一種pd-1蛋白胞外段親和肽l8及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基因工程醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種PD-1蛋白胞外段的親和肽L8及其應(yīng)用。該親和肽L8的氨基酸序列為：Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser，即：S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S，分子量為1293.7。該親和肽L8在制備抗腫瘤相關(guān)藥物中應(yīng)用，所述腫瘤為結(jié)腸癌瘤或黑色素瘤。該親和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成。本發(fā)明所獲得的PD-1蛋白胞外段親和肽L8，作用目標(biāo)明確，對腫瘤的抑制效果明顯，尤其是對結(jié)腸癌或黑色素瘤的抑瘤效果顯著，且無明顯副作用，能夠明顯提高實驗動物的生存期，因而具有較好的醫(yī)療應(yīng)用前景。
【專利說明】—種PD-1蛋白胞外段親和肽L8及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種ro-1蛋白胞外段的親和肽L8及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著全球經(jīng)濟科技的飛速發(fā)展，環(huán)境問題越來越惡劣，從而使人類的健康受到很大的威脅，尤其是近幾十年來癌癥患者的數(shù)目直線增長，但傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療、化療的技術(shù)已經(jīng)不能取得很好的療效或者是預(yù)后性較差。因此，尋找新的治療手段和治療藥物一直是全球范圍內(nèi)的研究熱點。與傳統(tǒng)的治療方法相比，腫瘤免疫治療能夠激活或者誘導(dǎo)腫瘤患者建立起對腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答，清除原發(fā)的腫瘤細胞，并且建立免疫記憶，阻止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0003]在腫瘤免疫治療中，效應(yīng)T細胞是主要的殺傷腫瘤的細胞,但T細胞的激活需要兩個信號的刺激，第一信號是識別信號，即腫瘤抗原等內(nèi)源性抗原被樹突狀細胞(DC)等抗原遞呈細胞(APC)加工處理后以MHC/表位復(fù)合物的形式遞呈至APC的表面，該復(fù)合物能被T細胞表面的T細胞受體(TCR)識別，從而形成了激活T細胞的第一信號；與此同時，T細胞和APC表面表達的多對共刺激分子相互作用產(chǎn)生了 T細胞活化的第二信號。
[0004]根據(jù)產(chǎn)生的效 應(yīng)不同，可將共刺激分子分為正性共刺激分子和負性共刺激分子。在正性共刺激分子中，最重要的是⑶28和ICOS等分子；在負性共刺激分子中，最重要的是 CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CD152)和 PD-1 (程序性死亡-1,programmed death-1,⑶279)等分子。在腫瘤免疫治療過程中，負性共刺激分子主要介導(dǎo)免疫耐受和逃逸。
[0005]ro-1分子最早是通過削減雜交技術(shù)從小鼠處于凋亡狀態(tài)的雜交瘤及造血祖細胞系克隆得到的，它被認為與細胞凋亡相關(guān)，因而命名為程序性死亡-1 (programmeddeath-1)，在2004年12月第八屆國際人類白細胞分化抗原會議上被命名為⑶279。PD-1共有288個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量是55000，是一種跨膜糖蛋白，其胞外區(qū)包含一個IgV樣結(jié)構(gòu)域，有4個重要的N連接糖基化位點，并被重度糖基化。PD-1及其配體I3D-Ll是T細胞活化過程中一對重要的負性共刺激分子，在誘導(dǎo)T細胞無能和免疫耐受維持方面起著非常重要的作用，并介導(dǎo)了腫瘤免疫耐受和逃逸。
[0006]PD-1是一種免疫球蛋白超家族激活誘導(dǎo)的抑制性受體。前人在腫瘤免疫治療過程中遇到的最大挑戰(zhàn)就是由于腫瘤免疫耐受和逃逸所導(dǎo)致的療效不佳。因此，研究通過抑制負性共刺激分子所介導(dǎo)的信號通路以打破機體已經(jīng)建立的對腫瘤細胞的免疫耐受具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種ro-Ι蛋白胞外段的親和肽L8，并經(jīng)過實驗證明了該親和肽L8具有抗腫瘤活性。[0008]本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種F1D-1蛋白胞外段的親和肽L8,其氨基酸序列為:Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-SerJP:S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T_S，分子量為 1293.7。
[0009]所述PD-1蛋白胞外段的親和肽L8在制備抗腫瘤相關(guān)藥物中應(yīng)用，所述腫瘤為結(jié)腸癌瘤或黑色素瘤，所述抗腫瘤為抑制腫瘤生長或消除腫瘤。
[0010]所述F1D-1蛋白胞外段的親和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成,簡要步驟如下: (1)選用Rink樹脂與待合成肽即I3D-1親和肽L8的C端的第一個Fmoc-氨基酸羧基以共價鍵形式連接，再以該氨基酸的N端作為該條多肽合成的起點，并讓其與下一個氨基酸的羧基端發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，形成肽鍵；
(2)然后，將N端的Fmoc-氨基酸的保護基進行脫保護，再讓第二個氨基酸的N端與后面的氨基酸的羧基反應(yīng)，如此不斷重復(fù)這一過程直至多肽合成完畢；
(3)最后，將合成的多肽從樹脂上切割下來，經(jīng)過乙醚沉淀與洗滌，得到粗肽；
(4)經(jīng)脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，得純度大于95%的本發(fā)明Η)_1親和肽L8。
[0011]本發(fā)明所提供的ro-1蛋白胞外段親和肽L8是通過固相篩選法進行噬菌體展示十二肽庫的篩選工作時所獲得的；通過對其進一步的動物實驗驗證，其對腫瘤的抑制效果明顯，無明顯副作用，能夠明顯提高實驗動物的生存期，具有較好的醫(yī)療應(yīng)用前景。ro-1蛋白胞外段親和肽L8的制備方法較為成熟、完善，便于制備相應(yīng)的生物醫(yī)藥制品，因而本發(fā)明具有較好的實際應(yīng)用推廣意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8的ES1-MS質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果；
圖2為ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8對荷CT26的BABL/c小鼠體重變化的影響結(jié)果圖；圖3為ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8對荷CT26的BABL/c小鼠移植瘤體積變化的影響結(jié)果圖；
圖4為Η)-1蛋白胞外段親和肽L8對荷CT26的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影響；
圖5為Η)-1蛋白胞外段親和肽L8對荷B16F10的C57BL/6J小鼠生存期的影響結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。
[0014]實施例1
為便于本領(lǐng)域技術(shù)人員具體實施本發(fā)明，發(fā)明人對PD-1蛋白胞外段的親和肽L8的篩選過程簡要說明如下:
UPD-1胞外段蛋白的表達與純化，簡要步驟如下:
(O首先構(gòu)建含有ro-Ι胞外段序列的pET-28a(+)-hro-l重組質(zhì)粒；
(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta(DE3)中；
(3)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達；
(4)利用鎳金屬螯合親和層析柱純化蛋白，透析復(fù)性后得到有活性的目的蛋白。
[0015]具體步驟如下:(I)以PHA (植物血凝素)刺激的健康人PBMCs (外周血單核細胞)為材料，使用Trizol試劑盒提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后得到其cDNA。利用Primer5.0設(shè)計人I3D-1胞外段的引物(正向引物為:CCACGCATATGCCAGGATGGTTCTTAGACTC，反向引物為:GGCCGGAATTCTTATTGGAACTGGCCGGCTGG)，然后利用此引物，以PBMCs的cDNA為模板擴增出目的基因，經(jīng)Nde I和EcoRI酶雙酶切目的基因和質(zhì)粒pET28a(+)后，將雙酶切產(chǎn)物在16°C的條件下連接過夜。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5ci中，挑取陽性菌落獲取重組質(zhì)粒，對其進行雙酶切驗證和DNA測序。
[0016](2)將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Transetta (DE3)，用終濃度為0.5mM的IPTG，30 0C，過夜誘導(dǎo)目的蛋白的表達。
[0017](3)將菌體離心(12000rpm，3min)棄上清，PBS(ρΗ7.4)洗一遍后重懸超聲破碎，離心后棄上清，用Binding Buffer重懸，離心(12000rpm, IOmin), 0.45 μ m微孔濾膜過濾后利
用鎳金屬螯合親和層析柱純化蛋白。
[0018](4)將純化后的蛋白進行尿素濃度梯度透析復(fù)性，最后得到有活性的目的蛋白PD-1胞外段。
[0019]利用噬菌體展示十二肽庫篩選ro-1的親和肽，簡要步驟如下:
(1)采用固相篩選法進行噬菌體展示十二肽庫的篩選工作；
(2)經(jīng)過4飛輪的篩選后，與靶蛋白ro-1胞外段有親和力的噬菌體單克隆逐輪得到富集，回收率提高了約100倍。
[0020](3)然后從第四輪和第五輪中挑選陽性克隆進行測序，共得到3個插入十二肽序列，即親和肽序列，其中L8肽出現(xiàn)的次數(shù)最多。
[0021]具體過程如下:
(I)測定噬菌體滴度:接種ER2738單菌落于5~10mL LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600~0.5)。
[0022]用LB培養(yǎng)基將噬菌體進行10倍系列稀釋。稀釋范圍:擴增的噬菌體培養(yǎng)物上清:IO8^lO11 ;未擴增的淘選洗脫物:1(T104。
[0023]將已達到對數(shù)期的菌體每200μ L裝入一微量離心管中，然后每管加入10μ L不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫孵育5min。將感染菌體加入45°C預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上，使其均勻鋪開。待平板冷卻15min后，倒置于37°C培養(yǎng)過夜。第二天檢查平板，計數(shù)有約IO2個噬菌體的平板上的斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μ L噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。
[0024](2)淘選過程
包被:將150 μ L的100 μ g/mL的靶分子溶液(溶于0.1M ρΗ8.6的NaHCO3)加入96孔微量板中，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直至表面完全濕潤，于4°C密閉濕盒中孵育過夜。
[0025] 封閉:甩出每孔中的包被液(在干凈的紙巾上用力拍甩以除盡殘余溶液)，每孔加滿封阻液，4°C作用至少I小時。
[0026]洗滌:按上述方法除去封阻液，再用TBST (TBS+0.l%[v/v]Tween-20)緩沖液快速洗板6次。此操作要快以避免板干燥。
[0027]結(jié)合:用TBST緩沖液稀釋原肽庫使100 μ L緩沖液中含有的2 X IO11個噬菌體。然后加到已包被好的板上，室溫溫和振蕩l(T60min。[0028]洗滌:甩去未結(jié)合的噬菌體，用TBST緩沖液快速洗板10次。
[0029]洗脫:每孔加入100 μ L 的洗脫液(0.2M Glycine-HCl [pH2.2], lmg/mLBSA), 25°C濕盒中輕微搖動l(T60min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，然后加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和上述洗脫液。
[0030]滴度測定:按上述測定滴度的方法對洗脫中和液中噬菌體的滴度進行測定。
[0031]擴增:將ER2738過夜培養(yǎng)菌以1:100的體積比稀釋于20mL LB中(用250mL三角瓶盛裝)，加入未擴增洗脫物。37°C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時。
[0032]沉淀:將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一離心管中，4°C 1000Orpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中再離心。將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體4°C沉淀至少60min,最好過夜。4°C 1000Orpm離心PEG沉淀15min。倒掉上清,再短暫離心,吸去殘留上清液。沉淀物重懸于ImLTBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15~60min,4°C 1000Orpm離心10min,棄上清。沉淀物重懸于200 μ LTBS中，離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物，上清轉(zhuǎn)入新鮮管中，此即為擴增后的洗脫物。測定其滴度。
[0033](3)再包被一個孔準(zhǔn)備下一輪篩選時用，方法同第一輪篩選。經(jīng)過3飛輪的篩選挑取陽性噬菌體克隆擴增后進行DNA測序。
[0034](4)噬菌體DNA序列測定:制備擴增噬菌體克隆噬菌體單鏈DNA模板。取5 μ L用
0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA提取效果。取20yL DNA測序模板進行全自動測序，測序引物為-96 gill 測序引物，5’ -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。
[0035](5)噬菌體DNA序列同源性分析:根據(jù)DNA序列推導(dǎo)其所編碼的氨基酸序列，利用DNAMAN軟件對獲得的氨基酸序列進行同源性分析。共得到3個插入十二肽序列，即親和肽序列，其中L8肽出現(xiàn)的次數(shù)最多。
[0036]實施例2
根據(jù)實施例1篩選得到的L8肽，人工合成親和肽L8。
[0037]PD-1蛋白胞外段的親和肽L8采用Fomc固相多肽合成法合成,簡要步驟如下:
(1)選用Rink樹脂與待合成肽即I3D-1親和肽L8的C端的第一個Fmoc-氨基酸羧基以共價鍵形式連接，再以該氨基酸的N端作為該條多肽合成的起點，并讓其與下一個氨基酸的羧基端發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，形成肽鍵；
(2)然后，將N端的Fmoc-氨基酸的保護基進行脫保護，再讓第二個氨基酸的N端與后面的氨基酸的羧基反應(yīng)，如此不斷重復(fù)這一過程直至多肽合成完畢；
(3)最后，將合成的多肽從樹脂上切割下來，經(jīng)過乙醚沉淀與洗滌，得到粗肽；
(4)經(jīng)脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，得純度大于95%的本發(fā)明的PD_1親和肽L8。
[0038]一個具體的以合成0.434克的親和肽L8為例，采用Fomc固相多肽合成法合成，具體合成步驟如下:
(1)稱取0.5gRink樹脂放入DMF (N, N- 二甲基甲酰胺)潤洗過的合成儀中，然后加入3-5mLDMF，靜置30min，使 樹脂充分溶脹，然后用真空泵抽去DMF ;脫保護兩次:
所述脫保護是指在合成儀中加入:T5mL脫保護液(哌啶與DMF的體積比為1:3)，250C~28°C下攪拌反應(yīng)20min，真空泵抽干；
(2)將步驟(1)中脫保護后的樹脂按以下順序及次數(shù)進行洗滌，DMF兩次一MeOH(甲醇)三次一DCM (二氯甲烷)三次一DMF兩次，搖床中震蕩洗滌，每次洗滌兩分鐘，洗滌結(jié)束時用真空泵將液體抽干；
(3)第一個氨基酸的添加:按公式I稱取絲氨酸、HoBt(1-羥基苯丙三唑)及DIC (N,N-二異丙基碳二亞胺)的量，分別為 479.25mg、168.9125mg、192.455μ L，先用 3~5mL DMF溶解絲氨酸和HoBt加入合成儀中，然后直接在合成儀中加入DIC，25°C~28°C下攪拌反應(yīng)
2.5h ；
所述公式I為:氨基酸的質(zhì)量=該氨基酸的相對分子質(zhì)量X2.5 (當(dāng)量)X樹脂的質(zhì)
量;
然后洗滌，洗滌方法同步驟(2)中的洗滌要求，即按以下順序及次數(shù)進行洗滌，DMF兩次一MeOH(甲醇)三次一DCM (二氯甲烷)三次一DMF兩次，每次洗滌兩分鐘，搖床中震蕩洗滌,洗滌結(jié)束時用真空泵將液體抽干；
用分光光度計測定波長為290nm處樹脂和第一個氨基酸的吸光度0D，根據(jù)公式計算取代值，加封頭液封頭兩次，每次20min，在搖床中震蕩，然后洗滌，洗滌方法同步驟(2)中的洗滌要求；
取代值計算公示為:取代值=OD/ (1.65Xmwsg), Hiwi為樹脂的質(zhì)量；
(4)第二個氨基酸即蘇氨酸的添加:合成時是從C端到N端方向進行，對步驟(3)中第一個氨基酸添加后樹脂脫保護兩次，方法及步驟同步驟(1)中的脫保護；
然后洗滌，洗滌方法及步驟同步驟(2)中洗滌；
然后挑取樹脂茚檢呈藍色時，按公式2稱取第二個氨基酸蘇氨酸、HoBt、DIC的量，分別為298.125mg、101.3475mg、94.65 μ L，先用3~5mL DMF溶解絲氨酸和HoBt加入合成儀中，然后直接在合成儀中加入DIC，25°C~28°C下攪拌反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后按步驟(2)的方法洗滌樹脂，洗滌結(jié)束后挑取樹脂茚檢呈無色；
所述公式2為:氨基酸的量=該氨基酸的相對分子質(zhì)量(此處為蘇氨酸)X2.5X樹脂的質(zhì)量(此處為0.5) X取代值(此處為步驟(3)中取代值計算結(jié)果)；
(5)后續(xù)氨基酸的添加:后續(xù)氨基酸的添加方法同第二個氨基酸的添加過程，直至加完所有氨基酸；其中茚檢樣品時，顯色要求有所調(diào)整，茚檢時，若前一個氨基酸是脯氨酸、絲氨酸和組氨酸時則茚檢呈紅棕色；
(6)切割多肽:從樹酯上切割多肽，按步驟(1)中的脫保護方法進行兩次；洗滌，洗滌按以下順序及次數(shù)進行洗滌，DMF兩次一MeOH三次一DCM三次一DMF 一次一DCM兩次，每次兩分鐘；
所述切割為，將切割試劑加入合成儀中，攪拌柱攪拌三小時，然后將合成儀中的液體抽入球形燒瓶中，并用DCM沖洗3遍，把球形燒瓶裝在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)I小時；在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加2mLTFA冰切30min ;在球形燒瓶中加入乙醚再蒸發(fā)4飛次，最后加入冰乙醚在冰上靜置30min，白色沉淀即為析出的粗肽；
將含粗肽的乙醚溶液離心2000rpm，2min，得粗肽沉淀，把粗肽在37°C烘箱中烘干，烘干約需3h ；
所述切割 試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，其具體組成配比為:三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、l，2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA4.95mL ；
(7)粗肽純化:利用RP-HPLC純化粗肽，純化體系為:乙腈，I%。；TFA=309T50% ;流速5min/mL,檢測波長是228nm。
[0039]純化后所得精肽即為本發(fā)明ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8，于-80°c保存?zhèn)溆谩?br> [0040]對制備的ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如圖1，符合預(yù)期。
[0041]實施例3
為進一步檢驗親和肽L8的抗腫瘤活性，發(fā)明人以實施例2制備的親和肽L8進一步做了抗腫瘤相關(guān)實驗具體實驗情況如下:
抑瘤率實驗
實驗品種:荷結(jié)腸癌CT26的BABL/c小鼠，小鼠購買于北京華阜康生物科技股份有限公司。
[0042]實驗過程如下:
(O于每只小鼠的右前肢腋下荷IXlO6個瘤細胞，待小鼠的瘤體積達到5(T100mm3時按瘤體積隨機分組，分為4組，分別為L8高劑量組、L8低劑量組、5Fu組(陽性對照組)和生理鹽水組(陰性對照組)，每組6只。
[0043]所述高劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶于生理鹽水配成0.25mg/mL的溶液；所述低劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶于生理鹽水配成0.0625mg/mL的溶液。具體制備時，將ro-1親和肽L8直接溶于生理鹽水后，過濾除菌，_20°C分裝保存，備用。
[0044]5Fu用生理鹽水稀釋到所用劑量(10mg/Kg)后使用，即lmL5Fu原液加19mL生理鹽水稀釋即可。
[0045](2)皮下給藥的方式注射，L8高劑量組按照200(^g/Kg，L8低劑量組按照50(^g/Kg，共給藥?天。
[0046]5Fu組(陽性對照組)和生理鹽水組(陰性對照組)同樣采用皮下注射的給藥方式，注射量為0.2mL。各組每天的上午給藥。實驗期間小鼠自由進食和飲水。
[0047](3)每日測量小鼠體重并記錄，繪制曲線，以檢驗L8毒副作用，結(jié)果如圖2所示；每日測量腫瘤的長(a)短(b)徑，并按公式計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線，結(jié)果如圖3所示，計算公示為:V=1/2X (aXb2)。
[0048]給藥結(jié)束的第二天將小鼠脫頸處死取出腫瘤并稱重，結(jié)果如圖4所示。
[0049]從圖2可以得知，L8給藥組的體重變化在正常范圍內(nèi)，因此，L8肽沒有明顯的毒副作用。
[0050]從圖3、圖4我們可知，L8給藥組的瘤體積和瘤重比陰性對照生理鹽水組都要小，且L8肽的濃度越高，效果越明顯，因此L8肽有一定的抗腫瘤活性。
[0051]生存期實驗
實驗品種:荷B16F10的C57BL/6J小鼠。小鼠購買于北京華阜康生物科技股份有限公司。
[0052]實驗過程如下:
(I)于每只小鼠的右前肢腋下荷5X IO5個瘤細胞，待小鼠的瘤體積達到5(T100mm3時按瘤體積隨機分組，分為4組，分別為L8高劑量組、L8低劑量組、5Fu組(陽性對照組)和生理鹽水組(陰性對照組)，每組6只。
[0053]所述高劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶于生理鹽水配成0.25mg/mL的溶液；所述低劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶于生理鹽水配成0.0625mg/mL的溶液。具體制備時，將ro-1親和肽L8直接溶于生理鹽水后，過濾除菌，-20°C分裝保存，備用。
[0054]5Fu用生理鹽水稀釋到所用劑量(10mg/Kg)后使用，即lmL5Fu原液加19mL生理鹽水稀釋即可。
[0055](2)皮下給藥的方式注射，L8高劑量組按照200(^g/Kg，L8低劑量組按照50(^g/Kg，共給藥9天。實驗期間小鼠自由進食和飲水。
[0056](3)給藥9天后停藥觀察生存期，記錄小鼠的死亡時間。
[0057]實驗結(jié)果如圖5所不,從圖中可以看出，L8妝聞劑量能明顯延長荷瘤小鼠的生存期，直接證明了 L8肽具有抗腫瘤作用。
[0058]現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)表明，PD-1作為一種免疫球蛋白超家族的激活誘導(dǎo)的抑制性受體，PD-1及其配體ro-Ll是T細胞活化過程中一對重要的負性共刺激分子，在誘導(dǎo)T細胞無能和免疫耐受維持方面起著非常重要的作用，并介導(dǎo)了腫瘤免疫耐受和逃逸。本發(fā)明通過固相篩選法進行噬菌體展示十二肽庫的篩選工作時所獲得的ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8，作用目標(biāo)明確，對腫瘤的抑制效果明顯，尤其是對結(jié)腸癌或黑色素瘤的抑瘤效果顯著，且無副作用，能夠明顯提高實驗動物的生存期，因而具有較好的醫(yī)療應(yīng)用前景。PD-1蛋白胞外段親和肽L8的制備方法較為成熟、完善，便于制備相應(yīng)的生物醫(yī)藥制品，因而本發(fā)明具有較好的實際應(yīng)用推廣意義。
【權(quán)利要求】
1.一種ro-1蛋白胞外段的親和肽L8，其特征在于，該親和肽L8的氨基酸序列為:Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser,即:S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S,分子量為 1293.7。
2.權(quán)利要求1所述ro-1蛋白胞外段的親和肽L8在制備抗腫瘤相關(guān)藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤為結(jié)腸癌瘤或黑色素瘤。
3.權(quán)利要求1所述ro-Ι蛋白胞外段的親和肽L8的制備方法，其特征在于，采用Fomc固相多肽合成法制備。
【文檔編號】A61P35/00GK103897036SQ201410110200
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】高艷鋒, 李雯雯, 李國棟, 祁元明, 劉蓓媛 申請人:鄭州大學(xué)