體V的一般制備方法示意圖。
圖6是用方法A制備橋連的茚并吡咯并咔唑的示意圖。
圖7是用方法B制備橋連的茚并吡咯并咔唑的示意圖。
圖8是B-環(huán)取代的橋連茚并吡咯并咔唑的制備方法示意圖。
圖9是橋連茚并吡咯并咔唑的E環(huán)衍生方法示意圖。
圖10描述了在沒有NGF的情況下培養(yǎng)5天后，可生存的神經(jīng)分化PC-12細(xì)胞的數(shù)量的兩組不同試驗(yàn)的圖解。結(jié)果以每組的NGF控制百分?jǐn)?shù)表示(沒有NGF的情況下的載體對照組，n＝12；所有其它組，n＝3)。通過雙側(cè)T-檢驗(yàn)，載體對照組和在沒有NGF時主要表達(dá)為陰性的MLK-3突變體的穩(wěn)定的細(xì)胞庫之間的差別是令人滿意的。
圖11A說明了用放射性膠基試驗(yàn)，死亡激酶GST-SEK-1通過桿狀病毒群表達(dá)的FLAG-MLK-3(全長和激酶區(qū)的混合物)磷酸化。
圖11B說明了桿狀病毒群表達(dá)的FLAG-MLK-3(全長和激酶區(qū)的混合物)或GST-MLK-3激酶區(qū)催化的激酶反應(yīng)結(jié)果所形成的32P標(biāo)記的磷酸化髓磷脂堿性蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
圖12的免疫印跡分析指出通過桿狀病毒群表達(dá)的FLAG-MLK-3(全長和激酶區(qū)的混合物)磷酸化的死亡激酶GST-SEK-1以磷酸-特異性SEK-1抗體的形式檢出。
圖13說明了通過細(xì)菌表達(dá)的GST-MLK-3激酶區(qū)的髓磷脂堿性蛋白質(zhì)的磷酸化作用，試驗(yàn)采用了(o)多篩選三氯乙酸沉淀試驗(yàn)，或(·)磷酸纖維素膜方法。
圖14給出了用MLK-3桿狀病毒群感染的昆蟲細(xì)胞的裂解物孵化的[3H]K252的飽和結(jié)合曲線。
圖15A說明了用細(xì)胞過量表達(dá)的MLK-3，MLK-2或DLK，和經(jīng)過0.025％DMSO(對照組)或500nM K-252a處理，在免疫沉淀物/激酶反應(yīng)中32P標(biāo)記的c-jun的數(shù)量。
圖15B以圖示說明了用圖15A所述樣品，在免疫沉淀物/激酶反應(yīng)中保留的定量的活性百分?jǐn)?shù)。各柱高表示多個樣品的平均值，誤差線條說明了平均范圍。
圖15C說明了用細(xì)胞過量表達(dá)HA-JNK1單獨(dú)使用，或如圖所示在各種cDNA量的情況下與MEKK1一起，經(jīng)過0.025％DMSO(對照組)或500nM化合物III-3(見表3)處理，在免疫沉淀物/激酶反應(yīng)中32p標(biāo)記的c-jun的數(shù)量。各柱高表示多個樣品的平均值，其中的誤差線條說明了平均范圍。
圖16說明了化合物III-3促進(jìn)神經(jīng)元存活與濃度的關(guān)系。將取自交感神經(jīng)節(jié)(SG)(A)、背根神經(jīng)節(jié)(DRG)(B)、睫狀神經(jīng)節(jié)(CG)(C)和運(yùn)動神經(jīng)元(MN)(D)的分離的神經(jīng)元在有或沒有所指明的營養(yǎng)因子的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。如材料和方法部分所述，在平皿接種48小時后對細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)以三次或四次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±SD表示。
圖17給出了在有或沒有各自的神經(jīng)營養(yǎng)因子(對交感神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元而言為20ng/ml NGF，對睫狀神經(jīng)元而言為10ng/ml CNTF，對運(yùn)動神經(jīng)元(A-D)而言為30μg/ml肌萃取物(MEX))，或在1μM化合物III-3(E-H)存在下培養(yǎng)48小時后，E12 DRG(A，E)、交感神經(jīng)E9(B，F(xiàn))、睫狀E8(C，G)和E5.5運(yùn)動神經(jīng)元(D，H)培養(yǎng)物的相差顯微照片。Bar＝2Ooμm。
圖18給出了體外背根神經(jīng)節(jié)外植體的顯微照片。取自小雞DRG(E9)的外植體置入96穴培養(yǎng)板，其中的介質(zhì)含有0.05％BSA。附著期2小時后，再加入下述附加物(A)用于對照的DMSO；(B)20ng/mlNGF；(C)250nM化合物III-3。48小時后，移出介質(zhì)，外植體在磷酸鹽緩沖液中用多聚甲醛固定。
圖19說明了每天用特定劑量的化合物III-3處理(E5-9)后，存活在E10中的小雞腰運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目。所示的數(shù)據(jù)是每個處理組5-6只動物的平均值±SD。所報告的試驗(yàn)重復(fù)兩次。數(shù)據(jù)取自一有代表性的試驗(yàn)，并用腰柱的一側(cè)表示。用Bonferroni校正化合物III-3和對照組之間的斯氏T試驗(yàn)的*p＜0.01，**p＜0.001。
圖20說明了每天用化合物III-3處理(PN1-5)后，或是對照載體組(5％SolutoITM)，生存于PN 10或PN6O中的雌性大鼠脊柱的球海綿體肌(SNB)的神經(jīng)核中的運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目。在PN10(A，B)或PN 60(B)的情況下，處死大鼠，分割出含有SNB的脊髓部位，用組織學(xué)方法加工，然后如文獻(xiàn)所述(Wingfield等人，Steroids，1975，26，311-327)，在脊髓的腰5-骶骨1區(qū)的一系列切片上對Cresylecht紫染色的運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)是每一處理組4-8只動物的平均值±SD。
圖21說明了成年大鼠用化合物III-3在舌下神經(jīng)axotomy處理后ChAT免疫活性的損失。在把舌下神經(jīng)橫斷和用載體溶液(5％SolutoITM)處理之后(A)，和在橫斷處用200μg化合物III-3處理(B)的舌下神經(jīng)核顯微照片。(C)是在上述(A)和(B)處理ChAT-免疫反應(yīng)性舌下運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目。結(jié)果表示為ChAT-免疫反應(yīng)性舌下運(yùn)動神經(jīng)元的百分?jǐn)?shù)，100％定義為對側(cè)、未損害的舌下神經(jīng)核中ChAT-免疫反應(yīng)性運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目。
圖22說明了MLK-3途徑的體內(nèi)抑制作用顯示出來的效力和磷酸化作用后的保護(hù)。圖22A說明了在化合物III-3系統(tǒng)用藥造成MPTP損害后，黑質(zhì)酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)性神經(jīng)元的增加。圖22B是說明MPTP誘導(dǎo)的磷酸化MKK4水平提高的有代表性的免疫印跡。圖22C給出了有代表性的免疫印跡，以及ELISA說明了在有化合物III-3存在時，MPTP誘導(dǎo)的磷酸化MKK4的衰減。
圖23說明了Jurkat細(xì)胞中IL-2的誘導(dǎo)作用。圖23A說明了IL-2誘導(dǎo)與時間的關(guān)系。圖23B說明了化合物III-3對IL-2誘導(dǎo)的抑制作用。圖23C說明了化合物III-3和化合物I-4對IL-2誘導(dǎo)的抑制作用。
發(fā)明的詳細(xì)描述上文及本發(fā)明全文所用的下述術(shù)語應(yīng)理解為具有下述定義，除非另有說明。
“編程性細(xì)胞死亡”是指細(xì)胞死亡的特定形態(tài)學(xué)形式，其特征在于細(xì)胞的碎片和細(xì)胞核在膜結(jié)合的顆粒之內(nèi)。編程性細(xì)胞死亡可由例如能誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的化合物觸發(fā)，這些化合物例如是依托泊甙、癌基因抑活藥、腫瘤壞死因子、cerurnide等，或者是由如X-射線的條件觸發(fā)。
術(shù)語“細(xì)胞死亡”是指細(xì)胞由于編程性細(xì)胞死亡、壞死或其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的手段造成的細(xì)胞死亡。例如，“細(xì)胞死亡”的特征在于總細(xì)胞數(shù)的減少，或與未處理對照組的細(xì)胞種群相比細(xì)胞的生存能力下降。與未處理對照組的種群相比，“促進(jìn)細(xì)胞死亡”的化合物能夠引起細(xì)胞數(shù)的減少，或細(xì)胞生存能力下降。與此相反，“促進(jìn)細(xì)胞存活”的化合物可使細(xì)胞數(shù)增加，或提高細(xì)胞的生存能力，或減緩或減少細(xì)胞死亡的速率。
術(shù)語“選擇性地反應(yīng)”或“特異性結(jié)合”是指化合物以物理的或化學(xué)的方式直接與MLK蛋白發(fā)生作用。與此相反，不能“選擇性地反應(yīng)”或“特異性結(jié)合”的化合物可以與MLK蛋白的上游或下游作用，以及可以影響MLK蛋白的活性，但是不能以物理的或化學(xué)的方式直接與MLK蛋白發(fā)生作用。
術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指特定蛋白或基質(zhì)活性的增加或減少。
本發(fā)明部分地涉及能夠調(diào)節(jié)MLK蛋白活性，和促進(jìn)細(xì)胞存活或細(xì)胞死亡的化合物的鑒定方法。能夠提高M(jìn)LK蛋白活性和可以促進(jìn)細(xì)胞死亡的化合物，另一方面，該化合物也能夠降低MLK蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞存活。
MLK蛋白可以是任何鑒定為屬于MLK蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，MLK蛋白選自上文所述的一組蛋白MLK1、MLK2、MLK3(SPRK，PTK1)、LZK，DLK(ZPK，MUK)和MLK6。在本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案中，對直接作用于或結(jié)合于MLK蛋白的化合物進(jìn)行鑒定的方法可以通過結(jié)合試驗(yàn)、激酶試驗(yàn)或其它等同的試驗(yàn)完成。
為了鑒定能夠調(diào)節(jié)MLK蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞存活或細(xì)胞死亡的化合物，使細(xì)胞或含有MLK蛋白的細(xì)胞與所述化合物接觸。接觸可在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的緩沖溶液或介質(zhì)中進(jìn)行。另外，接觸也可以在體內(nèi)進(jìn)行，在此情況下，使諸如小鼠的動物或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它的適當(dāng)動物通過施用與含有試驗(yàn)化合物的藥物組合物以及藥用鹽、載體或稀釋劑接觸。此外，也可以改變細(xì)胞的數(shù)目和試驗(yàn)化合物的濃度?？梢詼y定出試驗(yàn)化合物使MLK蛋白的活性增加還是減少，以及也可以測定出試驗(yàn)化合物促進(jìn)細(xì)胞的存活還是死亡。
與試驗(yàn)化合物接觸的細(xì)胞可以是任何哺乳動物的細(xì)胞，優(yōu)選神經(jīng)元細(xì)胞。優(yōu)選涉及神經(jīng)變性疾病的細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，“神經(jīng)變性疾病”、“神經(jīng)變性障礙”和“神經(jīng)變性癥狀”是可以互換的，并可用來描述與神經(jīng)元細(xì)胞或涉及神經(jīng)元系統(tǒng)的細(xì)胞有關(guān)的疾病或失調(diào)，這包括，但不限于阿耳茨海默氏病、運(yùn)動神經(jīng)元疾病、肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森氏病、腦血管疾病、局部缺血癥狀、AIDS、癡呆、癲癇、杭廷頓氏舞蹈病以及腦或脊髓的震動或貫通傷。
MLK蛋白活性可由多種技術(shù)測定。例如MLK活性可用蛋白質(zhì)基質(zhì)的活性測定。這些基質(zhì)是已知的，對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是很容易辨別的。優(yōu)選的，所述的基質(zhì)是一種絲分裂素活化的蛋白質(zhì)激酶，激酶家族或絲分裂素活化的蛋白質(zhì)激酶家族或更下游的基質(zhì)包括，但不限于選自下述的一組蛋白JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2、p38α、p38β、P38γ、P38δ、MEK1、MEK2、MKK3、MKK4(SEK1)、MEK5、MKK6、MKK7、jun、ATF2、ELK1和哺乳動物的AEX-3類似物，還包括Ser/Thr蛋白激酶的一般基質(zhì)如髓磷脂堿性蛋白(MBP)。測定這些基質(zhì)活性的試劑和方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。通過測定MLK蛋白或mRNA編碼的MLK蛋白可以確定MIX的存在。測定DNA或蛋白質(zhì)，包括RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡的試劑，以及測定的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，所述的試劑包括抗體和寡核苷酸探針。MLK蛋白的活性也可用體外的激酶試驗(yàn)方法測定。體外激酶試驗(yàn)方法也是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。測量蛋白質(zhì)活性的其它方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，并且包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以確定試驗(yàn)化合物是不是能夠調(diào)節(jié)，即提高或減少M(fèi)LK蛋白的活性。
試驗(yàn)化合物是不是能夠促進(jìn)細(xì)胞的存活或死亡可以用多種方法確定。優(yōu)選的，可使用頻死細(xì)胞測定是否能夠促進(jìn)細(xì)胞的存活或死亡，并且將與試驗(yàn)化合物接觸的細(xì)胞并存活的數(shù)目，和沒有與試驗(yàn)化合物接觸并存活的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行比較。優(yōu)選的，所述的細(xì)胞是在預(yù)程序中死亡的初級的胚胎運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞。初級的胚胎運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞在Maroney等人，J.Neurosci，1998，18，104-111中已有描述，該文獻(xiàn)的全文被引用作為參考。除非由試驗(yàn)化合物營救，所述的初級的胚胎運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞會死。因此，與不用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞種群中活著的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞種群中活著的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞更多，這說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞存活。相反，與不用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞種群中活著的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞種群中活著的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞更少時，說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞死亡。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，如下面的實(shí)施例所述，由于MLK蛋白的過表達(dá)，正常細(xì)胞、野生型細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成有死亡危險的細(xì)胞，然后，使其與試驗(yàn)化合物接觸。除非由試驗(yàn)化合物營救，所述過表達(dá)的MLK蛋白細(xì)胞會死亡。用能夠表達(dá)特定蛋白質(zhì)內(nèi)側(cè)細(xì)胞的載體可以完成MLK的過表達(dá)。表達(dá)用的載體是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。此外，制備表達(dá)載體的方法也是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。表達(dá)任何MLK蛋白的表達(dá)載體可以按照本發(fā)明實(shí)施例所述類似的方法制備。與不用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞數(shù)目更多，說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞存活。相反，與不用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞數(shù)目更少，說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞死亡。
在另一實(shí)施方案中，通過觀察或測定編程性細(xì)胞死亡減少，說明可促進(jìn)細(xì)胞存活。相反，與不用試驗(yàn)化合物處理的過表達(dá)細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞數(shù)目更少，說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞死亡。細(xì)胞質(zhì)的皺縮和細(xì)胞核的濃縮與編程性細(xì)胞死亡有關(guān)。因此，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過觀察或測定細(xì)胞質(zhì)的皺縮和/或細(xì)胞核的濃縮測定編程性細(xì)胞死亡減少。此外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過觀察或測定細(xì)胞質(zhì)的皺縮和/或細(xì)胞核的濃縮測定編程性細(xì)胞死亡減少。此外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員用常規(guī)的染色法可測定編程性細(xì)胞死亡。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可使用正常細(xì)胞、野生型神經(jīng)元細(xì)胞鑒定能促進(jìn)細(xì)胞死亡的化合物。除非由試驗(yàn)化合物營救，所述的正常細(xì)胞會死亡。與不用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞數(shù)目更少，說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞死亡。相反，與不用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞相比，用試驗(yàn)化合物處理的正常細(xì)胞種群中活著的細(xì)胞數(shù)目更多或相等時，不說明試驗(yàn)化合物可以促進(jìn)細(xì)胞死亡。
本發(fā)明還部分的涉及調(diào)節(jié)MIX蛋白活性的方法，該方法包括使所述蛋白或含有所述蛋白的細(xì)胞與式G(本文表示為式I)化合物接觸，該化合物公開在USP 5,705,511，該專利由本申請的受讓人申請，這里引用其全文作為參考。
本發(fā)明還部分地涉及調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，包括用下述式III化合物接觸該蛋白或包含該蛋白的細(xì)胞
式中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同構(gòu)成＝O；R1選自下述基團(tuán)H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
R2選自下述基團(tuán)H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X選自下述基團(tuán)H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述結(jié)構(gòu)式之一 和R選自O(shè)H和OCH3。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1是NHCONHC2H5，R2是CH2CH2(2-吡啶基)，和R是OH。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2OCH2OCH2CH3，和R是OH；或Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2SCH2CH3和R是OH；或Z1，Z2，R1和R2是H，X是CO2CH3；和R is OH；或Z1，Z2，R1，和R2是H，X是CO2(CH2)4CH3，和R is OH；或Z1，Z2和R1是H，R2是CH2OH，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1和Z2是H，R1和R2是H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1和Z2是H，R1是Br，R2是I，X是CO2CH3；和R是OH；或Z1和Z2是H，R1和R2是CH2CHSCH3，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1，Z2，R1，和R2是H，X是CO2CH3；和R是OCH3；或Z1和Z2一起構(gòu)成＝O，R1和R2是Br，X是CO2CH3，和R是OH。
本發(fā)明還部分地涉及調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，包括用下述式II化合物接觸該蛋白或包含該蛋白的細(xì)胞 式中環(huán)B和環(huán)F都與它們所連接的碳原子成環(huán)，并分別各自選自下述基團(tuán)，a)不飽和的6元芳香碳環(huán)，環(huán)上的1-3個碳原子可被氮原子置換；b)不飽和的5元芳香碳環(huán)；和c)不飽和的5元芳香碳環(huán)，在環(huán)上或1)1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；2)2個碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或兩個氮原子置換；或3)3個碳原子被硫3個氮原子置換；R1選自下述基團(tuán)a)H，取代或未取代的1-4個碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的雜芳基，或取代或未取代的雜芳烷基；b)-C(＝O)R9，其中R9選自烷基、芳基或雜芳基；c)-OR10，其中R10選自H和1-4個碳原子的烷基；
d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-(CH2)POR10和-O(CH)pNR11R12，其中p為1-4；和其中或1)R11和R12分別各自選自H和1-4個碳原子的烷基；或2)R11和R12一起構(gòu)成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1選自-O-，-S-和-CH2-；R2選自下述基團(tuán)H，1-4個碳原子的烷基，OH，1-4個碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10個碳原子的芳烷基，取代或未取代的雜芳烷基；R3，R4，R5和R6各自分別選自下述基團(tuán)a)H，芳基，雜芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pN R11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；b)-CH2OR14，其中R14是在羧基的羥基脫除后的氨基酸殘基；c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14其中y是0，1或2；e)1-8個碳原子的烷基，2-8個碳原子的烯基，2-8個碳原子的炔基，其中1)每個烷基、烯基、炔基是未取代的，或2)每個烷基、烯基、炔基是由下述1-3個基團(tuán)取代的6-10個碳原子的芳基、雜芳基、芳基烷氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基-烷硫基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氫吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)，-OR14，和5-7個碳原子的單糖，其中單糖的每個羥基各自分別或未取代或由H、1-4個碳原子的烷基、2-5個碳原子的烷基酰氧基或1-4個碳原子的烷氧基；X2是O，S或NR10；R7和R8是各自分別選自H、1-4個碳原子的烷基、1-4個碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10個碳原子的芳烷基或取代或未取代的雜芳烷基、-(CH2)P-OR10，-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12；或R7和R8一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)式-CH2-X3-CH2-的連結(jié)基團(tuán)，其中X3是X2或單鍵；m和n各自分別是0，1，或2；Y選自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；Z選自單鍵、-O-，-CH＝C H-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；R15和R16各自分別選自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10；R17選自H，烷基，芳基，和雜芳基；A1和A2選自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1與A2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；B1和B2選自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1與B2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；條件是A1與A2或B1與B2之中至少一對形成＝O。
本發(fā)明還部分地涉及調(diào)節(jié)MLK蛋白活性的方法，包括用下述式IV化合物接觸該蛋白或包含該蛋白的細(xì)胞
其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構(gòu)體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是CH2CH＝CH2。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，R1是Br和R2，R4，Z1和Z2是H；或R1，R2，Z1和Z2是H和R3和R4是CH2CH＝CH2；或R1，R2，R3，Z1和Z2是H和R4是CH2CH＝CH2；或R1，R2，Z1和Z2是H，和R3和R4CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是 本發(fā)明還提供鑒定可用于治療神經(jīng)變性疾病的化合物的方法，包括使包含有多譜系激酶的細(xì)胞或細(xì)胞抽提物同該化合物接觸，并測定該化合物是否減少多譜系激酶蛋白的活性。細(xì)胞和細(xì)胞抽提物包括前面提到的那些。由本方法找到的化合物(即抑制或減少多譜系激酶蛋白的活性的那些化合物)可以用來治療神經(jīng)變性疾病。這種蛋白優(yōu)選多譜系激酶1、多譜系激酶2、多譜系激酶3、亮氨酸拉鏈攜帶激酶、雙元亮氨酸拉鏈攜帶激酶、多譜系激酶6。該細(xì)胞在體外或在體內(nèi)接觸。該蛋白的活性優(yōu)選通過測試所說蛋白基質(zhì)的活性或磷酸化態(tài)來測定。所說的基質(zhì)優(yōu)選JNK1，JNK2，JNK3，ERKI，ERK2，p38α，p38β p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEKI)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELKI，和AEX-3的哺乳動物同系物以及一般的Ser/Thr基質(zhì)，如髓磷脂堿性蛋白(MBP)。蛋白的活性還可以通過測定蛋白基質(zhì)的活性、蛋白基質(zhì)的數(shù)量或mRNA編碼的蛋白基質(zhì)來測定。蛋白活性也可通過體外激酶試驗(yàn)或鍵合試驗(yàn)來測定。細(xì)胞優(yōu)選初級胚運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞、充分表達(dá)多譜系激酶蛋白的細(xì)胞，或神經(jīng)元細(xì)胞，但可以是任何細(xì)胞或其抽提物。如上所述，直接鍵合多譜系激酶蛋白的化合物優(yōu)選被鑒定。
本發(fā)明還提供鑒定可用于治療炎癥的化合物的方法，包括使包含有多譜系激酶的細(xì)胞或細(xì)胞抽提物同該化合物接觸，并測定該化合物是否減少多譜系激酶蛋白的活性。細(xì)胞和細(xì)胞抽提物包括前面提到的那些。由本方法找到的化合物(即抑制或減少多譜系激酶蛋白的活性的那些化合物)可以用來治療炎癥。這種蛋白優(yōu)選多譜系激酶1、多譜系激酶2、多譜系激酶3、亮氨酸拉鏈攜帶激酶、雙元亮氨酸拉鏈攜帶激酶、多譜系激酶6。該細(xì)胞在體外或在體內(nèi)接觸。該蛋白的活性優(yōu)選通過測試所說蛋白基質(zhì)的活性或磷酸化態(tài)來測定。所說的基質(zhì)優(yōu)選JNK1，JNK2，JNK3，ERKI，ERK2，p38α，p38β p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEKI)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELKI，和AEX-3的哺乳動物同系物以及一般的Ser/Thr基質(zhì)，如髓磷脂堿性蛋白(MBP)。蛋白的活性還可以通過測定蛋白基質(zhì)的活性、蛋白基質(zhì)的數(shù)量或mRNA編碼的蛋白基質(zhì)來測定。蛋白活性也可通過體外激酶試驗(yàn)或鍵合試驗(yàn)來測定。
細(xì)胞優(yōu)選初級胚運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞、充分表達(dá)多譜系激酶蛋白的細(xì)胞，或神經(jīng)元細(xì)胞，但可以是任何細(xì)胞或其抽提物。這種細(xì)胞還包括但不限于涉及炎癥的那些細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員公認(rèn)的白細(xì)胞。直接鍵合多譜系激酶蛋白的化合物優(yōu)選被鑒定。
本發(fā)明還提供治療患有或被懷疑患有神經(jīng)變性疾病的哺乳動物的方法，包括給該哺乳動物服用抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物包括但不限于具有式I，II，III和IV的化合物。優(yōu)選的化合物包括上述有關(guān)篩選調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性，或促進(jìn)細(xì)胞存活或死亡的化合物的方法所描述化合物。優(yōu)選的哺乳動物是人。如果一個人具有特定的神經(jīng)變性疾病的癥狀，或是處高危險的群體，或有神經(jīng)變性疾病家族史，他就被懷疑患有神經(jīng)變性疾病。
本發(fā)明還提供治療患有炎癥疾病的哺乳動物的方法，包括給該所說的哺乳動物服用抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物包括但不限于具有式I，II，III和IV的化合物。優(yōu)選的化合物包括上述有關(guān)篩選調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性，或促進(jìn)細(xì)胞存活或死亡的化合物的方法所描述化合物。優(yōu)選的哺乳動物是人。
與式I-IV化合物的接觸可在緩沖液或介質(zhì)中進(jìn)行，這是本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員所熟知的。另外，這種接觸可通過給適宜的動物或哺乳動物，如小鼠或本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員熟悉的其他適宜動物，服用包含有試驗(yàn)化合物的藥用組合物和藥用鹽、載體或稀釋劑來進(jìn)行。此外，各種各樣的細(xì)胞和化合物濃度都可使用。優(yōu)選的細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞涉及神經(jīng)變性疾病，如阿爾茨姆默氏病；運(yùn)動原神經(jīng)元疾病；肌肉萎縮硬化；帕金森病；腦血管疾??；局部缺血；AIDS；癡呆；癲癇；杭廷頓氏病和腦或脊髓的振蕩性或穿透性損傷。式I化合物及其制備方法描述在美國專利5,705,511中，引用于此以供參考。式III化合物及其制備方法描述在美國專利5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，以及WO 97/46567，全部引用于此以供參考。式IV化合物及其制備方法描述在美國專利5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，以及WO97/46567，全部引用于此以供參考。
式II化合物包括環(huán)繞連接取代基R2，R7，和R8的碳原子的非對映異構(gòu)體和對映異構(gòu)體。
優(yōu)選的橋式茚并吡咯并咔唑由式II表示 在式II化合物某些優(yōu)選的實(shí)例中，R1is H。在更優(yōu)選的實(shí)例中，R2是H，羥基或取代或未取代烷基。
在其他優(yōu)選的實(shí)例中，R3，R4，R5和R6各自分別是H，取代或未取代烷基、鹵素、取代或未取代烷氧基、或取代或未取代氨基、或取代或未取代芳基。在更優(yōu)選的實(shí)例中，R7和R8各自分別選自是H，取代或未取代烷基。
在某些優(yōu)選的實(shí)例中，Y是O。在更優(yōu)選的實(shí)例中，Z是單鍵、O、S或取代或未取代的N。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)例中，m和n各自分別是1或2。在某些特別優(yōu)選的實(shí)例中，Y是O，Z是單鍵或O，m和n各自分別是1或2。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)例中，A1A2和B1B2是＝O或H，H。
在某些特別優(yōu)選的實(shí)例中，R1，R4，R6和R7都是H，Y是＝O，n為1，A1A2和B1B2是＝O或H，H，R2是H，OH或低級烷基，R3是H，取代或未取代烷基，R5和R8都是H或烷氧基，優(yōu)選甲氧基，Z是單鍵或O，m和n是1或2。
式II化合物特別優(yōu)選的實(shí)例是在下面表1列出的化合物II-1，II-2，II-3，II-4a，II-4b，II-5，II-6，II-7a，II-7b，II-8，II-9，II-10，II-11和II-12。
由式II化合物表示的化合物此后表示為化合物(II)。
這里所用的術(shù)語“碳環(huán)”指環(huán)的部分僅由碳原子組成的環(huán)基。術(shù)語“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”指環(huán)的部分至少包含一個雜原子如O，N或S的環(huán)基。
這里所用的術(shù)語“烷基”指1-8個碳原子的直鏈的、環(huán)狀的或支鏈的烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、辛基、環(huán)丙基和環(huán)戊基。包含烷基基團(tuán)的烷基部分如烷氧基、烷氧羰基和烷氨基羰基的烷基部分與上述定義的烷基意思相同。低碳烷級優(yōu)選上述定義的具有1-4個碳原子烷基。術(shù)語“烷烯基”指至少有一個碳-碳雙鍵的直鏈的或支鏈的烴鏈。烯基的實(shí)例包括乙烯基或丙烯基。這里所用的術(shù)語“炔基”指至少有一個碳-碳三鍵的直鏈的或支鏈的烴鏈。炔基的實(shí)例包括乙炔基或丙炔基。
包含?；鶊F(tuán)如酰氧基的?；糠种?-6個碳原子的直鏈的或支鏈的烷酰基，如甲酰基、乙?；?、丙酰基、丁酰基、戊酰基、新戊?；蚣乎；?。
這里所用的術(shù)語“芳基”指具有6-12個碳原子的芳基，如苯基、二苯基和萘基。優(yōu)選的芳基包括未取代或取代的苯基和萘基。這里使用的術(shù)語“雜芳基”指一個或多個環(huán)碳原子被雜原子(即非碳原子)如N，O或S取代的芳基。優(yōu)選的雜芳基包括吡啶基、嘧啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、三唑基、四唑基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、噻唑基、吡唑基和苯并噻唑基。
術(shù)語“芳烷基”(或“芳基烷基”)用來表示由帶有芳基的烷基構(gòu)成的具有7-15個碳原子基團(tuán)。芳烷基的實(shí)例包括芐基、苯乙基、二苯甲基和萘基甲基。
烷基和取代基包含的烷基部分，如芳烷基、烷氧基、芳烷氧基、羥基烷氧基、烷氧-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基烷硫基、烷基酰氧基、羥基烷基和酰氧基，可以是取代或未取代的。取代的烷基具有1-3個各自獨(dú)立的選擇性取代基，優(yōu)選羥基、低級烷氧基、低級烷氧基烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基低級烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基低級雜芳基烷氧基-低級烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基、取代或未取代的雜環(huán)烷氧基、氫、羧基、低級烷氧羰基、硝基、氨基、單或雙低級烷氨基、二氧戊環(huán)、二氧六環(huán)、二硫戊環(huán)、二硫六環(huán)、呋喃、內(nèi)酯或內(nèi)酰胺。
取代芳基、取代雜芳基、取代芳烷基都具有1-3個各自獨(dú)立的選擇性取代基，優(yōu)選的是低級烷基、羥基、低級烷氧基、羧基、低級烷氧羰基、硝基、氨基、單或雙低級烷氨基和氫。
與氮原子形成的雜環(huán)基包括吡咯烷基、哌啶基、哌啶子基、嗎啉基、嗎啉子基、硫代嗎啉子基、N-甲基哌嗪基、吲哚基、異吲哚基、咪唑基、咪唑啉基、噁唑啉基、噁唑基、三唑基、三唑啉基、吡唑基和吡唑啉酮基。與氧原子形成的雜環(huán)基包括呋喃、四氫呋喃、吡喃和四氫吡喃基。
“羥基烷基”是帶有羥基的烷基。鹵素包括氟、氯、溴和碘。
這里使用的術(shù)語“雜芳烷基”指含有雜原子的芳烷基。術(shù)語“氧”表示氧原子的存在。因而，“烷氧基”是由氧原子連接的烷基，“酰氧基”是由氧原子連接的羰基。
術(shù)語“雜環(huán)烷氧基”指具有連接在烷基部分上的雜環(huán)基的烷氧基，術(shù)語“芳烷氧基”指具有連接在烷基部分上的芳基的烷氧基。術(shù)語“烷基酰氧基”指結(jié)構(gòu)式為-O-C(＝O)-的基團(tuán)。
這里使用的術(shù)語“烷氧基烷氧基”指在它的烷基部分含有烷氧基的烷氧基。術(shù)語“烷氧烷硫基”指在它的烷基部分含有烷氧基的烷硫基(即結(jié)構(gòu)式-S-烷基表示的基團(tuán))。術(shù)語“羥基烷硫基”指在它的烷基部分含有羥基的烷硫基(即結(jié)構(gòu)式-S-烷基表示的基團(tuán))。
這里使用的術(shù)語“單糖”，其習(xí)慣含義表示簡單的糖。
這里使用的術(shù)語“氨基酸”，表示含有氨基和羧基的分子。氨基酸的實(shí)例包括α-氨基酸，即通式HOOC-CH(NH2)-(側(cè)鏈)表示的羧酸。
氨基酸的側(cè)鏈包括天然存在和非天然存在的兩部分。非天然存在的氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)窃谕惏被嶂杏脕砣〈烊淮嬖诘陌被醾?cè)鏈的部分。例如，參閱Lehninger，Biochemistry，第二版，Worth Publishers，Inc，1975，73-75引用于此作為參考。
優(yōu)選的α-氨基酸包括具有D構(gòu)型、L構(gòu)型或作為外消旋的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和賴氨酸。
更有代表性的α-氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)居谙旅姹?。
表1CH3- HS-CH2-HO-CH2-HO2C-CH(NH2)-CH2-S-S-CH2-C6H5-CH2- CH3-CH2-HO-C6H4-CH2-CH3-S-CH2-CH2- CH3-CH2-S-CH2-CH2-HO-CH2-CH2-CH3-CH(OH)-HO2C-CH2-NHC(＝O)-CH2- HO2C-CH2-CH2-NH2C(＝O)-CH2-CH2-(CH3)2-CH-(CH3)2-CH-CH2- CH3-CH2-CH2-H2N-CH2-CH2-CH2-H2N-C(＝NH)-NH-CH2-CH2-CH2-H2N-C(＝O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH3-CH2-CH(CH3)- CH3-CH2-CH2-CH2-H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-在某些優(yōu)選的實(shí)例中，式II化合物的取代基包括在脫除了羧基的羥基后的氨基酸殘基，即結(jié)構(gòu)式-C(＝O)-CH(NH2)-(側(cè)鏈)。
式II化合物上存在的官能團(tuán)可包括保護(hù)基。例如，式II化合物的氨基酸側(cè)鏈取代基可由芐氧基羰基或叔丁氧基羰基這樣的保護(hù)基取代。保護(hù)基在本質(zhì)上被認(rèn)為是可選擇性地連接到羥基和羰基等官能團(tuán)以及從這些官能團(tuán)上脫除的化學(xué)官能團(tuán)?；衔镏写嬖诘倪@些基團(tuán)，使這種官能團(tuán)對化合物所經(jīng)受的化學(xué)反應(yīng)條件成惰性。任何一種保護(hù)基都可用于本發(fā)明。這種保護(hù)基之一是芐氧羰(Cbz；Z)基。本發(fā)明的其他優(yōu)選保護(hù)基可參閱Greene，T.W和Wuts，P.G.M.，“Protective Groupsin Organic Synthesis”，第二版，Wiley&Sons，1991。
橋式茚并吡咯并咔唑化合物具有十分重要的功能藥物活性，在許多方面都有用途。這些衍生物可用作治療藥劑。這些化合物的活性對營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞的功能和/或存活顯示正效應(yīng)。對營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞如神經(jīng)譜系細(xì)胞的功能和/或存活的影響，已利用下述任一試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證(1)培養(yǎng)的脊髓乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(“ChAT”)試驗(yàn)；或(2)培養(yǎng)的基前腦神經(jīng)ChAT活性試驗(yàn)。
這里所使用的術(shù)語“影響”，當(dāng)用來修飾術(shù)語“功能”或“存活”時，指正或負(fù)的改變或變化。正效應(yīng)這里可能指“增強(qiáng)”或“增加”，負(fù)效應(yīng)這里可能指“抑制”或“抑制作用”。
這里所使用的術(shù)語“增強(qiáng)”或“增加”，當(dāng)用來修飾術(shù)語“功能”或“存活”時表示，橋式茚并吡咯并咔唑化合物對營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞的功能和/或存活的影響，與不存在該化合物的細(xì)胞相比，具有正效應(yīng)。例如，但并不局限于此，相對于神經(jīng)元的存活而言，如果被治療的人群比未被治療的人群具有更長的官能度期，與不存在這種化合物的人群膽堿能神經(jīng)元相比，該化合物能顯著增加處于死亡危險(如損傷、疾病、退化條件或自然進(jìn)化)的人群膽堿能神經(jīng)元存活期。
這里所使用的術(shù)語“抑制”或“抑制作用”，指在橋式茚并吡咯并咔唑化合物存在下，指定材料的特殊響應(yīng)(如酶活性)相對減少。
這里所使用的術(shù)語“trk”，指目前包含trkA、trkB和trkC的高親和性的一組神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白可結(jié)合其上的其他膜結(jié)合蛋白。
這里所使用的VEGFR的抑制作用，指在血管發(fā)生起重要作用的疾病中的應(yīng)用，如實(shí)體瘤癌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、糖尿病人的視網(wǎng)膜病、牛皮癬、成血管細(xì)胞瘤以及其他眼病和癌癥。
Trk的抑制作用，指在前列腺疾病中的應(yīng)用，如前列腺癌和良性前列腺增生，以及治療炎癥痛。
血小板引發(fā)的增長因素受體(PDGFR)的抑制作用，指用于各種形式的瘤形成、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肺纖維質(zhì)生成、骨髓纖維質(zhì)生成、非正常創(chuàng)傷愈合、心血管末端疾病如粥樣硬化、再狹窄(尤指心瓣的)、血管形成術(shù)后再狹窄等。
這里所使用的術(shù)語“癌”或“癌性的”，指任何哺乳動物細(xì)胞的惡性增生。實(shí)例包括前列腺、良性前列腺增生、卵巢、乳房、腦、肺、胰腺、結(jié)腸、胃的實(shí)體瘤、頭和頸的成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞瘤、淋巴瘤、白血病、其他已識別出的造血系統(tǒng)癌癥以及其他已識別的癌癥。
這里所使用的“神經(jīng)元”、“神經(jīng)元系細(xì)胞”和“神經(jīng)元細(xì)胞”包括但不限于具有單一或復(fù)合遞質(zhì)和/或單一或復(fù)合功能的異基因人群神經(jīng)元類型；優(yōu)選膽堿能神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元。這里所使用的詞組“膽堿能神經(jīng)元”指神經(jīng)元遞質(zhì)是乙酰轉(zhuǎn)移酶的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)元；實(shí)例是前腦神經(jīng)元、紋狀體神經(jīng)元和脊髓神經(jīng)元。這里所使用的詞組“感覺神經(jīng)元”包括皮膚、肌肉和關(guān)節(jié)對環(huán)境條件(如溫度、運(yùn)動)產(chǎn)生響應(yīng)的神經(jīng)元，實(shí)例是脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元。
這里所定義的“營養(yǎng)因子響應(yīng)細(xì)胞”，是包括營養(yǎng)因子可以特別結(jié)合其上的受體的細(xì)胞；實(shí)體包括神經(jīng)元(如膽堿能神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元)和非神經(jīng)元細(xì)胞(如單核細(xì)胞和腫瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞)。
這里描述的橋式茚并吡咯并咔唑化合物在研究領(lǐng)域和治療領(lǐng)域都能找到用途，例如，抑制酶的活性。例如，在研究領(lǐng)域，該化合物可用來開發(fā)某些試驗(yàn)和方法，以進(jìn)一步加深對絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸蛋白激酶(如PKC、trk酪氨酸激酶)的抑制作用在相關(guān)的失調(diào)和疾病的機(jī)理方面所起作用的理解。在治療領(lǐng)域，抑制這些酶活性的化合物，可用來抑制這些酶對失調(diào)如癌癥帶來的有害結(jié)果。
像后面的實(shí)施例證明的那樣，利用橋式茚并吡咯并咔唑化合物對酶活性的抑制作用可由下面的試驗(yàn)確定1.trkA酪氨酸激酶活性抑制試驗(yàn)；2.在所有細(xì)胞制備中NGF-摸擬trk磷酸化的抑制作用；3.血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)激酶抑制試驗(yàn)；4.PKC活性抑制試驗(yàn)；5.PDGFR活性抑制試驗(yàn)。
公開的橋式茚并吡咯并咔唑化合物可用來增強(qiáng)哺乳動物如人的神經(jīng)譜系細(xì)胞的功能和/或存活期。在這些應(yīng)用中，該化合物可單獨(dú)使用，或同其他稠合的吡咯并咔唑化合物和/或吲哚并咔唑化合物一起使用，或同其他也能影響所說細(xì)胞功能和/或存活期的有益的分子一起使用。
各種各樣的神經(jīng)紊亂由死亡的、受損的、功能減退的、正遭受軸突退化的、處于死亡危險的神經(jīng)元細(xì)胞所表征。這些紊亂包括但不限于阿爾茨姆默氏?。贿\(yùn)動原神經(jīng)元紊亂(肌肉萎縮硬化)；帕金森病；腦血管紊亂(如沖程、局部缺血)；杭廷頓氏病；AIDS癡呆；癲癇；多發(fā)性硬變；包括糖尿病人神經(jīng)病在內(nèi)的外周神經(jīng)病(如在治療外周神經(jīng)病的化學(xué)療法中影響DRG神經(jīng)元的那些病)；由興奮性氨基酸引起的疾??；和腦或脊髓的振蕩性或穿透性損傷相關(guān)的疾病。
ChAT催化神經(jīng)元遞質(zhì)乙酰膽堿的合成，它被看作是功能膽堿能神經(jīng)元的酶標(biāo)志。功能神經(jīng)元也是能存活的。神經(jīng)元存活通過活的神經(jīng)元對染料(如鈣黃綠素AM)的特定吸收量和酶轉(zhuǎn)化量來測試。
這里描述的化合物，包括由這里描述的方法鑒定的化合物，由于它們用途的多樣性，在許多領(lǐng)域都可找到應(yīng)用。這里化合物可用來開發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞存活、功能、鑒定的體外摸型，或區(qū)分與這里描述的化合物或由這里描述的方法鑒定的化合物具有相同活性的其他合成化合物。這里描述的化合物以及由這里描述的方法鑒定的化合物，可在研究領(lǐng)域應(yīng)用，以研究、定義和確定與功能響應(yīng)相關(guān)的分子目標(biāo)。例如，通過放射性標(biāo)記橋式茚并吡咯并咔唑化合物或由這里描述的方法鑒定的化合物，結(jié)合特定的細(xì)胞功能(如分裂)，該衍生物結(jié)合的目標(biāo)實(shí)體可被鑒定、分離、純化以進(jìn)行表征。
這里描述的化合物以及由這里描述的方法鑒定的化合物，尤其用來不僅增強(qiáng)營養(yǎng)響應(yīng)細(xì)胞的營養(yǎng)因子誘導(dǎo)活性，如膽堿能神經(jīng)元，而且還可作為其他神經(jīng)元細(xì)胞的存活保護(hù)劑，如多巴胺能神經(jīng)元或谷氨酸能神經(jīng)元。通過包括但不限于ras，rac和cdc42在內(nèi)的小GTP結(jié)合蛋白向下游的信號級聯(lián)擴(kuò)增，生長因子可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活期(Denhardt，Biochem.J.，1996，318，729)。具體地說，ras的活性導(dǎo)致磷酸化和胞外受體活化激酶(ERK)的活化，這同生物生長過程和微分過程相聯(lián)系。rac和cdc42的刺激作用導(dǎo)致NJK和p38活性以及同脅迫、編程性細(xì)胞死亡和炎癥相關(guān)的響應(yīng)的增加。雖然生長因子響應(yīng)主要是通過ERK路線，但后面這些過程的影響，可導(dǎo)致摸擬增強(qiáng)存活性生長因子的神經(jīng)元存活機(jī)理的改變(Xia等，Science，1995，270，1326)。該化合物還可作為神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞的存活保護(hù)劑，這是通過與生長因子平均存活相關(guān)的機(jī)理，但不同于該機(jī)理而實(shí)現(xiàn)的，例如，由抑制編程性細(xì)胞死亡過程可導(dǎo)致存活的JNK和p38路線的抑制作用。
本發(fā)明的化合物可用來治療與ChAT活性減少或死亡以及脊髓運(yùn)動神經(jīng)元損傷相關(guān)的疾病，還可用于內(nèi)部和周圍神經(jīng)元系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的編程性細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病以及炎癥疾病。
本發(fā)明的化合物還可用來治療涉及癌細(xì)胞增殖的疾病，如各種癌癥。
這里描述的化合物以及由本發(fā)明的方法鑒定的化合物的藥用鹽，包括藥用的酸加成鹽、金屬鹽、氨鹽、有機(jī)胺加成鹽和氨基酸加成鹽。酸加成鹽的實(shí)例有無機(jī)酸加成鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽，以及有機(jī)酸加成鹽如乙酸鹽、馬來酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽和乳酸鹽；金屬鹽的實(shí)例有堿金屬鹽如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽、鋁鹽和鋅鹽；銨鹽的實(shí)例有銨鹽和四甲基銨鹽；有機(jī)胺加成鹽的實(shí)例有同嗎啉和哌啶加成的鹽；氨基酸加成鹽的實(shí)例有同甘氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和賴氨酸加成的鹽。
這里提供的化合物，包括由本發(fā)明的方法鑒定的化合物，通過與藥用可接受的賦形劑和載體混合，可配制成藥用組合物。這些組合物可制備成不經(jīng)腸給藥的用劑，特別是溶液或懸浮液；可制備成口服給藥的用劑，特別是丸劑或膠囊；可制備成鼻內(nèi)給藥的用劑，特別是粉劑、鼻滴劑或煙霧劑；可制備成經(jīng)皮膚給藥的用劑，例如，經(jīng)皮膚的膜片劑。
該組合物可以單劑量的形式常規(guī)給藥，可由藥物領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的任何方法制備，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(MarkPub.Co.，Easton，PA，1980)內(nèi)描述的方法。不經(jīng)腸給藥的制劑可含有普通的賦形劑，如無菌水或鹽水、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、油和菜油、氫化萘等。特別是，生物可適應(yīng)的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是可用作控制活性化合物釋放的賦形劑。這些活性化合物的其他潛在有用的不經(jīng)腸的輸送系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、反滲透泵、可植入的注入系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入給藥的制劑作為賦形劑包含的有乳糖，或是包含如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或作為鼻滴劑形式給藥的油性溶液，或作用凝膠經(jīng)鼻內(nèi)使用。不經(jīng)腸給藥的制劑還可包含頰給藥用甘膽酸鹽、直腸給藥用水楊酸鹽或陰道給藥用檸檬酸。經(jīng)皮膚膜片劑優(yōu)選親油性乳化液。
本發(fā)明的化合物在藥用組合物中可作為單一活性劑使用。另外，它們可同其他活性組分一塊使用，如其他有助于病人或失調(diào)者神經(jīng)元存活或軸突再生的生長因子。
本發(fā)明的化合物及其藥用鹽可口服或非口服，如軟膏劑和注射劑。本發(fā)明的化合物在治療組合物中的濃度是可變化。其濃度將取決于所服藥的總劑量、所用化合物的化學(xué)特性(如疏水性)、服藥的方式、病人的年齡、體重和癥狀等。本發(fā)明的化合物一般是提供包含大約0.1-10％w/v為非腸道給藥化合物的生理緩沖水溶液。一般的劑量范圍從大約1μg/kg到大約1g/kg體重/每天；優(yōu)選的劑量范圍從大約0.01mg/kg到大約100mg/kg體重/每天，更優(yōu)選大約0.1-20mg/kg，每天1-4次服用。服藥的優(yōu)選劑量似乎取決于很多因素，如疾病或失調(diào)的類型和發(fā)展程度、具體病人的總的健康狀況、所選擇化合物的相對生物有效性、化合物賦形劑的配制和服用的方式。
本發(fā)明的化合物，包括試驗(yàn)化合物和由本發(fā)明的方法鑒定化合物，及其藥用鹽，依照藥理活性和服用的目的，可單獨(dú)服用，也可以各種藥用組合物的形式服用。本發(fā)明的藥用組合物可通過均勻混合作為活性組分的有效量的化合物或其藥用鹽同藥用載體來制備。根據(jù)適于服用的組合物的各種形式，載體可從很寬的范圍選取。制備成適合于口服或非口服的單劑形式的那些藥用組合物是所希望的。非口服的制劑包括膏劑和針劑。
片劑可按照常規(guī)方法利用賦形劑如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和甲基纖維素；分散劑如淀粉、藻酸鈉、羧基甲基纖維素鈣和晶態(tài)纖維素；潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石；粘合劑如明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素和甲基纖維素；表面活性劑如蔗糖脂肪酸酯和山梨醇脂肪酸酯等來制備。優(yōu)選每片劑包含15-300mg的活性組分。
粒劑可按照常規(guī)方法利用賦形劑如乳糖、蔗糖、分散劑如淀粉、粘合劑如明膠等來制備。粉?？砂凑粘Ｒ?guī)方法利用賦形劑如乳糖、甘露糖醇等來制備。膠囊劑可按照常規(guī)方法利用明膠、水、蔗糖、阿拉伯樹膠、山梨醇、甘油、晶態(tài)纖維素、硬脂酸鎂和滑石等來制備。優(yōu)選每粒膠囊包含15-300mg的活性組分。
糖漿制劑可按照常規(guī)方法利用糖如蔗糖、水、乙醇等來制備。
膏劑可按照常規(guī)方法利用膏劑基料如凡石林、液體石臘、羊毛脂和大粒凝膠；乳化劑如十二烷基乳酸鈉、苯札氯銨、脫水山梨醇單脂肪酸酯、羧基甲基纖維素鈉和阿拉伯樹膠等來制備。
針劑可按照常規(guī)方法利用溶劑如水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇；增溶劑如苯甲酸鈉、水楊酸鈉和尿烷；等滲劑如氯化鈉、葡萄糖；防腐劑如酚、苯甲酚、對羥基苯甲酸酯和氯化丁醇；抗氧化劑如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉等來制備。
本發(fā)明由下述用來解釋本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步說明。這些實(shí)施例不是要限制本發(fā)明的范圍，也不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1合成方法和實(shí)施例概述為制備本發(fā)明式II表示橋式茚并吡咯并咔唑化合物所采用的一般合成路線示于圖1和2。茚并吡咯并咔唑(III)/(XIII)合成的一般程序可按美國專利No.5,705,511中描述的方法進(jìn)行，其公開內(nèi)容特此引用以全面參考。當(dāng)R1是H時，茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)的內(nèi)酰胺氮由導(dǎo)致(IV)/(X)的適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)。將該被保護(hù)的化合物用合適的堿在無水有機(jī)溶劑中處理，就產(chǎn)生被認(rèn)為是碳負(fù)離子的暗紅色溶液。碳負(fù)離子同雙功能試劑(V)反應(yīng)，導(dǎo)致親電加成到(V)的C＝Y(jié)鍵上，形成初始中間體(VI)/(X)。用磺酸或路易斯酸如三氟化硼乙醚合物處理中間體(VI)/(X)和/或(VII)/(XI)，就得到橋式茚并吡咯并咔唑(I)/(II)。
內(nèi)酰胺氮保護(hù)方法(示于圖3和4)可由酸或堿催化法進(jìn)行。酸催化反應(yīng)可由能夠把茚并吡咯并咔唑(III)/(VIII)固定在聚合物載體上的樹脂結(jié)合試劑，如聚苯乙烯基的Rink酸樹脂(XII)(圖3)進(jìn)行，由此得到(XIII)。另外，酸催化反應(yīng)可由可溶性試劑進(jìn)行，得到化合物(XIV)(圖4)。硅烷基保護(hù)的化合物(XV)由堿催化制備(圖4)。
圖5描述了幾種制備中間體(V)的方法。方法(a)描述的是各種縮醛(XVI)向(XVII，Z＝鍵)的轉(zhuǎn)化。例如，酯-縮醛/縮酮(XVI，D＝COOR)完全被還原成相應(yīng)的醇，接著被氧化(例如，Swern or Dess-Martin氧化)為醛-縮醛/縮酮(XVII，R8＝H)。另外，酯-縮醛/縮酮(XVI，D＝COOR)部分由DIBAL還原，直接得到醛(XVII，R8＝H)。同樣，腈-縮醛(XVI，D＝CN)由DIBAI還原，給出醛(XVII，R8＝H)。氧代-縮醛/縮酮通過把格利雅試劑加入到Weinreb胺-縮醛/縮酮(XVI，D＝CON(OMe)Me)中而制備。
中間體(XVII，Z＝鍵)還可通過方法(b)概述的兩步法制備。有機(jī)金屬試劑(XIX)加入到縮醛/縮酮(XVIII)中得到烯(XX)，臭氧分解后再進(jìn)行還原反應(yīng)分離，得到縮醛/縮酮(XVII)。中間體(XVII，Z＝雜原子)的兩步法制備概述于方法(c)。偶聯(lián)縮醛(XXII)與烯(XXI)，接著臭氧分解(用還原劑)所得到的烯，得到氧代-縮醛/縮酮(XVII)。另外，中間體(XVII，Z＝雜原子)由方法(d)概述的兩步法制備。化合物(XXIV)與縮醛/縮酮(XVIII)反應(yīng)給出(XXV)，再由方法(a)描述的方法轉(zhuǎn)化為氧代-縮醛/縮酮(XVII)。氧代-縮醛/縮酮(XVII)與羥基胺、肼、N-烷基-N-烷氧基胺和胺縮合，給出親電性C＝N功能基的中間體(XXVI)。
樹脂結(jié)合的茚并吡咯并咔唑(XIII)(圖6，方法A)用過量的作為堿的格利雅試劑處理，結(jié)果產(chǎn)生暗紅色的負(fù)碳離子溶液。接著與(V)反應(yīng)，得到親電加成到C＝Y(jié)基上的產(chǎn)品。用稀酸(1％TFA在二氯甲烷中)使該產(chǎn)品從其樹脂上分離凈化，就分離出化合物(XXVII)和/或(XXVIII)。用磺酸或路易斯酸如三氟化硼醚合物處理中間體(XXVII)和/或(XVVIII)，得到橋式茚并吡咯并咔唑(II)。
類似的方法被用于可溶性內(nèi)酰胺保護(hù)的中間體，如(XV)(圖7，方法B)。但是，在這種情況，中間體(XV)是用在吡啶中的氫氧化四烴銨(Triton B)作為堿來處理，而不是用格利雅試劑。中間體(XXIX)和/或(XXX)可同內(nèi)酰胺保護(hù)的接觸而分離出來，它們適合于用色譜法純化。如方法A，(圖6)，用路易斯酸(如三氟化硼醚合物)，就得到橋式茚并吡咯并咔唑(II)，其中R1＝H。
引入基團(tuán)R3，R4，R5and R6可照美國專利Nos.5,705.511和4,923,986中描述的方法進(jìn)行，整體引入其公開內(nèi)容以供參考。R3取代基可在構(gòu)成橋式茚并吡咯并咔唑后另外引入，如圖8所示。B環(huán)的3位置由NBS溴化就得到化合物(XXXI)。碳片斷通過利用鈀催化的Stille，Suzuki，Heck，Kumada或Castro-Stephens反應(yīng)隨后引入，得到(XXXII)，(XXXIII)等類型的化合物。此外，化合物(XXXI)可利用溴被雜原子取代的化合物，如胺作基礎(chǔ)的基團(tuán)，由Buchwald′s鈀催化的銨中和反應(yīng)制備。
通過氧化方法，氧連接基可在E環(huán)的茚碳上引入，如圖9所示的化合物(XXXIV)。這個化學(xué)反應(yīng)還可導(dǎo)致內(nèi)酰胺(A環(huán))亞甲基的氧化，得到亞胺衍生物，如所示。
實(shí)施例2Rink樹脂結(jié)合的中間體(XIII-A)，(XIII-B)和(XIII-C)的制備，(圖3)實(shí)施例2A在裝備有塔頂機(jī)械攪拌器和Dean-Stark阱的三頸圓底燒瓶中順序加入Rink酸樹脂XII(10.00g，0.64mmol/g)，1-甲基-2-吡咯烷酮(80mL)，苯(350mL)，VIII-A(A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H))(3.00g)和對甲苯磺酸(1.00g)。該反應(yīng)混合物被加熱到回流20小時，而后過濾。樹脂用THF(5×175mL)過濾，濾液放置一邊。而后樹脂順序用DMSO(4×100mL)，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，水(4×100mL)，DMSO(2×200mL)，THF(4×100mL)和乙酸乙酯(4×100mL)洗滌。使樹脂真空干燥(24小時)，得到11.70(0.47mmol/g)樹脂結(jié)合的VIII-A，(XIII-A)。
蒸發(fā)第一次的THF洗滌液，殘留物用水(750mL)洗滌，過濾所得沉淀，再順序用水2％NaHCO3水溶液(4×100mL)和水(4×100mL)洗滌。真空干燥后重新獲得VIII-A(1.28g)。
實(shí)施例2-B按照類似的方法，將VIII-B(A1，A2＝O，B1，B2＝H2，R3＝R4＝R5＝R6＝H)(0.5g)偶聯(lián)到Rink酸樹脂XII(1.52g)上，得到1.58g樹脂結(jié)合的VIII-B，(XIII-B)。
實(shí)施例2-C按類似的方法，將VIII-C(A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝H，R6＝10-OMe)(1.02g)偶聯(lián)到Rink酸樹脂XII(3.12g)上，得到3.70g(0.46mmol/g)樹脂結(jié)合的VIII-C，(XIII-C)以及重新獲得的VIII-C(0.44g)。
實(shí)施例3化合物(II-1)，(II-2)，(II-3)，(II-4a)，(II-4b)，(II-6)和(II-8)的制備(方法A，圖6)向(XIII-A)(1.25g)在THF(24mL)懸浮液加入1.0M的EtMgBr(6.25mL在THF)溶液，反應(yīng)混合物在加入HMPA(5.0mL)之前攪拌1小時。攪拌10分鐘后，加入二乙氧基丁醛(3.0g)(按照Paquette等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，9662-71文獻(xiàn)中的方法制備)，該反應(yīng)攪拌20小時。反應(yīng)用10％NH4C1(5mL)水溶液淬滅，并過濾。該樹脂連續(xù)用10％NH4Cl(3×10mL)水溶液，水(3×10mL)，THF(3×10mL)，DMF(3×10mL)，水(3×10mL)，THF(3×10mL)，和乙醚(3×10mL)洗滌。再將該樹脂真空干燥，溶解在二氯甲烷(15mL)中，用三氟乙酸(0.15mL)處理。攪拌1小時后，過濾反應(yīng)物，蒸發(fā)濾液。所得到的殘留物溶解在二氯甲烷(20mL)中，并用吡啶鎓甲苯磺酸鹽(50mg)處理，將所得溶液攪拌4小時。這時用飽和的NaHCO3水溶液和鹽水洗滌反應(yīng)物，用MgSO4干燥。
過濾和蒸發(fā)溶劑后，殘留物用制備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，由60％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當(dāng)?shù)酿s分用NaHCO3中和并萃取到二氯甲烷(3×50mL)中，MgSO4干燥。過濾和蒸發(fā)溶劑后，得到70.2mg的化合物II-1，為白色粉末，具有以下特性13CNMR(DMSO 171.8，143.3，142.4，141.4，140.1，140.0，136.6，129.2，127.9，127.4，127.1，126.8，124.1(2C)，122.7，121.6，121.5，118.3，112.1，88.1，79.2，56.6，45.6，33.4，24.8；1H NMR(DMSO-d6)d 9.21(d，J＝7.5，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.86(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.3，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.41(dd，J＝7.5，7.4，1H)，7.36-7.27(m，2 H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.91(s，2H)，4.53(d，J＝3.3，1H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值379，實(shí)測值379。
化合物II-2(0.5mg)也可由該反應(yīng)混合物用制備性HPLC分離得到，具有以下的特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.17(d，J＝8.1，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.0，1H)，7.85(d，J＝6.8，1H)，7.57(d，J＝6.8，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.44-7.26(m，3H)，6.81(d，J＝6.0，1H)，5.43-5.33(m，1H)，4.43(s，2H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，1.45-1.55(m，2H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)，0.29(t，J＝7.0，3H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值407，實(shí)測值407。
實(shí)施例3-B按照同樣的方法，像上面制備化合物II-1描述的那樣，樹脂(XIII-A)(70.3 25mg)用1，1-二乙氧基-2-戊酮(0.75mL)(按照Sworin等，J.Org.Chem.，1988，53，4894-6文獻(xiàn)中的方法制備)處理，得到化合物II-3(3.5mg)，由制備性TLC(硅膠，用50％EtOAc/甲苯洗脫)分離，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.42(d，J＝8.2，1H)，8.58(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.79(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.1)，7.50-7.20(m，4H)，6.81(d，J＝5.9，1H)，4.90(s，2H)，4.46(s，1H)，2.35-2.20(m，1H)，1.98(s，3H)，1.75-1.60(m，1H)，1.25-1.00(m，1H)，0.35-0.15(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值393，實(shí)測值393。
實(shí)施例3-C按照同樣的方法，(XIII-A)(74.3mg)用1，1-二乙氧基-2-己酮(按照Brenner，J.org.Chem.1961，26.22-7文獻(xiàn)中的方法制備)(0.75mL)處理，得到化合物II-4a(2.10mg)和化合物II-4b(1.06mg)，分別由制備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離?；衔颕I-4a具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.30(d，J＝8.3，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，J＝7.2，1H)，7.65(d，J＝8.5，1H)，7.59(d，J＝7.5)，7.48(dd，J＝7.8，7.2，1H)，7.39-7.15(m，3H)，6.31(dd，J＝5.9，5.5，1H)，5.02(s，1H)，4.88(s，2H)，0.88(s，3H)其他脂族訊號在溶劑峰下?lián)p失；MS m/z(M+H)計(jì)算值407，實(shí)測值407?；衔颕I-4b具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.43(d，J＝8.1，1H)，8.59(s，1)，7.99(d，J＝7.3，1H)，7.75-7.65(m，2H)，7.49(dd，J＝7.0，6.4，1H)，7.43(dd，J＝8.2，8.1，1H)，7.36-7.25(m，2H)，6.75(s，1H)，4.91(s，2H)，4.50(s，1H)，1.95(s，3H)其他脂族訊號在溶劑峰下?lián)p失；MS m/z(M+H)計(jì)算值407，實(shí)測值407。
實(shí)施例3-D按照同樣的方法，(XIII-C)(1.00g)用二乙氧基丁醛(3.65g)處理，得到化合物II-6(87.8mg)，由制備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離。具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝8.6，1H)，8.60(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.84(d，J＝8.3，1H)，7.47(dd，J＝7.2，7.0，1H)，7.35(s，1H)，7.29(dd，J＝7.0，7.0，1H)，6.98(dd，J＝8.6，1.9，1H)，6.83(d，J＝6.0，1H)，5.65-5.55(m，1H)，4.88(s，2H)，4.48(d，J＝3.9，1H)，3.82(s，3H)，225-2.10(m，1H)，2.08-1.85(m，1H)，0.96-0.75(m，1H)，0.65-0.50(m，1H)；MS m/z(M+Na)計(jì)算值431，實(shí)測值431。
實(shí)施例3-E按照同樣的方法，樹脂(XIII-B)(153.2mg)用二乙氧基丁醛(1.5mL)處理，得到化合物II-8(3.6mg)，由制備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離。具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝7，9，1H)，8.81(s，1H)，7.81-7.73(m，3H)，7.48-7.35(m，3H)，7.24(dd，J＝7.6，7.5，1H)，6.85(d，J＝6.2，1H)，5.63-5.59(m，1H)，4.86(s，2H)，4.61(d，J＝3.6，1H)，3.82(s，3H)，2.21-2.13(m，1H)，1.96-1.90(m，1H)，0.87-0.79(m，1H)，0.61-0.56(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值379，實(shí)測值379。
實(shí)施例4化合物II-7a and I1-7b制備(方法A，圖6)實(shí)施例4A(1，1-二乙氧基乙氧基)丙酮的制備向冷的(0℃)NaH(2.68g，60％)在THF(150mL)懸浮液加入在THF(20mL)中的1，1-二乙氧基乙醇(按照Zirkie等，J.Org.Chem.，1961，26，395-407文獻(xiàn)中的方法制備)(9.00g)，在加入二氯甲烷(8.0mL)前使該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時。將該反應(yīng)混合物加熱到回流過液，冷卻，通過塞里塑料管塞過濾。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，殘留物由柱色譜法純化(硅膠，20％乙醚/己烷)，得到1，1-二乙氧基乙基甲代烯丙基醚(11.5g，90％)。對該醚(6.00g)在EtOAc(80mL)中冷卻了的(-30℃)溶液進(jìn)行臭氧分解，至到起始原料不能被TLC(1小時)檢出止。這時，反應(yīng)物用氧清洗，用Pd(OH)2(150mg)處理，在氫氣氛下攪拌過夜。濾除催化劑，濾液由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。所得到的殘留物用柱色譜法純化(硅膠，20％EtOAc/己烷)，得到標(biāo)題化合物(4.53g，82％)。
實(shí)施例4-B按照方法A(圖6)，樹脂(XllI-A)(230.2mg)用EtMgBr(1.25mL)處理，而后用(1，1-二乙氧基乙氧基)丙酮(實(shí)施例3-A)(1.2mL)處理。在從樹脂上分離凈化后，將一部分粗反應(yīng)產(chǎn)物混合物(10.5mg)溶解在二氯甲烷(20μL)中，并用BF3醚合物(20μL)處理。在攪拌2.5小時后，該溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，而后用MgSO4干燥。在過濾并蒸除溶劑后，殘留物用制備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)凈化，得到化合物II-7a(2.34mg)和化合物II-7b(1.34mg)?；衔颕I-7a具有以下特性1H NMR(CDCl3)δ9.35-9.20(m，1H)，7.87(d，J＝7.6，1H)，7.62(d，J＝7.0，1H)，7.60-7.45(m，1H)，7.49(dd，J＝7.7，7.5，1H)，7.40(d，J＝8.1，1H)，7.37-7.26(m，3H)，6.22(s，1H)，5.20-4.85(m，1H)，4.47(s，1H)，3.67(d，J＝12.7，1H)3.52(d，J＝11.8，1H)，3.40(d，J＝12.7，1H)，3.38(d，J＝11.8，1H)，1.91(s，3H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值409，實(shí)測值409?；衔颕I-7b具有以下特性1H NMR(CDCl3)δ9.58-9.22(m，1H)，7.82(d，J＝7.4，1H)，7.60-7.40(m，3H)，7.37-7.27(m，3H)，7.21(d，J＝8.1，1H)，5.81(s，1H)，5.21(s，1H)，5.10-4.80(m，1H)，4.59(d，J＝13.5，1H)，4.38(dd，J＝13.5，5.3，IH)，4.21(d，J＝13.1，1H)，3.82(d，J＝13.2，1H)，1.13(s，3H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值409，實(shí)測值409。
實(shí)施例5化合物II-5的制備(圖8)向化合物II-1(8.1mg)在THF(2mL)中的溶液加入NBS(4.6mg)，使反應(yīng)攪拌過夜。加入另外的NBS(4.5mg)使該反應(yīng)攪拌2.5小時。濾除不溶物，濾液由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。所得到的殘留物用柱色譜法純化(C-18，65％MeCN/水wI 0.1％三氟乙酸)。適當(dāng)?shù)酿s分用NaHCO3中和，并萃取到二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4干燥。過濾并蒸除溶劑后，得到化合物II-5(5.1mg)，白色粉末，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.4，1H)，8.67(s，1H)，8.14(s，1H)，7.86(d，J＝8.7，1H)，7.72(d，J＝7.0，1H)，7.63(d，J＝7.8，1H)，7.42(dd，J＝7.5，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.3，7.2，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.94(s，2H)，4.54(d，J＝3.1，1H)，2.30-2.14(m，1H)，2.00-1.82(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.62-0.50(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值457/9(1∶1)，實(shí)測值457/9(1∶1)。
實(shí)施例6中間體XV的制備(圖4)向VIII-A[A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H)](1.05g)在DMF(25ml)中的溶液加入三乙胺(0.75mL)和氯代叔丁基二甲基硅(TBS-Cl)(0.65g)。攪拌3小時后，該反應(yīng)用飽和NaHCO3淬火，并萃取到EtOAc中。有機(jī)層用水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥。在過濾蒸出溶劑后，所得到的殘留物用乙醚研制，得到化合物XV(848mg)。洗滌液蒸發(fā)留下殘留物，用柱色譜法純化(硅膠，1％EtOAc/CH2CI2)，得到另一份產(chǎn)品(502mg，結(jié)合產(chǎn)率94％)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ11.94(s，1H)，9.32(d，J＝7.6，1H)，8.03(d，J＝7.7，1H)，7.64(d，J＝7.2，1H)，7.58(d，J＝8.1，1H)，7.44(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.39(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.32(d，J＝7.3，1H)，7.25(dd，J＝7.6，7.3，1H)，5.00(s，2H)，4.14(s，2H)，0.99(s，9H)，0.46(s，6H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值425，實(shí)測值425。
實(shí)施例7由方法B制備化合物II-1(圖7)Triton B在吡啶(0.45M)中的溶液通過在吡啶(10mL)中溶解40％的Triton B甲醇溶液(10mL)而制備。減壓(20mm Hg)排除溶劑到最后剩8mL。殘留物由吡啶稀釋到50mL，在氮?dú)夥障逻^濾保存。XV(20.3mg)在吡啶(2.0mL)的溶液用氬氣清洗，用300μL的TritonB(0.45M在吡啶中)和二乙氧基丁醛(50μL)處理。在攪拌2小時后，將反應(yīng)物萃取到EtOAc中，用1N的HCl水溶液、鹽水洗滌，MgSO4干燥。過濾并蒸出溶劑，加成物溶解在CH2Cl2(10mL)，用BF3醚合物(10mL)處理。在攪拌2小時后，該溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，而后MgSO4干燥。由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)排除溶劑，得到的殘留物用制備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當(dāng)?shù)酿s分用NaHCO3中和，并萃取到中二氯甲烷(3×20mlL)中，并用MgSO4干燥。過濾蒸出溶劑后，得到II-1(11.8mg，產(chǎn)率65％)，其1HNMR和MS光譜以及HPLC保留時間同由實(shí)施例3-A描述的方法A制備和分離的產(chǎn)品相同。
實(shí)施例8化合物II-9的制備(圖8)向溴代化合物II-5(6.2mg)在1-丙醇(4.0mL)中的溶液加入3-氨基苯基硼酸(3.8mg)。攪拌0.25小時后，順序加入Pd(OAc)2(2.0mg)，Ph3P(4.8mg)，Na2CO3(2.8mg)，and水(2.0mL)。將該混合物加熱回流0.75小時，冷卻，萃取到CH，Cl2中，用水和鹽水洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)排除溶劑，得到的殘留物用制備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，50％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當(dāng)?shù)酿s分用NaHCO3中和，并萃取到中二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4干燥。過濾蒸出溶劑后，得到II-9(3.1mg，產(chǎn)率49％)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.5，1H)，8.66(s，1H)，8.00-7.25(m，8H)，7.12(dd，J＝7.1，7.0，1H)，6.95-6.80(m，3H)，6.53(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.99(s，2H)，4.55(s，1H)，2.25-2.10(m，1H)，1.95-1.90(m，1H)，0.98-0.88(m，1H)，0.65-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值470，實(shí)測值470。
實(shí)施例9化合物II-10的制備(圖9)向化合物II-1(5.0mg)在DM50(1mL)中的溶液加入NaCN(4.3mg)，反應(yīng)混合物加熱到145℃1小時。使該混合物冷卻，萃取到EtOAc，用水(3×20mL)和鹽水洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥，過濾蒸發(fā)，得到的殘留物用制備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，55％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當(dāng)?shù)酿s分用NaHCO3中和，并萃取到二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4干燥。過濾蒸出溶劑后，得到II-10(2.7mg，產(chǎn)率50％)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ11.4(s，1H)，8.86(d，J＝7.9，1H)，8.79(d，J＝7.6，1H)，7.90(d，J＝8.3，1H)，7.62-7.55(m，2H)，7.49(dd，J＝7.6，7.4，3H)，7.40(dd，J＝7.4，7.31H)，7.35(dd，J＝7.5，7.4，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，6.03(s，1H)，5.40-5.30(m，1H)，2.25-2.14(m，1H)，2.03-1.90(m，1H)，1.10-0.98(m，1H)，0.82-0.77(m，1H)。
實(shí)施例10化合物II-11的制備(方法A，圖6)按照方法A，樹脂(XIIIa)(150.2mg)同EtMgBr(1.0mL)反應(yīng)，接著用2，5-二氧代戊酸乙酯(Schmidt等，Synthesis，1993，809)(1.5mL)處理。在與樹脂分離凈化后，將粗反應(yīng)產(chǎn)物混合物溶解在二氯甲烷(20mL)中，并用BF3醚合物(20μL)處理。在攪拌2.5小時后，該溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，而后用MgSO4干燥。在過濾除去溶劑后，殘留物用制備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，55-57％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)凈化，得到化合物II-11(6.4mg)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.36(d，J＝7.7，1H)，8.68(s，1H)，8.00(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.3，1H)，7.58-7.15(m，5H)，6.97(d，J＝5.9，1H)，4.93(s，2H)，4.82(s，1H)，4.48(q，J＝7.1，2H)，2.42-1.91(m，2H)，1.37(t，3H，J＝7.1)，1.25-0.63(m，2H)。
實(shí)施例11化合物II-12的制備化合物II-11(3.4mg)在THF(2mL)中的溶液用2M的LiBH4溶液(1.0mL在THF中)處理，使該反應(yīng)攪拌1小時。加入IN的HCI(4mL)水溶液使反應(yīng)淬火。在攪拌20分鐘后，加入10％NaOH水溶液(15mL)，并將該混合物萃取到二氯甲烷(3×10mL)中。用MgSO4干燥后，過濾反應(yīng)混合物，蒸出溶劑，得到化合物II-12(0.32mg)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.35(d，J＝7.7，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.2，1H)，7.75(d，J＝8.2，1H)，7.50-7.25(m，4H)，6.84(d，J＝7.7，1H)，6.1 1(s，1H)，4.91(s，2H)，4.71(s，1H)，4.50-4.40(m，1H)，4.30-4.20(m，1H)2.42-1.91(m，2H)，1.25-0.63(m，2H)；MS m/z(M+H)計(jì)算值.409，實(shí)測值409。
實(shí)施例12脊髓ChAT活性的增加ChAT是功能性膽堿能神經(jīng)元的特定標(biāo)記物。膽堿能神經(jīng)元表示輸入海馬趾結(jié)構(gòu)、嗅覺神經(jīng)核、腳間核、皮質(zhì)、扁桃體和部分背側(cè)丘腦的主要膽堿能。在脊髓中，運(yùn)動神經(jīng)元是含有ChAT的運(yùn)動神經(jīng)元(Phelps等人，J.Comp.NeuroL，1988，273，459-472)。ChAT活性用于研究神經(jīng)營養(yǎng)因子(例如，NGF或NT-3)對膽堿能神經(jīng)元的存活和/或功能的影響。ChAT試驗(yàn)也用作調(diào)整膽堿能神經(jīng)元內(nèi)ChAT水平的指示。
方法分離出大鼠胎兒脊髓細(xì)胞，試驗(yàn)按Smith等人，J.CellBiology，1985，101，1608-1621；Glicksman等人，J.Neurochem.，1993，61，210-221所述的方法進(jìn)行。用標(biāo)準(zhǔn)的胰蛋白酶技術(shù)(Smith等人，見上文)，由大鼠(14-15天的胚胎)分割出來的脊髓制備分離的細(xì)胞。在多鳥氨酸涂覆的塑料組織培養(yǎng)皿上，在補(bǔ)充了0.05％牛血清白蛋白(BSA)的無血清N2介質(zhì)(Bottenstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1979，76，514-517)中，以6×105細(xì)胞/cm2進(jìn)行平板培養(yǎng)。培養(yǎng)物在37℃，于潮濕的5％CO2/95％空氣氣氛中孵化48小時。2天后，用改進(jìn)的Fonnum方法(Fonnum，Neurochem.，1975，24，407-409)，按照McManaman等人和Glicksman等人的方法(McManaman等人，Develop.Biol.，1988，125，311-320；Glicksman等人，J.Neurochem..見上文)，進(jìn)行ChAT活性的體外測定。
實(shí)施例所述式II化合物列于表2，其中R1、R4、R6和R7是H；Y是O；和n是1。
表2

實(shí)施例13pCDNA-3-EE-MLK3，pcDNA3-EE-MLK(K144R)MLK3如文獻(xiàn)所述克隆(Lee等人，Oncogene，1993，8，3403-3410；Ezoc等人，Oncogene.1994，9，935-938)。由200ng聚腺苷酸鹽黑素細(xì)胞mRNA制備cDNA，用5％反應(yīng)液作為擴(kuò)增PTK cDNAs所有組成成分的模板，使用由保存的下述PTKs的VIb和IX子域的共有序列衍生的2或4種高簡并的寡核苷酸引物PTK1，5′-CGGATCCACMGIGAYYT-3′(SEQ ID NO1)；PTK2，5′-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3′(SEQ ID NO2)；PTK3，5′-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3′(SEQ ID NO3)；PTK4，5′-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3′(SEQ ID NO4)。用Taq DNA聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer/Cetus)和DNA自動熱循環(huán)物，使PCR進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)在94℃進(jìn)行40秒，在37℃進(jìn)行2分鐘，和在63℃進(jìn)行3分鐘。將8種PCRs產(chǎn)物置于池中，用DNA聚合酶(Kienow)處理，用BamH1加上EcoR1分離以及在5％聚丙酰胺凝膠中進(jìn)行電泳操作。溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色鑒定出占優(yōu)勢的200-230bp帶，將其酶切開、洗滌和克隆到M13mp18。在一實(shí)施方案中，不把部分PCR擴(kuò)增的cDNA分開，而是直接克隆到用Smal分開的M13mp18。用鏈-終止的測序方法測定核苷酸序列。
鑒定為PTK1的一種cDNA可用作探針，以篩選人體黑色素瘤和黑素細(xì)胞cDNA文庫。定義為PTK1-3.2的克隆體，包括2541n完全開放的讀框，847個氨基酸編碼。此cDNA用Ncol酶切開，用DNA聚合酶(Kienow)鈍化，再用EcoR1酶切開和載體pCDNA3-EE連接，以BamH1酶切開，鈍化和用EcoR1酶切。通過在HindIII/BamH1位點(diǎn)插入寡核苷酸構(gòu)成載體PCDNA3-EE，寡核苷酸編碼起始密碼子隨后是EE抗原表位，MEEEEYMPME(SEQ ID NO5)(Grussenmeyer，等人，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1985，82，7952-7954)。應(yīng)用以前已經(jīng)公開的方法(Chen等人，Biotechniques，1994，17，657-59)，通過用PCR制備K144R突變體來制備MLK3的激酶死亡模型。第一種誘導(dǎo)有機(jī)體突變的寡核苷酸是5′-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3′(SEQ ID NO6)，以及第二種寡核苷酸是5′-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3′(SEQ ID NO7)。用MLK3作為模板，這些寡核苷酸被用于PCR，以產(chǎn)生806堿基對片段，在第二PCR反應(yīng)中使用T7引物作為其它擴(kuò)增引物，用MLK3作為模板可產(chǎn)生1285堿基對片段。用瓊脂糖凝膠電泳分離片段，克隆至pGEM-5(Promega)和測序。所述片段以HindIII和Hpal酶切開，并插入到用HindIII和HpaI切開的pCADA3-EE-MLK3。在核苷酸1342測出另外的點(diǎn)突變。為了進(jìn)行校正，由野生型MLK3上酶切下Pf1M1片段(nt 1093-1418)，并用來代替KI44R突變的MLK3片段。
實(shí)施例14pFB-FLAG-MLK3為了得到MLK3蛋白，將cDNA克隆成為桿狀病毒表達(dá)的載體pFB-FLAG。通過用Nco 1消化由PTK1-3.2上酶切下MLK3，用DNA聚合酶(Kienow)鈍化，再用Not1酶酶切，和用Stul和Noti消化的pFB-FLAG連接。pFB-FLAG由pFB衍生而來(Life Technologies)，并具有FLAG表位編碼序列(Hopp等人，Biotechnology，1988，6，1205-1210)，起始密碼子是MDYKDDDDK(SEQ D NO8)，再加上在BamH1位點(diǎn)的多接頭。
實(shí)施例15pFB-GST-MLK3(KD)用EcoR1和Xho1由pGEXKG-MLK3(KD)上酶切下MLK3片段得到MLK3激酶區(qū)的桿狀病毒表達(dá)，并使其和用EcoR1和Xho1酶切下的pFB載體結(jié)合，其中谷光甘肽5-轉(zhuǎn)移酶(GST)的編碼序列被向上游克隆。這可用載體為模板，通過得到GST的編碼序列和用PCR，由pGEXKG載體的多接頭來實(shí)現(xiàn)(Guan等人，Anal.Bioch.，1991，192，262-267)。為得到PCR，5′寡核苷酸可制成在片段的5′端基為Bg12的限制酶酶切位點(diǎn)。然后，將此分離的片段用Bg12和HinD3消化，并和用BamH1及HinD3消化的pFB連接。
實(shí)施例16pGEXKG-MLK3(KD)通過用PTK1 cDNA的PCR，可以得到包括有MLK3激酶區(qū)和有部分亮氨酸拉鏈(nt 736-1791)兩部分的cDNA片段。分離的片段用限制酶EcoR1和Xho1消化，位點(diǎn)包括在PCR寡核苷酸中，和克隆至用EcoR1和Xho1消化的pGEX-KG。然后將在pGEX-KG上的此片段用PCR縮短，以便只含有激酶區(qū)(nt 736-1638)。
實(shí)施例17pKH3-MLK3，pKH3-MLK3(KA)用簡并的PCR克隆MLK2(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710；Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500)。在上皮腫瘤細(xì)胞系Colo16中表達(dá)的cDNAs編碼催化的蛋白激酶子域片段由RNA被反轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增。在對表皮生長因子受體家族激酶催化的區(qū)域的子域Vib和VIII中基序序列編碼中是以簡并的PCR引物為基礎(chǔ)。引物的序列如下前引物5′-CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT(CG)G(A)ACC(T)T-3′(SEQ ID NO9)，反轉(zhuǎn)引物5′-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3′(SEQ ID NO10)。將幾種PCR產(chǎn)物克隆為M13和用T7 Super-Base測序試劑盒(Bresatec)測序。用一216-堿基對PCR產(chǎn)物作為探針以篩選人體克隆λgt11 cDNA文庫(Clontech，catalog #HL 10346)。將片段隨機(jī)標(biāo)號，在65℃雜化，和在65℃洗滌過濾器至stringency 0.2X NaCl/檸檬酸鹽(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.5％SDS。過濾器在-70℃用Kodak XAR-5膠片放射能照像16小時。分離4種克隆產(chǎn)品，在相同的條件下最長的1.2kb用作同一文庫的反探針(reprobe)。對4個更長的克隆體進(jìn)行選擇，其中之一表示為MLK3的1034bp片段。此克隆體用作人腦λgt11文庫的探針。差不多篩選了500,000克隆體，并分離出一3454bp的克隆體，代表MLK2的整個編碼區(qū)。
由ATG至polyA尾，用2個步驟，將MLK2克隆至BamH1和EcoR1位點(diǎn)之間的載體pKH3，在MLK2序列的中間有BamH1。插入3份HA抗原表位標(biāo)記構(gòu)建載體pKH3，接著在pRK7多接頭的Xbal和EcoR1之間插入BamH1。為了制成誘導(dǎo)有機(jī)體突變的物質(zhì)的模型，MLK2 5′BainH1片段K125A被克隆為Promega pAlter載體，并按生產(chǎn)者所推薦的方法使之突變。然后把片段克隆回到MLK2 pKH3載體。
實(shí)施例18pcDNA3-HA-JNK1如(Coso等人，Cell，1995，81，1137-1146)所述可得到JNKI cDNA。用人體骨骼肌cDNA(Invitrogen)模板，通過PCR得到cDNA，它可被克隆成為pcDNA3-HA的Bg12/Sal1位點(diǎn)，是一種改性的pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒編碼HA表位(Wilson等人，Cell，1984，37，767-778)。然后由包括HA表位的pcDNA3上酶切，并引入pGEX-4T3(Pharmacia)。由構(gòu)建成Bg12/Sal1片段的pGEX-4T3上酶切得到JNK1 cDNA，并引入pcDNA3-HA，帶有HA表位的載體加在pcDNA3-HA的HinD3/BamH1位點(diǎn)。
實(shí)施例19pFLAG-DLK如(Holzman等人，J.BioL Chem.，1994，269，30808-30817)所述將DLK克隆為帶FLAG表位的表達(dá)載體pcDNA3。用簡并寡核苷酸-基PCR克隆法分離DLK的cDNA片斷。按照制造者(TRIzol Reagent，LifeTechnologies，Inc.)的指示用常規(guī)的制備酚/異硫氰酸胍試劑的方法由13.5天胚胎的腎(32個器官)和17.3天胚胎的腎(16個器官)萃取得到總RNA。在用無DN酶的RN酶消化后，總RNA用RNA酶H-反轉(zhuǎn)錄酶(Superscript，Life Technologies，Inc.)從寡核苷酸(dT)合成寡核苷酸引物反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶催化的子域Vib和IX相應(yīng)的，簡并寡核苷酸引物最先由Wilks提出(Wilks，Proc Nad AcadSci USA.，1989，86，1603-1607)，將其改性為5′EcoR1和HindIll位點(diǎn)，分別為(5′-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3′(SEQ ID NO11)，5′-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3′)(SEQ ID 25 NO12)。在94℃，1.5分鐘，37℃，2分鐘，63℃，3分鐘可進(jìn)行40個PCR循環(huán)。加入新鮮試劑，在72℃最后延長的10分鐘之前，再完成40個循環(huán)。得到的200-210-bp DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行硅膠分離，亞克隆為制備的pGEM7zf(+)質(zhì)粒(Promega)，并變換成大腸桿菌(Escherichia coli)。小量制備的DNA質(zhì)?？捎杀蛔儞Q的細(xì)菌制備，和用EcoRI和HindIII限制核酸內(nèi)切酶部分消化；對含有插入體的克隆體進(jìn)行測序。
將由簡并的PVR得到的195-bp DLK cDNA片段進(jìn)行放射性標(biāo)記，并用于篩選差不多1×106Uni-ZAP II重組體(Stratagene，LaJolla，CA)，寡核苷酸(dT)-引導(dǎo)的抗原的成年小鼠腦cDNA文庫(Holzman等人，Mol Cell Biol，1990，10，5830-5838)。42℃下，過濾器在含有50％甲酰胺、5xSSC、3xDenhardt′s溶液、0.25％SDS，1mg/ml聚腺苷二磷酸和200mg/ml鮭魚精子DNA的緩沖溶液中雜化，并于室溫下用2xSSC，0.2％SDS洗滌一次，于65℃以同樣的溶液在30分鐘內(nèi)洗滌二次。鑒定出25個獨(dú)特的克隆體，按照制造者的方法和限制性內(nèi)切酶圖進(jìn)行體內(nèi)酶切，將10個克隆體純化為同質(zhì)性。對兩種最長的克隆體(分別為3401和3397bp，，其差別僅在于5′末端)沿著其全長的鏈測序。
將全長的NotI-Xho1 DLK cDNA片段(3401bp)亞克隆為巨細(xì)胞病毒促進(jìn)劑為基的真核生物表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，CA)(注冊為pcDNA3-DLK的構(gòu)成)。下一步，制備標(biāo)記的NH4-Met FLAG表位(DYKDDDDK)(SEQ ID NO13)構(gòu)成(pFLAG-DLK)。用PCR擴(kuò)增cDNA片段，該片段編碼5′HindIII表位，DLK′s Kozak′s共有序列，其中包括有由核苷酸88擴(kuò)展到核苷酸758 EcoRI的內(nèi)表位的啟動子ATG、FLAG表位和DLKcDNA可讀框序列。(以等量使用的HPLC純化合成寡核苷酸對FLAG構(gòu)成有義引物而言為5′-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3′(SEQ ID NO14)，對反義引物而言為5′-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3′(SEQ IDNO15))。凝膠純化的HindIII和EcoR1消化擴(kuò)增的片段經(jīng)亞克隆成為HindIII-EcoR1，以制備pcDNA3-DLK質(zhì)粒。沿雙鏈對構(gòu)成測序，以確認(rèn)Taq聚合酶的精確度和保持可讀框。
實(shí)施例20pcDNA3-MLK1由EST數(shù)據(jù)庫(注冊號# AA 160611)得到MLK1的5’部分。該克隆體是MLK1和其它未知同一性的cDNA的融合體。它含有以前沒有公布的MLK1的5′序列，所述的MLK1伴隨有以前公布的MLK1激酶區(qū)(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。來自EST克隆體的MLK1 cDNA序列如下GAATTCGGCACGAGAGGACTCGCAGGTGTC CGGCGACGAG GGCTGGTGGA CCGGGCAGCT GAACCAGCGGCTGGGCATCT TCCCCAGCAA CTACGTGACC CCGCGCAGCG CCTTCTCCAGCCGCTGCCAG CCCGGCGGCG AGGACCCCAG TTGCTACCCG CCCATTCAGTTGTTAGAAAT TGATTTTGCG GAGCTCACCT TGGAAGAGAT TATTGGCATCGGGGGCTTTG GGAAGGTCTA TCGTGCTITC TGGATAGGGG ATGAGGTTGCTGTGAAAGCA GCTCGCCACG ACCCTGATGA GGACATCAGC CAGACCATAGAGAATGTTCG CCAAGAGGCC AAGCTCTTCG CCATGCTGAA GCACCCCAACATCATTGCCC TAAGAGGGGT ATGTCTGAAG GAGCCCAACC TCTGCTTGGTCATGGAGTTT GCTCGTGGAG GACCTTTGAA TAGAGTGTTA TCTGGGAAAAGGATTCCCCC AGACATCCTG GTGAATTGGG CTGTGCAGAT TGCCAGAGGGATGAACTACT TACATGATGA GGCAATTGTT CCCATCATCC ACCGCGACCTTAAGTCCAGC AAC(SEQ ID NO16).它譯成為NSAREDSQVSGDEGWWTGQL NQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEIDFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA VKAARHDPDE DISQTIENVRQEAKLFAMLK HPNIIALRGV CLKEPNLCLV MEFARGGPLN RVLSGKRIPPDILVNWAVQI ARGMNYLHDE AIVPIIHRDL KSSN(SEQ ID NO17)。
如以前所公開的，MLK1的3’部分最初可被簡并PCR克隆(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。上文描述了將MLK1的3’部分克隆為MLK2的方法，除了下述例外。由具有1.2kb克隆體文庫的再篩選中得到的四個克隆體中有三個被表示為MLK1。沒有包括整個激酶區(qū)的克隆體可由PCR獲得。
由每等份1ml的擴(kuò)增文庫得到的噬菌體(在1Uni-ZAPXR(Stratagene，cat #937204)正常人體結(jié)腸上皮和人體T84結(jié)腸癌細(xì)胞系cDNA)通過懸浮于20ml水溶解，并快速冷凍。在每一文庫的兩個反應(yīng)中均使用5ml溶解了噬菌體的樣品作為PCR模板。由核苷酸序列側(cè)區(qū)克隆位點(diǎn)得到代表載體的引物。在T84結(jié)腸癌細(xì)胞系文庫中，使用T3和T7序列的引物(Promega)。在各個反應(yīng)中，一個引物取自基因的3′-5′鏈，由已知序列的5’端起在100bp左右。第二個引物是兩個載體引物中的一個。在總量50ml中，PCR反應(yīng)物含有1XPCR緩沖溶液、2.5mM氯化鎂、1U Taq聚合酶(都購自Bresatec)、0.2mMdNTP和0.4mM各種引物。反應(yīng)條件是在95℃60秒，52℃90秒和在72℃90秒進(jìn)行30個循環(huán)，在最后一個循環(huán)中時間擴(kuò)展到15分鐘。如上所述克隆PCR產(chǎn)物并測序。從文庫中篩選出的最長的克隆體和含有附加MLK1序列的PCR片段結(jié)合在一起形成pUCI18的1.08kbMLKI cDNA。
來自EST數(shù)據(jù)庫的MLK1克隆體可在載體pBluescript 10(Stratagene)中獲得。來自結(jié)腸文庫的MLK1 cDNA結(jié)合成為EST克隆體，這是通過將前者用EcoR1消化，用Kienow鈍化，用AflII酶切。將此分離的片段克隆成為來自EST數(shù)據(jù)庫的，用Xhol酶切，Kienow鈍化，用AflII酶切的MLK1 cDNA。由pBluescript酶切得到的新構(gòu)成用Notl和Apal消化，并結(jié)合到用Notl和Apal酶切的pcDNA3-EE中。所有克隆的結(jié)合物進(jìn)行序列檢測。
實(shí)施例21GST-MLKKDD的E.coli表達(dá)通過電穿孔將PGEXKG-MLK3(KD)轉(zhuǎn)變?yōu)镋.coli菌株BL12。將含有質(zhì)粒的細(xì)菌在15升Applikon發(fā)酵罐(fermenter)中于10升體積下述介質(zhì)中接種1.95g/L K2HPO4、0.9g/L KH2PO4、0.1g/L氨芐青霉素、0.3g/L(NH4)2SO4、0.92g/L MgSO4·7H2O、42.7mg/L檸檬酸鈉、21.8mg/L FeSO4·7H2O、0.5ml畢赤酵母屬痕量金屬(Higgins等人，Methods Molecular Biology，1998，103，149-177)、20g/酪蛋白氨基酸、40g/L甘油、25.5mg/L CaCl2。細(xì)菌在800rpm/68％溶解氧/30℃生長過夜，直到培養(yǎng)物達(dá)到OD600＝4.4。重組蛋白質(zhì)的生成由加入1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)，在25℃連續(xù)發(fā)酵達(dá)6小時。然后，離心回收細(xì)菌，細(xì)胞糊在-20℃冷凍儲存直至純化。
實(shí)施例22細(xì)菌GST-MLK3KD的純化在100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM二硫蘇糖醇(DTT)，pH7.5(緩沖液A)中超聲處理100gm細(xì)菌糊可制備部分純化的GST-MLK3KD。所述溶液用1％Triton X-100制備，然后在冰中攪拌1小時。在20,000xg離心45分鐘后，在冰中將澄清的溶液和以緩沖液A平衡的10ml谷光甘肽瓊脂糖凝膠4B樹脂(Pharmacia)混合1小時。壓成片的樹脂用12.5x體積的緩沖液A洗滌二次，然后用20mL 100mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT(緩沖液B)洗脫，緩沖液B中含有20mM谷光甘肽，pH為7.5。蛋白質(zhì)用緩沖液B透析，并以多份于-80℃儲存。
實(shí)施例23FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的桿狀病毒群表達(dá)用BAC-TO-BAC系統(tǒng)(Life Technologies)，按照手冊的指示，表達(dá)FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的重組體桿狀病毒群由它們各自的轉(zhuǎn)移載體pFB-FLAG-MLK3和pFB-GST-MLK3KD生成。Sf21細(xì)胞(Vaughn等人，In Vitro，1977，13，213-217)的懸浮培養(yǎng)物在27℃/120rpm，和在補(bǔ)充的Grace介質(zhì)(Hink，Nature，1970，226，466-467)中，與10％熱失活的胎兒牛血清(FBS)一起培養(yǎng)。為了生成重組體FLAG-MLK3，使細(xì)胞密度1.5×106細(xì)胞/ml補(bǔ)充的Grace介質(zhì)的Sf21細(xì)胞多次重復(fù)感染3.1(MOI)，介質(zhì)中含有5％FBS，在感染39小時后收獲。為了得到重組GST-MLK3KD，使細(xì)胞密度1.5×106細(xì)胞/ml補(bǔ)充的Grace介質(zhì)的Sf21細(xì)胞多次重復(fù)轉(zhuǎn)染2(MOI)，介質(zhì)中含有5％FBS，在轉(zhuǎn)染41小時后收獲。在兩種情況下，見壓成片的細(xì)胞再懸浮于含有10mMHEPES，50mM NaCl，0.5mM Pefabloc SC，5μM胃酶抑素，10μg/mL抗蛋白酶肽和10μg/ml白胃素的緩沖液，pH7.4。在147,000xg離心1小時后，用3M Tris堿調(diào)整上清液溶液的pH為7.4，在純化前于-70℃儲存。
實(shí)施例24桿狀病毒群GST-MLK3KD的純化部分純化的桿狀病毒群GST-MLK3KD由谷光甘肽親和色譜制備。就10ml細(xì)胞萃取液(26.6mg總蛋白)而言，需要加入在10mMHEPES、150mM NaCl，pH7.4(緩沖液C)平衡的1ml谷光甘肽瓊脂糖凝膠4B樹脂(Pharmacia)，使蛋白在4℃結(jié)合45分鐘。然后在柱中以30倍柱體積的緩沖液C洗滌樹脂，以5倍柱體積的，含有20mM谷光甘肽的緩沖液C洗脫。把匯集的最終產(chǎn)物用緩沖液C透析，并以多份于-70℃儲存。
實(shí)施例25桿狀病毒群FLAG-MLK3的純化部分純化的桿狀病毒群FLAG-MLK3用抗體親和色譜制備。15mL萃取液的蛋白(19.5mg總蛋白)和0.1M NaCl在0.25ml柱中結(jié)合，所述的柱為與瓊脂糖樹脂(Sigma)偶合的M2單克隆FLAG肽抗體，該柱需要重復(fù)負(fù)載(共三次)。在進(jìn)行色譜層析之前，樹脂用5倍柱體積的50mM Tris-HCI、150mM NaCl，pH7.4(TBS)洗滌平衡，和用3倍柱體積的0.1M甘氨酸(pH3.5)，接著用另外5倍柱體積的TBS洗滌。重組體蛋白主要由5倍柱體積的0.2mM FLAG肽(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)(SEQ ID NO18)TBS的溶液洗脫。試驗(yàn)前以多份于-80℃儲存。
實(shí)施例26顯性負(fù)性突變體在不同的PC12細(xì)胞除去神經(jīng)生長因子后，MLK家族區(qū)組死亡的顯性負(fù)性突變體由大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤腫瘤衍生的PC12細(xì)胞廣泛用于測定導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的分子行為的神經(jīng)元細(xì)胞模型(參見綜述Troy等人，Adv.Neurology，1997，103-111)。神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞分化成交感神經(jīng)神經(jīng)元表型(Greene，Cell BioL，1978，78，747-755)。在由培養(yǎng)介質(zhì)中移動出NGF后，NGF分化的PC-12細(xì)胞的存活依賴于NGF和經(jīng)歷形態(tài)學(xué)描述的編程性細(xì)胞死亡。為了測定NGF排出后各種混合譜系激酶家族對PC-12細(xì)胞死亡的作用，給細(xì)胞系統(tǒng)顯影。PC-12細(xì)胞用cDNA編碼的MLK-3顯性負(fù)性(DN)突變體轉(zhuǎn)染，制造者推薦使用Pfx脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用G418硫酸鹽(Mediatech Inc.，Henidon，VA)選擇轉(zhuǎn)染體表達(dá)DN-MLK-3的穩(wěn)定池。在該池中30％左右的細(xì)胞表達(dá)了用免疫組織化學(xué)法測定的DNMLK3。細(xì)胞池穩(wěn)定的表達(dá)的突變激酶在多鳥氨酸/層粘連蛋白(在磷酸鹽緩沖鹽水中每個為10μg/ml)涂覆的組織培養(yǎng)96穴培養(yǎng)板上鋪板，密度為2×104細(xì)胞/穴，并用100ng/ml NGF處理7天。除去含有NGF的介質(zhì)，細(xì)胞單層用磷酸鹽緩沖液和含有中和抗體(cat.#N6655；Sigma，St.Louis，MO)的介質(zhì)洗滌，最后以1∶1000稀釋替代1-5天。用細(xì)胞生存試驗(yàn)定量測定細(xì)胞的生存能力，如制造者(Promega，Madison，WI)所推薦的，使用四唑鹽，MTS轉(zhuǎn)化成染色的甲(formazan)，它可用CytoFluor 2350(Millipore，Bedford，MA)儀器上，于570nm讀出吸收值。穩(wěn)定池中表達(dá)的DN-MLK-3可部分救活由于NGF排出造成的細(xì)胞死亡(圖10)。
實(shí)施例27重組體MLK蛋白的酶活性試驗(yàn)為了顯示以桿狀病毒群或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的MLK蛋白具有酶活性，可采用幾種試驗(yàn)方式。MLK蛋白可以是全長構(gòu)成或是以桿狀病毒群或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的激酶區(qū)。試驗(yàn)可以抗體為基礎(chǔ)，例如酶連接的免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，時間分辨熒光免疫測定法(ThF)或熒光偏振(FP)?？贵w可以是對磷絲氨酸、磷蘇氨酸或磷-特異性基質(zhì)具有活性的單克隆的或多克隆抗體。另外，也可以使用非-抗體為基礎(chǔ)的方法，例如放射性-膠基試驗(yàn)(見圖11)、多篩選三氯乙酸(TCA)沉淀試驗(yàn)(見圖13)、閃爍親近試驗(yàn)(SPA)、快速板層析法或磷酸纖維素過濾試驗(yàn)法(phosphocellulose filter assay format)(見圖13)。設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以控制基質(zhì)的直接磷酸化或在形成信號的途徑中用下游激酶控制偶合試驗(yàn)系統(tǒng)。所述的基質(zhì)可以是特異性的基質(zhì)，如SEK-1，或是相對非特異性的基質(zhì)如髓磷脂堿性蛋白(MBP)。
實(shí)施例28激酶試驗(yàn)(1)放射性膠-基激酶試驗(yàn)(Radioactive Gel-Based Kinase Assay)
MLX-3激酶活性通過控制[γ-32P]-ATP的32p與MLK基質(zhì)的結(jié)合(如死亡激酶SEK-1；髓磷脂堿性蛋白)。50μl試驗(yàn)混合物含有緩沖液A(20mM MOPS，pH7.2，25mM β-甘油磷酸酯，5mM EGTA，1mM原釩酸鈉，1mM二硫代蘇糖醇)、15mM MgCl2、100μMATP，10μCi[γ-32P]-ATP和0.1μg死亡激酶SEK-1基質(zhì)(Stressgen，Inc；由帶有10mM谷光甘肽，pH8.0的谷光甘肽-瓊脂糖串釋放出結(jié)合的谷光甘肽5-轉(zhuǎn)移酶-SEK-1(GST-SEK-1))或25μg MBP(SigmaChemical Co.)。通過加入MLK蛋白(激酶區(qū)或含有全長和激酶區(qū)兩者的制劑)或控制蛋白質(zhì)開始反應(yīng)?；旌衔镉?0℃孵化30分鐘。反應(yīng)最后加入2x還原樣品的緩沖液。使混合物沸騰5分鐘，負(fù)載于12％SDS-PAGE凝膠(以MBP為基質(zhì))或8％凝膠(SEK-1)。電泳后，干燥凝膠。對結(jié)合基質(zhì)SEK-1的磷酸鹽定量，試驗(yàn)在Molecular DynamicsPhosphorimager(Sunnyvale，CA)上進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果說明桿狀病毒群表達(dá)MLK-3(FLAG-標(biāo)記的全長或GST-標(biāo)記的激酶區(qū))具有酶活性，以死亡激酶GST-SEK-1或MBP為基質(zhì)的活性如圖11A和11B所示。
(2)蛋白質(zhì)印跡分析桿狀病毒群表達(dá)MLK-3的激酶活性通過免疫印跡法進(jìn)行分析。20μl試驗(yàn)混合物含有緩沖液A，15mM Mgcl2，100μM ATP和0.1μg死亡激酶SEK-1基質(zhì)。使反應(yīng)于30℃進(jìn)行30分鐘，然后用10μl4x還原樣品的緩沖液使反應(yīng)停止。在8％Tris-甘氨酸凝膠上分離蛋白質(zhì)，并用電泳法轉(zhuǎn)移至固定PVDF膜。所述膜與磷-特異性的SEK-1(Thr223)抗體(New England Biolabs，Inc.)一起孵化，接著加入用標(biāo)記了山羊抗-兔IgG(Bio-Rad)的辣根過氧化物酶。免疫活性帶的測定是通過化學(xué)熒光(Amersham)的增加來測定。死亡激酶GST-SEK-1由FLAG-MLK-3蛋白(含有全長和激酶區(qū)的桿狀病毒群制劑)磷酸化在圖12說明。
(3)多篩選三氯乙酸(TCA)沉淀試驗(yàn)細(xì)菌表達(dá)GST-MLK3激酶區(qū)的激酶活性用Pitt等人，J.Biomol.Screening，1996，1，47-51所述的Millipore Multiscreen三氯乙酸(CA)″in-plateTM試驗(yàn)方法評價。試驗(yàn)在96穴Multiscreen Durapore板(Millipore)上進(jìn)行。每一50-μl試驗(yàn)混合物含有20mM Hepes，pH7.4，20mM MgCl2，20mM MgCl2，2mM DTT，0.1mM Na3VO4，1μCi[γ-32P]ATP和30μg MBP基質(zhì)。加入MLK蛋白使反應(yīng)開始，并使反應(yīng)于37℃進(jìn)行15分鐘。加入25μl 50％TCA使反應(yīng)停止。將所述的板于4℃平衡30分鐘，然后用冰冷卻的25％TCA洗滌。在板上加入閃爍的混合物，并用Wallac MicroBeta 1450 PLUS閃爍計(jì)數(shù)器測定其放射性。蛋白質(zhì)的劑量響應(yīng)與32P-標(biāo)記MBP的關(guān)系如圖13所示。
(4)磷酸纖維素過濾試驗(yàn)激酶試驗(yàn)在50-μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，該混合物含有20mMHepes，pH7.4，20mM MgCl2，20mM MnCl2，2mM DTT，0.1mMNa3VO4，IμCi[γ-32P]ATP和30μg MBP。加入MLK蛋白使反應(yīng)開始，并使反應(yīng)于37℃進(jìn)行15分鐘。加入75μl 75mM磷酸使反應(yīng)停止。將停止反應(yīng)的等份溶液直接負(fù)載于磷酸纖維素膜(Pierce)。另外，可使用96穴磷酸纖維素多篩選板(MiIlipore)。所述膜用75mM H3PO4洗滌。加入1M氫氧化鈉洗脫出結(jié)合的32P-標(biāo)記的磷酸化的MBP，收集在收集管中。用Beckman閃爍計(jì)數(shù)器(Somerset，NJ)通過Cerenkov計(jì)數(shù)測定放射活性。隨著細(xì)菌表達(dá)GST-MLK-3激酶區(qū)濃度的增加形成磷酸化的MBP，結(jié)果如圖13所示。
實(shí)施例29測定化合物和重組體MLK家族結(jié)合的試驗(yàn)K-252a(化合物III-3；見表4)，Nocardia物種的吲哚并咔唑代謝物，與多種絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶結(jié)合(Angeles等人，AnaLBiochem，1996，236，49-55；Knight等人，AnaL Biochem.，1997，247，376-381)。用氚化的K-252a配體評價與人體重組體全長MLK-3的結(jié)合，所述MLK-3來自桿狀病毒群感染細(xì)胞粗制劑。通過NEN研究產(chǎn)物(Billerica，MA)感染在[3H]K-252a的3-和9-位用氚標(biāo)記，并具有40Ci/mmol的特定活性。結(jié)合試驗(yàn)在96穴板上于1ml試劑中進(jìn)行。反應(yīng)混合物含有50mM MOPS緩沖液，pH7，150mM NaCl，5mMMnCl2，1mg/ml BSA，1％DMSO和0.25nM[3H]K252a。以5μg/ml濃度的粗制桿狀病毒群衍生MLK-3進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。非特異性結(jié)合在未標(biāo)記的1.2μM[3H]K252a存在下鑒定，并由總的特異性結(jié)合中減去?？偭康?2-15％稀釋對蛋白質(zhì)是非特異性結(jié)合，總量的75-85％對MLK-3為特異性結(jié)合(圖14)。所有的試驗(yàn)在4℃進(jìn)行2小時。使用Brandel收集器，在GF/C Whatman過濾器上收集[3H]K252a/MLK-3復(fù)合物，用冷的MOPS/NaCl緩沖液洗滌，并在Wallac Micro Beta計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。進(jìn)行飽和結(jié)合試驗(yàn)以得到K-252a的Kd。這些試驗(yàn)中的一個實(shí)施例如圖14所示，得到的Kd值為0.89nM(置信界限0.2-1.5nM)。
實(shí)施例30完整細(xì)胞試驗(yàn)(A)Cos7過表達(dá)系統(tǒng)材料K-252a和此化合物的衍生物由Kyowa-Hakko Kogyo Co.Ltd.(Tokyo，Japan)(Kaneko等人，1997)提供。將化合物溶解于細(xì)胞培養(yǎng)級的二甲亞砜(DMSO)，儲存于4℃，黑暗中?；衔锏乃邢♂屢涸贒ulbecco改性的Eagle介質(zhì)(DMEM)中進(jìn)行，其中含有1％牛血清白蛋白。紅血球凝聚素(HA)抗體購自BAbCO(Richmond，CA)。AP-l(c-jun)基質(zhì)購自Promega(Madison，WI)。[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol)購自Amersham(Arlington Heights，IL)。
Cos7細(xì)胞培養(yǎng)Green Monkey Kidney Cos7細(xì)胞由ATCC，Rockville，Maryland(CRL 1651)得到，保存在DMEM中，其中含有10％牛血清，2mM谷酰胺，1mM丙酮酸鹽，50U/ml青霉素/鏈霉素，保存需要在37℃，10％CO2和90％空氣的氣氛中。加入0.25％胰蛋白酶分離Cos7細(xì)胞以傳代。
(I)MLK家族膜的過表達(dá)和Cos7細(xì)胞中的JNK1用提供者(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)推薦的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺制劑(lipofectamine)，將Cos7細(xì)胞以80％融合鋪板，和以每個cDNA構(gòu)成物2μg轉(zhuǎn)染。人體MLK-3，MLK-2或小鼠DLK的長cDNA或部分的人體MLK-1如上文所述，全長紅血球凝聚素A-標(biāo)記的人體JNK1由J.Silvio Gutkind(NIH，Bethesda，MD)善意地提供，將它們亞克隆為pcDNA載體(Invitrogen，San Diego，CA)。轉(zhuǎn)染48小時后，細(xì)胞用0.025％DMSO或500nM指定的化合物處理2小時，接著溶解在0.4ml Triton緩沖液(1％Triton X-100，50mM氯化鈉，10mM Tris(pH7.6)，0.1％牛血清白蛋白，30μM磷酸鈉，50mM氟化鈉，20μg/ml抑蛋白酶肽，1mM苯基甲基磺?；?，1mM釩酸鈉)中。溶解物中JNK的活性用上文所述免疫沉淀激酶試驗(yàn)測定。
(2)全細(xì)胞的免疫沉淀和激酶試驗(yàn)用Pierce(Rockford，IL)的Micro BCA藥盒，測定由Cos7細(xì)胞獲得的溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度，將等同量的蛋白質(zhì)與HA抗體于4℃免疫沉淀1小時。用微型離心機(jī)離心20秒，再懸浮于Triton緩沖液離心洗滌2次以上，最后以激酶緩沖液洗滌(20mM Hepes pH7.4，20mMMgCl2，2mM二硫代蘇糖醇，0.1mM釩酸鈉)。將免疫沉淀再懸浮于激酶緩沖液，該緩沖液含有1μM ATP和5μCi[γ-32P]ATP和基質(zhì)(1μg/AP-1樣品)，于30℃孵化15分鐘。通過加入還原樣品的緩沖液(Laemmli，Nature 1970227；680-685)停止反應(yīng)。樣品于80℃加熱5分鐘，負(fù)載于10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠。用電泳分離蛋白質(zhì)。干燥凝膠，用Molecular Dynamics Phosphorimager(Sunnyvale，Ca.)，在AP-1基質(zhì)上對放射性進(jìn)行定量分析，試驗(yàn)結(jié)果見圖15A和15B，該試驗(yàn)中MLK-3，MLK-2和DLK與HA-JNK1共表達(dá)，以及在有或沒有K-252a的情況下孵化。與此相反，命名為化合物-3(見表4)的母體K-252a化合物衍生物是選擇性更好的激酶抑制劑，不受其他JNK上游MAPKKK，MEKK1活化的JNK途徑的干擾(圖15C)。
(B)JNK活化的MIK的全細(xì)胞報道試驗(yàn)用衍生的克隆體組成型表達(dá)MLK家族的嘗試沒有成功，MLK的過表達(dá)可能影響細(xì)胞的存活(Bergeron等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，231，153-1SS；Nagata等人，EMBO J.，1998，17，149-158)。因此，在誘導(dǎo)生物化學(xué)作用的跟蹤MLK的顯影全細(xì)胞試驗(yàn)中，可能需要含有感興趣的激酶的基因工程形成的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。例如，用反式激活蛋白控制的四環(huán)素轉(zhuǎn)染的PC-12細(xì)胞系。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步被感興趣的基因轉(zhuǎn)染時，基因的表達(dá)被介質(zhì)中的四環(huán)素嚴(yán)格控制(Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6522)，所述的基因是由誘導(dǎo)型的啟動子衍生的。
為了對MLK的活性定量，一種方法是在上文所述多次重復(fù)試驗(yàn)方法中測量下游基質(zhì)如MEK4，JNK或c-jun的磷酸化。另一在全細(xì)胞中定量MLK活性的方法是利用報道基因酶活性，所述的酶例如可以是c-jun熒光素酶報道基因系統(tǒng)，可通過PathDetectTM系統(tǒng)(Stratagene，LaJolla，CA)購買。在此系統(tǒng)中，四環(huán)素誘導(dǎo)的細(xì)胞系是由兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的。一種質(zhì)粒組成型地表達(dá)了cJun NH2-端基的反式激活區(qū)與酵母GAL4 DNA結(jié)合區(qū)的融合(cjun-DBD融合蛋白)。另一種質(zhì)粒帶有有熒光的熒光素酶的編碼序列，所述的酶是由GAL4結(jié)合位點(diǎn)的5個串聯(lián)重復(fù)部分衍生的。根據(jù)MIK的活性，JNK、cJun-DBD融合蛋白的下游基質(zhì)是被磷酸化的，鍵合于GAL4結(jié)合位點(diǎn)，并誘導(dǎo)熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄。加入其基質(zhì)就很容易進(jìn)行熒光素酶在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的試驗(yàn)(Promega，Madison，WI)和測定化學(xué)發(fā)光。
實(shí)施例31MLK家族成員對運(yùn)動神經(jīng)元的抑制和皮質(zhì)存活兩者的結(jié)合大鼠脊髓富集運(yùn)動神經(jīng)元培養(yǎng)物的存活由Sprague-Dawley大鼠胎兒分割出脊髓(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)，胚胎齡(E)14.5-15。從脊髓僅有的腹部部分，如前文所述(Henderson等人，1993)，通過用6.5％三碘苯甲酰氨基葡萄糖進(jìn)行梯度離心可進(jìn)一步富集運(yùn)動神經(jīng)元，以及通過用低親和力的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體抗體(IgG-192，Boehringer-Mannheim)進(jìn)行分析純化(數(shù)據(jù)未顯示)。將細(xì)胞接種在96穴板上，該板用以化學(xué)方法鑒定為無血清N-介質(zhì)(Bottenstein的人，1979.見前文)中的多鳥氨酸和層粘連蛋白(每穴5μg/ml)預(yù)涂，密度為6×104細(xì)胞/ml。為了由存活作用中分離出附著物，在附著期開始后1-3小時在培養(yǎng)物中加入化合物。4天后用鈣黃綠素AM(Molecular Probes，Eugene，OR)，以熒光測定生存能力(BozyczkO-Coyne等人，1993，同前)來評價存活的神經(jīng)元。用顯微鏡對相對熒光質(zhì)直接有關(guān)的神經(jīng)元計(jì)數(shù)。主要的是，培養(yǎng)介質(zhì)在DPBS中進(jìn)行系列稀釋(Dulbeccos磷酸鹽緩沖鹽水)，將最后濃度為6μM的鈣黃綠素AM儲備液加入96-穴板的每個穴。該板在37℃孵化30分鐘，接著用DPBS的下列稀釋液洗滌。用Millipore(Cytofluor 2350)的讀板熒光計(jì)對熒光信號讀數(shù)，激發(fā)波長＝485nm，放射波長＝538nm。對每板而言，只接受鈣黃綠素AM，但不含細(xì)胞而得到的平均本底由總數(shù)值中減去。在這些試驗(yàn)中，熒光信號于細(xì)胞密度范圍的線形關(guān)系隨濃度和孵化時間變化。在試驗(yàn)化合物以250nM存在時上述試驗(yàn)中運(yùn)動神經(jīng)元存活百分?jǐn)?shù)的實(shí)施例見表3。
皮質(zhì)神經(jīng)元的存活由18天大鼠胎兒的胚胎分割出大腦皮質(zhì)，酶消化后得到單一的腦分散液。所述細(xì)胞在含有B27補(bǔ)充材料的無血清Neural BasalMedium介質(zhì)中，接種在用多鳥氨酸和層粘連蛋白預(yù)涂的96穴組織培養(yǎng)板上，密度為1.56×105/cm2。培養(yǎng)板用PBS中的多鳥氨酸和層粘連蛋白(每穴8μg/ml)涂覆，在37℃至少為2小時。在離體5-7天后，在有或沒有試驗(yàn)化合物的情況下，使皮質(zhì)神經(jīng)元與Ab25-35(20μM)接觸。Ab2S-35(Sigma，SL Louis，MO)儲備溶液(1mM)在去離子無菌蒸餾水中制備。在后肽(post-peptide)加入后48小時測定神經(jīng)元的相對存活，用乳酸鹽脫氫酶(LDH)釋放作為質(zhì)粒膜完整性/細(xì)胞生存能力的指示物。根據(jù)制造者的說明書用Cytotoxicity Detection Kit(Boelrringer-Mannheim，Indianapolis，IN)測定LDH。數(shù)據(jù)以相對于只用Ab25-35處理的培養(yǎng)物而言，釋放LDH的抑制百分?jǐn)?shù)表示。
表3

1式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OH。
2式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；以及R是OH。
3式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
4式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；以及X是CH2。
實(shí)施例32在有或沒有吲哚并咔唑或稠合吡咯并咔唑類化合物存在下，運(yùn)動神經(jīng)元培養(yǎng)物中內(nèi)源JNK活性的免疫沉淀測定在16mm的穴中，以6×104細(xì)胞/cm2將純化的運(yùn)動神經(jīng)元鋪板。在處理之前使細(xì)胞附著2小時。將細(xì)胞用0.0125％DMSO或500nM化合物在前文所定義的N2介質(zhì)中進(jìn)行處理。然后用冰冷卻的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，接著溶于實(shí)施例30所述的0.4ml Triton緩沖液。對運(yùn)動神經(jīng)元培養(yǎng)物的溶解產(chǎn)物的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行歸一化處理，用購自SantaCruz Biotechnology(Santa Cniz，CA)的JNK1抗體(cat #sc-474)進(jìn)行免疫沉淀。在如上述32P-ATP和c-jun基質(zhì)存在下由免疫沉淀測定JNK的活性。將四種化合物的抑制活性與運(yùn)動神經(jīng)元和Cos7細(xì)胞過表達(dá)的DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3進(jìn)行比較(表3)。
實(shí)施例33最初的胚胎培養(yǎng)物中，誘導(dǎo)MLK的JNK活性的抑制作用在Cos7細(xì)胞和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性兩者中的相關(guān)性為了測定通過激酶(所述的激酶與神經(jīng)營養(yǎng)化合物相關(guān))調(diào)節(jié)的JNK途徑的抑制作用，可以評價化合物對Cos7細(xì)胞過表達(dá)的HA-JNK和MLK3中的JNK活性的作用。在轉(zhuǎn)染48小時后，將細(xì)胞與500nM的化合物一起孵化2小時，接著進(jìn)行細(xì)胞溶解。將溶解產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀試驗(yàn)，并如上文所述測定激酶活性。所報告的結(jié)果以對照樣品的抑制百分?jǐn)?shù)表示，所述的對照是在DMSO存在下的JNK活性。如表4中所看到的，對于脊髓和/或基本的前腦ChAT活性而言，大多數(shù)化合物具有活性，其趨勢是JNK的MLK-3活性的有效抑制劑。
表4Cos7細(xì)胞過表達(dá)MLK-3中吲哚并-和茚并-咔唑?qū)NK活性的影響

1式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-吡啶基)；以及R是OH。
2式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；以及R是OH。
3式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；以及R是OH。
4式I化合物，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；以及X是CH2。
5式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；以及X是CH2。
6式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
7式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；以及X是CH2。
8式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2OH；以及X是CH2。
9式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；以及X是CH2。
10式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；以及X是CH2。
11式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3；以及R是OH。
12式III化合物，其中Z1，Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；以及R是OH。
13式III化合物，其中Z1和Z2一起形成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；以及R是OH。
14式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；以及X是CH2。
15式III化合物，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是碘；X是CO2CH3；以及R是OH。
16式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OH。
17式III化合物，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；以及R是OH。
18式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH2CH2(2-噠嗪基)；以及X是CH2。
19式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
20式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OCH3。
21式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是(CH2)3-NH-C(＝O)-3，5-二羥基苯基；以及X是CH2。
22式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是苯甲?；灰约癤是CH2。
23式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH＝CH-C≡N；以及X是CH2。
實(shí)施例34MLK活性的凝膠位移試驗(yàn)MLK的活性可能導(dǎo)致c-jun轉(zhuǎn)錄，致使c-jun蛋白增加。c-Jun蛋白增加的量可以用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法測量，以凝膠位移試驗(yàn)鑒定，Garner等人，Nucleic Acids Res.，1981，9，3047-3060，本申請引用該文獻(xiàn)全文作為參考。將c-Jun DNA-結(jié)合位點(diǎn)編碼的放射性標(biāo)記雙鏈DNA低聚體和核細(xì)胞萃取物一起孵化，接著丙烯酰胺凝膠電泳，和放射性標(biāo)記DNA定量位移至更緩慢的流動性。這代表了與c-Jun結(jié)合的DNA蛋白，并且與萃取物中c-Jun蛋白的量有直接的比例關(guān)系。此方法可用對檢測系統(tǒng)如蛋白質(zhì)印跡或ELISAs之中的蛋白質(zhì)的磷酸化形式有特異性的抗體進(jìn)行測定。.
實(shí)施例35雞胚神經(jīng)元的存活材料購自Gibco的Leibovitz L 15介質(zhì)、葡萄糖、碳酸氫鈉、胰蛋白酶和抗生素。肌萃取物如Henderson等人，Nature，1983，302，609-611所述制備，本申請引用該文獻(xiàn)全文作為參考。所有的試劑來自Sigma，除非另有說明。
細(xì)胞培養(yǎng)按照Bloch-Gallego等人，Development，1991，111，221-232確定的方法，用免疫方法分離運(yùn)動神經(jīng)元(5.5天胚胎)，本申請引用該文獻(xiàn)全文作為參考，并用Weng等人，NeuroReport，1996，7，1077-1081所述的方法改進(jìn)，本申請也引用該文獻(xiàn)全文作為參考。運(yùn)動神經(jīng)元的純化按下述方法進(jìn)行將其接種于35mm組織培養(yǎng)盤(Nunc)，該盤用聚-DL-鳥氨酸和層粘連蛋白(1μg/ml，Upstate Biotech)預(yù)涂。培養(yǎng)介質(zhì)是L 15，其中含有碳酸氫鈉(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、黃體酮(2×10-8M)、亞硒酸鈉(3×10-8M)、伴白蛋白(0.1mg/ml)、胰島素(5μg/ml)、青霉素-鏈霉素和10％熱失活的馬血清。補(bǔ)入30μg/ml肌萃取物。將化合物III-3制成DMSO中的4mM儲備液，并于4℃避光保存。在處理和對照培養(yǎng)物中DMSO的最終濃度是0.125％。
如Lindsay等人，Dev.Biol，1985，112，319-328所述(本申請引用該文獻(xiàn)全文作為參考)，在指定的胚胎天數(shù)，由雞胚分割得到脊柱交感神經(jīng)節(jié)(SG，12天胚胎(E12))，背根神經(jīng)節(jié)(DRG；E9)和睫狀神經(jīng)節(jié)(CG；E8)。在胰蛋白酶消化和分離之后，將神經(jīng)細(xì)胞懸浮液在Ham F14培養(yǎng)介質(zhì)中涂于預(yù)涂了聚鳥氨酸和層粘連蛋白的板上，補(bǔ)充10％馬血清。在涂板之后，立刻以下述濃度加入存活因子神經(jīng)生長因子(NGF)，20ng/ml；睫狀中性粒細(xì)胞因子(CNTF)，10ng/ml。將培養(yǎng)物保存在37℃，和5％CO2的潮濕環(huán)境中。
細(xì)胞計(jì)數(shù)將神經(jīng)元在35mm培養(yǎng)盤上以柵格(Nunc)鋪板。在鋪板后立即在每盤存在明亮細(xì)胞的面積選擇掃瞄面積的10％左右，48小時后評估存活的百分?jǐn)?shù)。用錐蟲藍(lán)(未顯示)活體染色確定細(xì)胞的存活。
完整的(intact)DRG將神經(jīng)節(jié)鋪于96穴板，該板預(yù)涂了在無血清的N-介質(zhì)中的聚鳥氨酸和層粘連蛋白(每穴5μg/ml磷酸鹽緩沖液)(Bottenstein等人，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1979，76，514-517，本申請引用該文獻(xiàn)全文作為參考)，其中含有0.05％牛血清白蛋白(BSA)，培養(yǎng)物在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境中保存48小時。鋪板后2小時神經(jīng)節(jié)用250nM化合物III-3或20ng/ml NGF處理。
化合物III-3支持小雞胚胎外周神經(jīng)元的存活，且和濃度有依賴關(guān)系。
來自分開的E6脊神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元(DRG)和交感神經(jīng)節(jié)(SG)培養(yǎng)物的NGF的退縮行為使它們在48小時內(nèi)經(jīng)過了PCD。通過在NGF的退縮的時間內(nèi)于培養(yǎng)介質(zhì)中加入化合物III-3可阻止退縮行為。48小時后，1μM化合物III-3可使SG神經(jīng)元保持94％，保持890％DRG神經(jīng)元存在活(NGF-處理對照SG 65％，DRG 66％)。與此類似，24小時后，化合物III-3促進(jìn)76％的CNTF-依賴的睫神經(jīng)節(jié)(CG)神經(jīng)元存活(CNTF-處理對照67％)。在10％血清存在下，化合物III-3促進(jìn)存活的作用是濃度依賴型的，在1μM左右，對三種神經(jīng)元種群達(dá)到一個平臺(圖16A-C)。與對照培養(yǎng)物相比，存活的神經(jīng)元顯示出廣泛的軸突生長暈，具有更厚的和更彎曲的軸突(圖17E-H)。4天后，促進(jìn)存活的活性依然是完整的DRG化合物III-3 52％，處理對照的生長因子41％；SG化合物III-3 83％，處理對照的NGF 55％；CG化合物III-3 58％，處理對照的CNTF 50％)。在最佳條件下培養(yǎng)物與化合物III-3一起保存一周或更長(未顯示)。
化合物III-3支持小雞胚胎運(yùn)動神經(jīng)元的存活，且和濃度有依賴關(guān)系。
在有肌肉萃取物存在的情況下，培養(yǎng)后的小雞運(yùn)動神經(jīng)元可以存活，而在缺少時會迅速死亡。在我們的試驗(yàn)中，與14％未處理對照組相反，在沒有肌肉萃取物存在的情況下，48小時后有65％存活的運(yùn)動神經(jīng)元。在沒有血清的條件下，化合物III-3的存活作用在300nM時最大，比肌肉萃取物誘導(dǎo)的更高(79％)。在此系統(tǒng)中，化合物III-3存活作用對濃度的依賴性和在外周神經(jīng)元不同，因?yàn)榛衔颕II-3濃度大于300nM時顯示出日益增多地還原作用(圖16A)。這些可能說明化合物III-3活性方面對運(yùn)動神經(jīng)元的特定靈敏度。就形態(tài)學(xué)而言，化合物III-3營救出的運(yùn)動神經(jīng)元顯示出階段明亮細(xì)胞體，并能夠擴(kuò)展長軸突，與由肌肉萃取物誘導(dǎo)的那些相比似乎更粗(圖17)。培養(yǎng)4天后，與用肌肉萃取物大42％相比，用化合物III-3時的運(yùn)動神經(jīng)元存活56％。在300nM時，化合物III-3處理組神經(jīng)元的離體存活至少達(dá)到一周(未顯示)。
化合物III-3對完整背根神經(jīng)節(jié)的軸突生長暈的促進(jìn)作用上述試驗(yàn)結(jié)果表明化合物III-3不僅能夠促進(jìn)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎神經(jīng)元的存活，而且會產(chǎn)生粗壯的軸突生長暈。在有生長因子存在時，許多這樣的擴(kuò)展似乎比有生長因子存在時所引起(elicted)的更粗(將圖17A-D與圖17E-H比較)。在250nM化合物III-3存在下，由完整胚胎背根神經(jīng)節(jié)的軸突生長暈引起的軸突生長暈之中還觀察到上述作用(圖18C)。對NGF(圖18B)和化合物III-3兩者的響應(yīng)是軸突生長；由NGF引起的比只存在化合物III-3時的生長更細(xì)和有更多的分枝，在只有化合物III-3時似乎生長的粗和可能是簇生的。
實(shí)施例36體內(nèi)處理在小雞胚胎中試驗(yàn)性調(diào)節(jié)運(yùn)動神經(jīng)元死亡此實(shí)施例在Glicksman等人，J.NeurobioL，1998，1535，361-370中有詳細(xì)描述，本申請引用其全文作為參考。如Oppenheim等人，Science，1991，251，1616-1617中所述(本申請引用其全文作為參考)，在雞蛋殼(Spafas，Preston，CT)上開口E6，由E6-E9，每天一次將任意載體，(5％SolutolTMHS15、聚乙二醇660羥基硬脂酸酯；BASF Aktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany(于磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，pH7.2))或特定劑量化合物III-3載體溶液直接用于血管化的絨膜尿囊膜。在E10處死胚胎，取出脊髓，在Carnoy溶液(10％冰乙酸，60％絕對乙醇，30％氯仿)中固定，進(jìn)行系列石蠟切片，用硫堇染色。按前文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法(Clarke等人，Methods In CellBiologyCell Death，1995，Schwart & Osborne，Eds.，Academic Press，New York，pp277-321，本申請引用其全文作為參考)，取腰段1-8的每個第20切片計(jì)數(shù)。
在大鼠新生兒中試驗(yàn)性調(diào)節(jié)運(yùn)動神經(jīng)元死亡由Harlan實(shí)驗(yàn)室(lndianapolis，IN)得到Untimed懷孕的Sprague-Dawley大鼠。每天在雌性大鼠的幼兒(pups)上，就作為靶標(biāo)的會陰肌肉皮下(SC)注射，化合物III-3于5％SolutolTMHS 15中的溶液，或者注射載體，從出生的那天(P1)，連續(xù)注射到第5天(P5)。在P10或P60那天，處死幼兒，用肝素化的毛細(xì)管收集血液，在動物體用鹽水/福爾馬林灌流之后，分割出含有球海綿體肌(SNB)的性雙態(tài)脊柱核，和含有球海綿體肌(BC)和提肌(LA)肌肉的會陰面。將含有SNB的脊髓部分進(jìn)行后固定，包埋至Paraplast中，切片成10μm，用Cresylecht紫染色(Nordeen等人，Science，1985，229，671-673，本申請引用其全文作為參考)。如前所述(Nordeen等人，同上)，在由脊髓的腰段5至骶骨1區(qū)的連續(xù)切片中以X500對運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)。通過觀察者對盲試到處理組對編號的切片進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)。運(yùn)動神經(jīng)元計(jì)數(shù)用于細(xì)胞大小和切片厚度校正(Konisgsmark，Contemporary ResearchMethods in Neuroanatomy，Nauta & Ebbesson，Eds.，1970，Springer-Verlag，New York，pp.315-340，本申請引用其全文作為參考)，并用單向反差分析(one-way analysis of variance)(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將會陰肌肉組織后固定，脫鈣，包埋至Paraplast中，切片成10μm，用Milligan′s Trichrome染色。使用明視場顯微鏡(X250)，以正常雌性的BC和LA肌肉和化合物III-3-處理組的雌性動物(405只動物/組)作為陽性檢測組，對其部位和存在的條紋狀纖維進(jìn)行測定。用投影顯微鏡(62.5)由另外的切片跟蹤肌肉組織的輪廓，并用數(shù)字化的墊和計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的形態(tài)計(jì)量系統(tǒng)(Sigrnascan，Jandel Scientific)測定橫斷面積。用橫斷面的總面積計(jì)算肌肉的體積，乘以切片厚度，并校正為樣品結(jié)構(gòu)的百分?jǐn)?shù)。
收集的血液于室溫離心5分鐘，然后取出質(zhì)粒，于-20℃冷凍。按照。Wingfield等人于Steroids，1975，26，311-327中所確定的反射線免疫試驗(yàn)方法測定睪丸素水平(6-7只動物/組)，本申請引用其全文作為參考。
成年大鼠誘導(dǎo)Axotomy的運(yùn)動神經(jīng)元去分化在Neumbutol感覺缺失的條件下，將雌性Sprague-Dawley大鼠(120-180g)頸部橫切得到左舌下神經(jīng)，將50μl化合物III-3和其載體(5％SolutolTMHS 15)用于GelfoamTM(AJ Buck，Owings Mills，MD)部分，然后圍著橫切神經(jīng)的近端纏繞。七天后，麻醉動物，并撒以4％聚甲醛于Sorenson緩沖液中的溶液，該緩沖液是0.07M磷酸鹽溶液，pH7.2。取出腦干，在低溫槽中切下40-μm粗串狀冠須部分(Chiu等人，NeuroReport，1994，5，693-696，本申請引用其全文作為參考)。按照前文所述(Chiu等人，J.Comp.NeuroL，1993，328，351-363，本申請引用其全文作為參考)，用從Chemicon得到的抗-ChAT的單克隆抗體的1∶350稀釋液對每5個切片部分進(jìn)行ChAT免疫組織化學(xué)加工。在上述本底的基礎(chǔ)上進(jìn)行清晰染色的細(xì)胞在染色區(qū)計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目以舌下神經(jīng)核解剖端(axotomized side)的ChAT-免疫活性細(xì)胞數(shù)目與對照端(未傷害的)的免疫活性細(xì)胞數(shù)目之比例表示。
化合物III-3可營救離體大鼠胚胎運(yùn)動神經(jīng)元使之免于編程性細(xì)胞死亡，并抑制信號通道，從而引起這些細(xì)胞中JNKI的活化(Maroney等人，J.Neurosci.，1998，18，104-111，本申請引用其全文作為參考)。為了測定體內(nèi)的有效活性，以發(fā)育調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡程序的兩種模型，和對成年大鼠運(yùn)動神經(jīng)元解剖誘導(dǎo)(axotomyinduced)的去分化模型對化合物III-3進(jìn)行評價。在小雞中，在ES-b期間，差不多有50％的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元經(jīng)過了PCD(Hamburger等人，J.NeuroscL，1982，1，38-55；Purves等人，Body and BrainA Trophic Theoiy of NeuralConnections，1988，Harvard University Press，Cambridge，MA，本申請引用兩者的全文作為參考)。在此期間，應(yīng)用化合物III-3在尿囊絨膜上防止運(yùn)動神經(jīng)元死亡時是劑量依賴模式(圖19)。40％的會發(fā)生正常死亡的運(yùn)動神經(jīng)元在兩個最高劑量的試驗(yàn)中得到了營救(2.3和7μg/天)，在最低劑量(1.2和1.8μg/天)時可營救25％的運(yùn)動神經(jīng)元。
在雌性大鼠的圍產(chǎn)早期(后期胚胎階段直到出生日(PN)4)，SNB中50％以上的運(yùn)動神經(jīng)元PCD消除(Breedlove，J.NeurobioL，1986，17，157-176，本申請引用其全文作為參考)。在雄性大鼠的神經(jīng)核中，運(yùn)動神經(jīng)元神經(jīng)支配與交配反射有關(guān)的有紋陰莖肌肉。睪丸的雄激素類固醇分泌誘導(dǎo)雄性大鼠的SNB運(yùn)動神經(jīng)元死亡，并防止大部分被運(yùn)動神經(jīng)元神經(jīng)支配的BC和LA肌肉的萎縮。給雌性幼兒以睪酮用藥，使其達(dá)到雄性的全部SBN運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目(Nordeen等人，同上)和防止BC和LA肌肉萎縮(Waiman等人，Endocrinology，1941，29，955-978，本申請引用其全文作為參考)。每天給雌性大鼠經(jīng)皮下給藥化合物III-3(PN 1-5)，可使運(yùn)動神經(jīng)元死亡顯著變少(圖20A)。在兩種劑量(每天0.5和1mg/kg)時可用化合物III-3營救SBN運(yùn)動神經(jīng)元使其免于死亡。在以每天0.5和1mg/kg的最高有效劑量施用化合物III-3時，可使運(yùn)動神經(jīng)元的存活提高70％，這與睪酮的效果相等(圖20A)?；衔颕II-3不會使被處理的雌性大鼠的血漿睪酮水平發(fā)生變化。對血漿睪酮水平為1mg/kg/天的處理組進(jìn)行放射性免疫測定，將其與載體對照組比較，兩者沒有顯著的區(qū)別。(分別為0.016±0.008ng/ml和0.029±0.015ng/ML的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(S.E.M.))。
為了測定化合物III-3處理是不是長期有效，以維持運(yùn)動神經(jīng)元存活，在同樣的時間期限內(nèi)PN(1-5)，將雌性大鼠用化合物III-3t處理(0.5和1mg/kg/天)。一半動物用載體處理，兩種處理組都在PN1O時處死。然后將其余的動物不用額外的化合物III-3處理，并在PN6O時處死。如前面所觀察到的(圖20A)，用化合物III-3處理可使運(yùn)動神經(jīng)元的存活提高70％(圖20B)。進(jìn)一步的，在最后用化合物III-3處理后55天，由形態(tài)學(xué)鑒定可知，對運(yùn)動神經(jīng)元的營救可達(dá)到100％(圖20B)。在新生兒期，對化合物III-3動神經(jīng)元死亡的抑制使運(yùn)動神經(jīng)元存活至成年期。
盡管有清楚的論證，和對成人疾病如肌萎縮側(cè)索硬化的運(yùn)動神經(jīng)元損失的破壞性作用，在大多數(shù)動物運(yùn)動神經(jīng)元損傷模型中，成人運(yùn)動神經(jīng)元有穩(wěn)定的死亡。但是，軸突的損傷不會導(dǎo)致形態(tài)學(xué)變化(Oppenheim等人，同上)，和成人運(yùn)動神經(jīng)元的生物化學(xué)變化(Oppenheim等人，同上；Rende等人，J.Comp.NeuroL，1992，319，285-298，本申請引用其全文作為參考；Chiu等人，J.Comp.NeuroL，1993，328，351-363，本申請引用其全文作為參考)，在變性性改變的運(yùn)動神經(jīng)元中，所述的成人運(yùn)動神經(jīng)元在因病死亡前可能會有模仿的變性性改變。此種變化的一個實(shí)施例起因于舌下神經(jīng)的axotomy，它可刺激舌的活動。7天后，對成年大鼠此神經(jīng)的單向橫切會導(dǎo)致同側(cè)神經(jīng)核中95％的ChAT-免疫反應(yīng)性舌下運(yùn)動神經(jīng)元損失(Chiu等人，NeuroReport，1994，5，693-696，本申請引用其全文作為參考)。ChAT-免疫活性的損失是永久性的。axotomy四個星期后，100％運(yùn)動神經(jīng)元的ChAT-免疫活性恢復(fù)到對照組水平(Borke等人，J.Neurocytol.，1993，22，141-153，本申請引用其全文作為參考)。對側(cè)舌下運(yùn)動神經(jīng)元的ChAT-免疫活性不受影響(Chiu等人，同上)(圖21和表5)。
當(dāng)在舌下神經(jīng)的近端應(yīng)用GelfoamTM時，在axotomy7天后，評價同側(cè)的舌下運(yùn)動神經(jīng)元的ChAT-免疫活性，其減少依賴于化合物III-3劑量的減少。最高有效劑量(50μg/天)時，與axotomized，的未處理組的ChAT-免疫活性相比多40％圖21B和表5)。對使存活大于未處理組的較低或較高劑量而言，兩者都有鈴形的劑量依賴關(guān)系，但是比在50μg時達(dá)到的要小。正如在SNB模型中確實(shí)存在的，在動物的任何劑量試驗(yàn)中，這些都與重量損失、死亡率或總的阻止損傷無關(guān)。
在此體內(nèi)運(yùn)動神經(jīng)元退化病變的三個模型中，化合物III-3表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)活性發(fā)展性的調(diào)節(jié)胚胎腰脊髓運(yùn)動神經(jīng)元的PCD(圖19)，出生后的SNB運(yùn)動神經(jīng)元對雄激素敏感的死亡(圖20)，和axotomy誘導(dǎo)的成年舌下運(yùn)動神經(jīng)元的功能性標(biāo)記物ChAT的的損失圖21和表示5)。經(jīng)皮下注射外圍給藥，在神經(jīng)的切下端局部用藥，或直接覆蓋于小雞胚胎的尿囊絨膜時，化合物III-3是有效的。與母體分子K-252a相反，在調(diào)節(jié)富含運(yùn)動神經(jīng)元的培養(yǎng)物中的存活率時化合物III-3多5倍左右(數(shù)據(jù)未顯示)，并且對trkA酪氨酸激酶和幾種絲氨酸蘇氨酸激酶未顯示出活性(Maroney等人，同上；Kaneko等人，J.Med.Chem.，1997，40，1863-1869，本申請引用其全文作為參考)。
表5在axotomized舌下運(yùn)動神經(jīng)元中化合物III-3對乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶免疫活性的作用

在橫切之后立刻在舌下神經(jīng)的近端加入于凝膠泡沫中的化合物III-3或載體，7天后，將動物處死，并把整個舌下神經(jīng)核系列切片，每五個切片用抗-ChAT抗體免疫染色，在神經(jīng)核的同側(cè)(試驗(yàn)組)和對側(cè)(對照組)進(jìn)行ChAT-陽性神經(jīng)核計(jì)數(shù)，將對照載體組和處理組進(jìn)行比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*p＜0.05。
MLK-3途徑的抑制劑在體內(nèi)顯示的效力以及在MPTP模型中對MLK-3下游磷酸化作用的阻斷將MPTP以(40mg/kg)的劑量給藥，所述劑量在黑質(zhì)中會產(chǎn)生條紋狀多巴胺能終端和細(xì)胞體的損失。酪氨酸羥基化酶被用作黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)終端的標(biāo)記物。MPTW損害之后，將化合物III-3系統(tǒng)給藥可減少黑質(zhì)酪氨酸羥基化酶免疫活性神經(jīng)元的損失(圖22a；Saporito等人，1999)。因?yàn)榛衔颕II-3是已知的MLK3抑制劑，可在MPTP-處理的小鼠中測定MLK3基質(zhì)下游的活性。磷酸化MKK4的水平可用磷酸化-MKK4特異性抗體測定(New England Biolabs，Beverly，MA)，用任一免疫印跡(圖22b)或ELISA(圖22c)方法可識別MKK4的單磷酸化形式。相對于對照的水平，MPTP給藥可將黑質(zhì)中磷酸化MKK4的水平提高達(dá)到5倍(圖22b)。MPTP給藥后4小時可達(dá)到峰值，同時達(dá)到MPP+、MPTP-介導(dǎo)的MKK4磷酸化的CNS峰值，上述提高可由于1-丙炔苯丙胺(deprenyl)預(yù)處理而減少，這說明MKK4磷酸化作用可由MPP+介導(dǎo)(圖22c)。而且，當(dāng)用1mg/kg劑量的化合物III-3預(yù)處理時，MKK4的磷酸化作用可部分地受到抑制，因而對MPTP-誘導(dǎo)的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能損失具有保護(hù)作用(圖22c)。這些數(shù)據(jù)說明MPTP(MPP+)活化了MLK3下游的基質(zhì)，MKK4。另外，這些數(shù)據(jù)也說明已知的抑制劑可以抑制這些激酶途徑在體內(nèi)的活性。
實(shí)施例37炎癥THP-1細(xì)胞中的LPS對IL-1和TNF-α的誘導(dǎo)以及吲哚并咔唑和吡咯并咔唑?qū)λ稣T導(dǎo)的影響選擇免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，由于許多激酶與多種免疫功能的調(diào)節(jié)有關(guān)，例如誘導(dǎo)細(xì)胞因子的合成和誘導(dǎo)細(xì)胞因子的生物響應(yīng)。最近的研究報告(Hambleton等人，Proc.Natl Acad.Sci.，USA，1996，93，2774-2778，本申請引用其全文作為參考)指出用LPS處理衍生單核細(xì)胞的細(xì)胞系能引起JNK活性的迅速活化。當(dāng)單核細(xì)胞與細(xì)菌內(nèi)毒素如脂多糖(LPS)接觸，它們能夠產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF-α。抑制這兩種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可用于治療免疫系統(tǒng)的某些炎癥疾病。這些細(xì)胞因子易于由商品化的ELISA試劑盒測定。我們設(shè)計(jì)的一些實(shí)驗(yàn)用來確定(1)是否吲哚和稠合的吡咯并咔唑能夠在單核細(xì)胞系THP-1中抑制IL-1和TNF-α的合成，(2)是否JINK被THP-1細(xì)胞中的LPS活化，(3)是否JNK被LPS的活化可由吲哚和稠合的吡咯并咔唑抑制。
實(shí)驗(yàn)方法THP-1細(xì)胞生長在10％胎牛血清補(bǔ)加的RPMI 1640培養(yǎng)基中。LPS(大腸肝菌血清型0111.B4，TCA萃取的)由Sigma購買，并溶解在PBS中。用于IL-1和TNF-α測試的ELISA試劑盒購于Boerhinger Mannheim，THP-I培養(yǎng)基的試驗(yàn)按制造商的指示進(jìn)行。依照說明得到每個試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)驗(yàn)是在12穴扳中進(jìn)行的，采用1或2ml的THP-1細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為4×105個細(xì)胞/ml。IL-1和TNF-α通過加入LPS誘導(dǎo)到該培養(yǎng)基中，在不同時間收集培養(yǎng)基，而后進(jìn)行細(xì)胞因子試驗(yàn)。離心排除細(xì)胞，試驗(yàn)前上清液在-70℃冷凍。為減少費(fèi)用，實(shí)驗(yàn)在雙份培養(yǎng)基中進(jìn)行，在離心后使雙份上清液合并，合并的上清液均兩次試驗(yàn)。吲哚和稠合的吡咯并咔唑在100％DMSO中的原液，在包含10％胎牛血清的培養(yǎng)基或包含0.5mg/ml BSA的培養(yǎng)基中，被稀釋到所希望的濃度。除非另有說明，是在加入LPS1小時前將化合物加入到THP-1細(xì)胞中。
JNK活性試驗(yàn)在從溶解THP-1細(xì)胞的萃取液中免疫沉淀JNK蛋白后進(jìn)行的。沉淀的THP-1細(xì)胞在500μl的Frac緩沖液(10mMTris-Hcl，pH7.5，50mM NaCl，30μM焦磷酸鈉1mg/ml BSA，1％Triton-X-100)中的冰上溶解15分鐘。萃取液在在14K離心10分鐘，向上清液加入5μl的JNK抗體(Santa Cruz)。萃取液在4℃旋轉(zhuǎn)60分鐘，加入75μl洗滌蛋白A Sepharose(20％w/v in Frac)。萃取液再旋轉(zhuǎn)30分鐘，以使抗體復(fù)合物結(jié)合到蛋白A Sepharose上。蛋白ASepharose用Frac緩沖液洗滌兩次，每次用20mM Hepes，pH7.6，20mMMgCl2，2mM DTT，而后在30℃在30μl激酶緩沖液(20mMhepes，20mM MgCl2，2MM DTT，1μg重組體c-jun，和2μM ATP-γ-32P，2μCi)中孵化15分鐘。反應(yīng)通過加入10μl的4XSDS凝膠加樣緩沖液而終止，在80C加熱3分鐘，該蛋白在10％SDS凝膠上分析。干燥凝膠，放到磷光板(Phosphorimager plate)上，在磷光板上分析放射性帶。
初步試驗(yàn)結(jié)果表明，在2ug/ml的LPS給出最大的IL-1產(chǎn)量，這個濃度的LPS用于此后的所有實(shí)驗(yàn)中。在加入LPS后，獲取該細(xì)胞因子最大產(chǎn)量的最小時間，通過利用在加入LPS后為在不同時間試驗(yàn)的同等試樣的培養(yǎng)基來測定。第一個實(shí)驗(yàn)表明，IL-1和TNF-α加入LPS后在低于5小時內(nèi)獲得最大產(chǎn)量。因?yàn)榈谝粋€實(shí)驗(yàn)最早的收集時間是2.4小時，所以第二個實(shí)驗(yàn)用加入LPS后15分鐘開始收集的培養(yǎng)基進(jìn)行。這個僅用來評價TNF-α的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它在加入LPS后3小時獲得最大產(chǎn)量。在加入LPS后90分鐘內(nèi)培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)明顯的TNF-α。
最大產(chǎn)量的迅速獲得表明非常緊密地調(diào)節(jié)2細(xì)胞因子的合成一迅速合成和迅速減量調(diào)節(jié)。細(xì)胞的培養(yǎng)物在加入LPS前用ActinomycinD、RNA合成抑制劑、或一種蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺處理30分鐘。加入LPS后3小時后收集培養(yǎng)基，并進(jìn)行TNF-α試驗(yàn)。新RNA和蛋白合成需要TNF-α誘導(dǎo)，因?yàn)樵谟酶鱾€抑制劑處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)TNF-α。接下去的實(shí)驗(yàn)是為了確定化合物III-3是否能抑制IL-1和TNF-α的誘導(dǎo)?；衔颕II-3抑制IL-1和TNF-α的誘導(dǎo)分別在IC50值267nM和139Nm。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在包含10％胎牛血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中獲得的。因?yàn)閷顾杞M織和基前腦組織就化合物的神經(jīng)營養(yǎng)性活性試驗(yàn)是在無血清的培養(yǎng)基(500μg/ml BSA)中進(jìn)行的，所以確定無血清培養(yǎng)基中抑制IL-1和TNF-α的IC50值是有意義的。當(dāng)THP-1細(xì)胞用化合物III-3在無血清培養(yǎng)基(500μg/ml BSA)中處理時，IC50值減少10倍，從269mM到23mM。除非另有說明，后面所有實(shí)驗(yàn)都是在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的?；衔颕II-3在THP-1細(xì)胞中IL-1和TNF-α的抑制作用表明，化合物III-3可用作由產(chǎn)生這些正常量的細(xì)胞因子而引起的病理性疾病的治療劑。膿毒性休克就是這種疾病。膿毒性休克是由在循環(huán)中革蘭氏陰性菌的增長并接著釋擴(kuò)增量的內(nèi)毒素LPS引起的。LPS主要刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并產(chǎn)生大量的IL-1和TNF-α，它們又引起大量組織損傷，并在許多情況下導(dǎo)致組織死亡。
測定了某些化合物抑制TNF-α的能力，并同抑制JNK的能力做了比較。結(jié)果示于表6。
表6

在Jurkat細(xì)胞中化合物III-3對誘導(dǎo)II-2的影響進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)是為了確定在Jurkat細(xì)胞中化合物III-3是否抑制化合物II-2的誘導(dǎo)作用。
實(shí)驗(yàn)方法Jurkat細(xì)胞生長在10％胎牛血清補(bǔ)加的RPMI 1640培養(yǎng)基中。TNF-α由Promega購買，抗CD3和抗CD28抗體由Pharmigen購買。Jurkat實(shí)驗(yàn)在96穴扳中進(jìn)行的。IL-1由購于Boerhinger Mannheim的ELISA試劑盒測定。在加入細(xì)胞前，使CD3和CD28抗體結(jié)合到96穴扳的塑料板上(在PBS中18小時)。細(xì)胞在加入到抗體涂抹的板以前用化合物1處理。CD3和CD28抗體用來活化T細(xì)胞受體和誘導(dǎo)IL-2。誘導(dǎo)作用開始后的6小時和24小時之間，IL-2從Jurkat細(xì)胞上釋放(圖23A)。IL-2基本上未產(chǎn)生(圖23ACNT)。下面評價化合物-III(在誘導(dǎo)前用化合物-III處理1小時)對IL-2誘導(dǎo)作用的影響(圖23B)。濃度為500nM的化合物III-3抑制了80％以上的IL-2誘導(dǎo)作用(圖23B)。用化合物III-3和化合物I-4進(jìn)行了更大范圍的劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)，得到的1C50值，化合物III-3是139nM，化合物I-4是207nM(圖23C)。
我們希望本專利文獻(xiàn)所引用的每一個專利、專利申請和印刷出版物都從整體上予以參考。
正如本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員所公認(rèn)的那樣，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在不偏離本發(fā)明精神的前提下可進(jìn)行很多的變化和改進(jìn)。我們期望所有這些變化都處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制多譜系激酶蛋白的化合物在制備用于治療哺乳動物神經(jīng)變性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 式中E1和E2各自分別都與它們所連接的碳原子構(gòu)成或不飽和的6元芳香碳環(huán)，環(huán)上的1-3個碳原子可被氮原子置換；或不飽和的5元芳香碳環(huán)，在環(huán)上或1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；或2個碳原子被硫和氮原子或氧和氮原子置換；A1和A2一起代表O，B1和B2一起代表O；R1是H，1-4個(含)碳原子的烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基；COR9，其中R9是1-4個(含)碳原子的烷基或芳基，優(yōu)選苯基或萘基；OR10，其中R10是H或1-4個(含)碳原子的烷基；-CONH2，-NR7R8，-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4(含)的整數(shù)；或-O(CH2)nNR7R8；和或R7和R8分別各自是H或1-4(含)個碳原子的烷基；或R7和R8一起構(gòu)成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1是-O-，-S-和-CH2-；R2是H，SO2R9；-CO2R9，-COR9，1-8個(含)碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基，優(yōu)選1-4個碳原子的炔；或5-7個(含)碳原子的單糖，每一個單糖的羥基是末取代的或由H，1-4個(含)碳原子的烷基，2-5個(含)碳原子的烷基酰氧基，或1-4個(含)碳原子的烷氧基取代的；和或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基是末取代的，或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基各自分別是由1-3個含6-10個碳原子的芳基取代，優(yōu)選苯基或萘基；雜芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，O-四氫吡喃基，NH2，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CO2R9，-NR10CONR7R8，-NHC(＝NH)NH2，-NR10SO2R9，-S(O)YR11，其中R11是H，1-4個(含)碳原子的烷基，6-10個(含)碳原子的芳基，優(yōu)選苯基或萘基，或雜芳基和Y是1或2；-SR11，-CO2R9，-CONR7R8，-CHO，COR9，CH2OR7，-CH＝NNR11R12，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-SO2NR12R13，-PO(OR11)2，或OR14，其中R14是羧基的羥基除去后氨基酸的殘基和或R12和R13各自分別是H，1-4個(含)碳原子的烷基，6-10個(含)碳原子的芳基，優(yōu)選苯基或萘基，或雜芳基或R12和R13一起構(gòu)成連結(jié)基團(tuán)，優(yōu)選(CH2)2-X1-(CH2)2-；R3，R4，R5和R6各自分別是H，芳基，優(yōu)選6-10個(含)碳原子的芳基，更優(yōu)選苯基或萘基；雜芳基；F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，NH2，-CH2OH，-CH2OR14，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CONR7R8，SR11，-S(O)YR11，其中Y是1或2；-CO2R9，-COR9，-CONR7R8，-CHO，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNR11R12，-(CH2)nSR9，其中n是1-4(含)的整數(shù)，-(CH2)nS(O)YR9，-CH2SR15其中R15是1-4個(含)碳原子的烷基，-CH2S(O)YR14，-(CH2)nNR7R8，-(CH2)nNHR14，1-8個(含)碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烷基；1-8個(含)碳原子的烯基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烯基；1-8個(含)碳原子的炔基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的炔基；和或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基是未取代的或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基是取代的，如前面d)2)中所述；X或是未取代的1-3個(含)碳原子的烯基；或X是由R2取代的1-3個(含)碳原子的烯基，優(yōu)選OR10，-SR10，R15，其中R15是1-4個(含)碳原子的烷基；苯基，萘基，7-14個(含)碳原子的芳烷基，優(yōu)選芐基；或X是-CH＝CH-，-CH(OH)-CH(OH)-，-O-，-S-，-S(＝O)-，-S(＝O)2-，CR10)2-，-C(＝O)-，-C(＝NOR11)-，-C(OR11)(R11)-，-C(＝O)CHR15-，-CHR15)C(＝O)-，-C(＝NOR11)CHR15)-，CHR15)C(＝NOR11)-，CH2Z-，-ZCH2-，-CH2Z-CH2-，其中Z是C(OR11)(R11)，O，S，C(＝O)，C(＝NOR11)-或NR11；或者A1和A2各自分別是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；B1和B2一起代表O；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定義；或A1和A2一起代表O；和B1和B2各自分別是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定義。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；和X是CH2。
4.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；和X是CH2。
5.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；和X是CH2。
6.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；和X是CH2。
7.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基))；和X是CH2。
8.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R4是CH2CH2(2-噠嗪基)；和X是CH2。
9.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；和X是CH2。
10.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2CH2OH；和X是CH2。
11.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；和X是S。
12.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；和X是CH2。
13.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2(OH)；和X是CH2。
14.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述的的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 式中環(huán)B和環(huán)F都與它們所連接的碳原子成環(huán)，并分別各自選自下述基團(tuán)，a)不飽和的6元芳香碳環(huán)，環(huán)上的1-3個碳原子可被氮原子置換；b)不飽和的5元芳香碳環(huán)；和c)不飽和的5元芳香碳環(huán)，在環(huán)上或1)1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；2)2個碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或兩個氮原子置換；或3)3個碳原子被3個氮原子置換；R1選自下述基團(tuán)a)H，取代或未取代的1-4個碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代芳烷基，取代或未取代的雜芳基，或取代或未取代的雜芳烷基；b)-C(＝O)R9，其中R9選自烷基、芳基或雜芳基；c)-OR10，其中 R10選自H和1-4個碳原子的烷基；d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-O(CH2)POR10和-O(CH2)PNR11R12，其中p為1-4；和其中或1)R11和R12分別各自選自H和1-4個碳原子的烷基；或2)R11和R12一起構(gòu)成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1選自-O-，-S-和-CH2-；R2選自下述基團(tuán)H，1-4個碳原子的烷基，OH，1-4個碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10個碳原子的芳烷基，取代或未取代的雜芳烷基；R3，R4，R5和R6各自分別選自下述基團(tuán)a)H，芳基，雜芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；b)-CH2ORR14，其中R14是在羧基的羥基脫除后的氨基酸殘基；c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14，其中y是0，1或2；e)1-8個碳原子的烷基，2-8個碳原子的烯基，2-8個碳原子的炔基，其中1)每個烷基、烯基、炔基是未取代的，或2)每個烷基、烯基、炔基是由下述1-3個基團(tuán)取代的6-10個碳原子的芳基、雜芳基、芳基烷氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基-烷硫基F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氫吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，和5-7個碳原子的單糖，其中單糖的每個羥基各自分別或未取代或由H、1-4個碳原子的烷基、2-5個碳原子的烷基酰氧基或1-4個碳原子的烷氧基；X2是O，S，或NR10；R7和R8是各自分別選自H、1-4個碳原子的烷基、1-4個碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10個碳原子的芳烷基或取代或未取代的雜芳烷基、-(CH2)POR10，-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12，或R7和R8一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)式-CH2-X3-CH2-的連結(jié)基團(tuán)，其中X3是X2或單鍵；m和n各自分別是0，1，或2；Y選自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；Z選自單鍵、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)--N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)--C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；R15和R16各自分別選自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10，R17選自H，烷基，芳基，和雜芳基；A1和A2選自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1與A2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；B1和B2選自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1與B2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；條件是A1與A2和B1與B2中至少有一對形成＝O。
15.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 式中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同構(gòu)成＝O；R1選自下述基團(tuán)H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H，，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3， R2選自下述基團(tuán)H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X選自下述基團(tuán)H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述結(jié)構(gòu)式之一 和R選自O(shè)H和OCH3。
16.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-吡啶基)；和R是OH。
17.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；和R是OH。
18.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；和R是OH。
19.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OH。
20.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3；和R是OH。
21.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1，Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；和R是OH。
22.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和，Z2是H；R1和R2是H2S(3-(1，2，4-三嗪)；X是CO2CH3；和R是OH。
23.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是I；X是CO2CH3；和R是OH。
24.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2SCH2CH3；X是CO2CH3；和R是OH。
25.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；和R是OCH2。
26.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中Z1和Z2構(gòu)成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；和R是OH。
27.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述的的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構(gòu)體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
28.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是CH2CH＝CH2。
29.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中R1是Br，和R2，R3，R4，Z1和Z2是H。
30.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H；R3和R4是CH2CH＝CH2。
31.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中R1，R2，R3，Z1，和Z2是H；R4是CH2CH＝CH2。
32.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中R1，R2，Z1和Z2是H；R3和R4是CH2CH2＝CH2OH或R1，R2，R4，Z1，和Z2是H；R3是
33.一種抑制多譜系激酶蛋白的化合物在制備用于治療哺乳動物炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。
34.權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中所述的的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式； 式中E1和E2各自分別都與它們所連接的碳原子構(gòu)成或不飽和的6元芳香碳環(huán)，環(huán)上的1-3個碳原子可被氮原子置換；或不飽和的5元芳香碳環(huán)，在環(huán)上或1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；或2個碳原子被硫和氮原子或氧和氮原子置換；A1和A2一起代表O，B1和B2一起代表O；R1是H，1-4個(含)碳原子的烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基；COR9，其中R9是1-4個(含)碳原子的烷基或芳基，優(yōu)選苯基或萘基；OR10，其中R10是H或1-4個(含)碳原子的烷基；-CONH2，-NR7R8，-(CH2)nNR7R8，其中n是1-4(含)的整數(shù)；或-O(CH2)nNR7R8；和或R7和R8分別各自是H或1-4(含)個碳原子的烷基；或R7和R8一起構(gòu)成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1是-O-，-S-和-CH2-；R2是H，SO2R9；-CO2R9，-COR9，1-8個(含)碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-4個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基，1-4個碳原子的炔；或5-7個(含)碳原子的單糖，每一個單糖的羥基是末取代的或由H，1-4個(含)碳原子的烷基，2-5個(含)碳原子的烷基酰氧基，或1-4個(含)碳原子的烷氧基取代的；和或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基是末取代的，或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基各自分別是由1-3個含6-10個碳原子的芳基取代，優(yōu)選苯基或萘基；雜芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，O-四氫吡喃基，NH2，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CO2R9，-NR10CONR7R8，-NHC(＝NH)NH2，-NR10SO2R9，-S(O)YR11，其中R11是H或1-4個(含)碳原子的烷基，6-10個(含)碳原子的芳基，優(yōu)選苯基或萘基，或雜芳基和Y是1或2；-SR11，-CO2R9，-CONR7R8，-CHO，COR9，CH2OR7，-CH＝NNR11R12-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-SO2NR12R13，-PO(OR11)2或OR14，其中R14是羧基的羥基除去后氨基酸的殘基和或R12和R13各自分別是H，1-4個(含)碳原子的烷基，6-10個(含)碳原子的芳基，優(yōu)選苯基或萘基，或雜芳基或R12和R13一起構(gòu)成連結(jié)基，優(yōu)選(CH2)2-X1-(CH2)2-；R3，R4，R5和R6各自分別是H，芳基，優(yōu)選6-10個(含)碳原子的芳基，更優(yōu)選苯基或萘基；雜芳基；F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)nNR7R8，-OCOR9，-OCONHR9，NH2，-CH2OH，-CH2OR14，-NR7R8，-NR10COR9，-NR10CONR7R8，SR11，-S(O)YR11，其中Y是1或2；-CO2R9，-COR9，-CONR7R8，-CHO，-CH＝NOR11，-CH＝NR9，-CH＝NNR11R12，-(CH2)nR9，其中n是1-4(含)的整數(shù)，-(CH2)nS(O)YR9，-CH2SR15其中R15是1-4個(含)碳原子的烷基，-CH2S(O)YR14，-(CH2)nNR7R8，-(CH2)nNHR14，1-8個(含)碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烷基；1-8個(含)碳原子的烯基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的烯基；1-8個(含)碳原子的炔基，優(yōu)選1-4個(含)碳原子的炔基；和或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基是未取代的或1-8個(含)碳原子的烷基，1-8個(含)碳原子的烯基，1-8個(含)碳原子的炔基是取代的，如前面d)2)中所述；X或是未取代的1-3個(含)碳原子的烯基；或X是用R2取代的1-3個(含)碳原子的烯基，優(yōu)選OR10，-SR10，R15，其中R15是1-4個(含)碳原子的烷基；苯基，萘基，7-14個(含)碳原子的芳烷基，優(yōu)選芐基；或X是-CH＝CH-，-CH(OH)-CH(OH)-，-O-，-S-，-S(＝O)-，-S(＝O)2-，CR10)2-，-C(＝O)-，-C(＝NOR11)-，-C(OR11)(R11)-，-C(＝O)CHR15-，-CHR15)C(＝O)-，-C(＝NOR11)CHR15)-，CHR15)C(＝NOR11)-，CH2Z-，-ZCH2-，-CH2Z-CH2-，其中Z是C(OR11)(R11)，O，S，C(＝O)，C(＝NOR11)-或NR11；或者A1和A2各自分別是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；B1和B2一起代表O；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定義；或A1和A2一起代表O；和B1和B2各自分別是H，H；H，OR11；H，-SR11；H，-NR11R12；或一起代表＝S或＝NR11；R1，R2，R3，R4，R5R6和X同前面c)，d)，e)和f)的定義。
35.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；和X是CH2。
36.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；和X是CH2。
37.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；和X是CH2。
38.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；和X是CH2。
39.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基))；和X是CH2。
40.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R4是CH2CH2(2-噠嗪基)；和X是CH2。
41.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2OH；和X是CH2。
42.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2CH2OH；和X是CH2。
43.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R2，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；和X是S。
44.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；和X是CH2。
45.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起代表O；R2是CH2CH2(OH)；和X是CH2。
46.權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中所述的化合物具有以下的結(jié)構(gòu)式 式中環(huán)B和環(huán)F都與它們所連接的碳原子成環(huán)，并分別各自選自下述基團(tuán)，a)不飽和的6元芳香碳環(huán)，環(huán)上的1-3個碳原子可被氮原子置換；b)不飽和的5元芳香碳環(huán)；和c)不飽和的5元芳香碳環(huán)，在環(huán)上或1)1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；2)2個碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或兩個氮原子置換；或3)3個碳原子被3個氮原子置換；R1選自下述基團(tuán)a)H，取代或未取代的1-4個碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的雜芳基，或取代或未取代的雜芳烷基；b)-C(＝O)R9，其中R9選自烷基、芳基或雜芳基；c)-OR10，其中R10選自H和1-4個碳原子的烷基；d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-(CH2)POR10和-O(CH2)PNR11R12，其中p為1-4；和其中或1)R11和R12分別各自選自H和1-4個碳原子的烷基；或2)R11和R12一起構(gòu)成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團(tuán)，其中X1選自-O-，-S-和-CH2-；R2選自下述基團(tuán)H，1-4個碳原子的烷基，OH，1-4個碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10個碳原子的芳烷基，取代或未取代的雜芳烷基；R3，R4，R5和R6各自分別選自下述基團(tuán)a)H，芳基，雜芳基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；b)-CH2ORR14，其中R14是在羧基的羥基脫除后的氨基酸殘留；c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14，其中y是0，1或2；e)1-8個碳原子的烷基，2-8個碳原子的烯基，2-8個碳原子的炔基，其中1)每個烷基、烯基、炔基是未取代的，或2)每個烷基、烯基、炔基是由下述1-3個基團(tuán)取代的6-10個碳原子的芳基、雜芳基、芳基烷氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基.-烷硫基，F(xiàn)，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氫吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)2，-OR14，和5-7個碳原子的單糖，其中單糖的每個羥基各自分別或未取代或由H、1-4個碳原子的烷基、2-5個碳原子的烷基酰氧基或1-4個碳原子的烷氧基；X2是O，S，或NR10；R7和R8是各自分別選自H、1-4個碳原子的烷基、1-4個碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10個碳原子的芳烷基或取代或未取代的雜芳烷基、-(CH2)POR10，-(CH2)POC(＝O)NR11R12，和-(CH2)PNR11R12，或R7和R8一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)式-CH2-X3-CH2-的連結(jié)基團(tuán)，其中X3是X2或單鍵；m和n各自分別是0，1，或2；Y選自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；Z選自單鍵、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)--N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)--C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；R15和R16各自分別選自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10，R17選自H，烷基，芳基，和雜芳基；A1和A2選自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1與A2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；B1和B2選自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1與B2一起構(gòu)成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團(tuán)；條件是A1與A2和B1與B2中至少有一對形成＝O。
47.權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中所述的的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 式中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同構(gòu)成＝0；R1選自下述基團(tuán)H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3， R2選自下述基團(tuán)H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X選自下述基團(tuán)H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述結(jié)構(gòu)式之一 和R選自O(shè)H和OCH3。
48.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1是NHCONHC2H5，R2是CH2CH2(2-吡啶基)，和R是OH。
49.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2OCH2OCH2CH3，和R是OH。
50.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2SCH2CH3，和R是OH。
51.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1，Z2，R1和R2都是H，X是CO2CH3，和R是OH。
52.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1，Z2，R1和R2是H，X是CO2(CH2)4CH3，和R是OH。
53.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1，Z2，和R1是H，R2是CH2OH，X是CO2CH3，和R是OH。
54.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H，R1和R2是H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X是CO2CH3，和R是OH。
55.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是I；X是CO2CH3；和R是OH。
56.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；和R是OH。
57.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1，Z2，R1，和R2是H；X是CO2CH3；和R是OCH3。
58.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中Z1和Z2一起構(gòu)成＝O，R1和R2是Br，X是CO2CH3，和R是OH。
59.權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中所述的的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式 其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構(gòu)體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
6O.權(quán)利要求59的應(yīng)用，其中R1，R2，R4，Z1和Z2是H；R3是CH2CH＝CH2。
61.權(quán)利要求59的應(yīng)用，其中R1是Br；R2，R3，R4，Z1和Z2是H。
62.權(quán)利要求59的應(yīng)用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H；R3和R4是CH2CH＝CH2。
63.權(quán)利要求59的應(yīng)用，其中R1，R2，R3，Z1，和Z2是H；R4是CH2CH＝CH2。
64.權(quán)利要求59的應(yīng)用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H，和R3和R4是CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性和促進(jìn)細(xì)胞存活和死亡的化合物的方法，該方法包括下述步驟使含有所述的多譜系激酶蛋白的細(xì)胞同所述化合物接觸；測定所述化合物是否使多譜系激酶蛋白的活性減少；和測定所述化合物是否促進(jìn)細(xì)胞存活。本發(fā)明還涉及可用于治療神經(jīng)變性疾病和/和炎癥的化合物的鑒定方法。本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)多譜系激酶蛋白活性的方法，該方法包括使含有所述蛋白的細(xì)胞與的茚－并或吲哚并－化合物接觸；本發(fā)明還提供了治療神經(jīng)變性疾病和/和炎癥的方法。
文檔編號C07D487/00GK1589788SQ200410049108
公開日2005年3月9日 申請日期1999年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月26日
發(fā)明者安娜·馬羅尼, 凱文·M·沃爾頓, 克雷格·A·迪奧納, 尼古拉·尼夫, 埃梅斯特·小奈特, 馬西·A·格利克斯曼 申請人:賽福倫公司