專利名稱：用于治療病毒性疾病的膦酸酯、單膦酸酰胺化物、雙膦酸酰胺化物的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及適用于治療病毒性感染，特別是人乳頭瘤病毒的化合物和組合物及其使用方法。
背景人乳頭瘤病毒(HPV)是世界上最流行的性傳播的傳染病之一。有100多種不同種類的HPV，其中大多數(shù)是無害的。然而，大約有30種是通過性接觸傳播的。一些種類的HPV導(dǎo)致生殖器疣，其在包括陰道、宮頸、外陰(陰道外的區(qū)域)、陰莖和直腸的男人和女人的生殖器區(qū)域以單個(gè)或多個(gè)腫塊出現(xiàn)。不過很多感染了HPV的人并沒有癥狀。
盡管大多數(shù)HPV亞型會(huì)導(dǎo)致良性損害，但某些亞型可以導(dǎo)致更嚴(yán)重的損害。由HPV-16和HPV-18引起的肛殖感染雖然不如由HPV-6和HPV-11引起的常見，但是其最常見地與宮頸和肛門組織中稱為發(fā)育異常的癌變前損害有關(guān)。發(fā)育異常的患者經(jīng)常沒有癥狀，只有在篩查后可能發(fā)現(xiàn)他們的損害。如果不進(jìn)行治療，則高度發(fā)育異?？赡軙?huì)轉(zhuǎn)變成癌組織。輕度損害可能自發(fā)消退，而其他的可能發(fā)展成高度損害。HPV-16和HPV-18最常見地與發(fā)育異常有關(guān)，盡管一些其他的轉(zhuǎn)化性HPV亞型也與發(fā)育異常有關(guān)。最近的研究顯示，高達(dá)89％的HIV陽性同性戀男子會(huì)感染這些危險(xiǎn)性高的HPV亞型。HIV陽性患者還更可能同時(shí)感染多種與危險(xiǎn)性較高的發(fā)育異常進(jìn)程有關(guān)的HPV亞型。
生殖器疣是世界上最常見的性傳播疾病，在17-33歲的人群中最流行。所有生殖器疣中近90％產(chǎn)生的原因是HPV-6和HPV-11，但與腫瘤的生長(zhǎng)幾乎無關(guān)。根據(jù)美國(guó)社會(huì)健康協(xié)會(huì)所說，現(xiàn)在在美國(guó)至少有2千萬人感染了HPV，每年出現(xiàn)550萬性傳播的HPV感染新病例。生殖器疣通常形成無痛發(fā)癢的腫塊，其位于生殖器上或附近，但是不治療的話可能發(fā)展成更大更顯著的菜花樣生長(zhǎng)。與感染生殖器疣的人進(jìn)行性接觸的人大約有三分之二會(huì)在接觸后的3個(gè)月內(nèi)生長(zhǎng)疣。在10-20％生殖器疣的病例中發(fā)生生殖器疣的自發(fā)消退。然而，即使損害消退，生殖器疣的復(fù)發(fā)是常見情況，一年后50％復(fù)發(fā)。難看的損害的結(jié)果是，需要經(jīng)常治療生殖器疣。
最近二十年來的證據(jù)使得人們普遍接受了HPV感染對(duì)于宮頸癌的形成盡管不是充分的卻是必需的觀點(diǎn)。宮頸癌中HPV存在率估計(jì)為99.7％。據(jù)信肛門癌有類似的HPV感染和形成肛門發(fā)育異常之間的關(guān)系，并且肛門癌與子宮癌是同樣的情況。在一項(xiàng)對(duì)HIV陰性的患有肛門癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)88％的肛門癌中有HPV感染。在美國(guó)，2003年預(yù)計(jì)有12200個(gè)宮頸癌新病例和4100個(gè)宮頸癌死者，以及4000個(gè)肛門癌新病例和500個(gè)肛門癌死者。雖然近四十年來由于廣泛篩查而使宮頸癌的發(fā)生率下降，但是肛門癌的發(fā)生率升高。肛門癌發(fā)生率的升高可能部分歸因于HIV感染，因?yàn)镠IV陽性患者比普通人群的肛門癌發(fā)生率更高。在普通人群中肛門癌的發(fā)生率為0.9例/100000人，而在同性戀男性人群中肛門癌的發(fā)生率為35例/100000人，在HIV陽性同性戀男性人群中肛門癌的發(fā)生率為70-100例/100000人。事實(shí)上，由于在感染HIV患者中肛門發(fā)育異常的高發(fā)病率和肛門癌的增長(zhǎng)趨勢(shì)，所以對(duì)于治療在HIV陽性患者中機(jī)會(huì)致病性感染的2003 USPHA/IDSA準(zhǔn)則將包括用于診斷為肛門發(fā)育異常的患者的治療準(zhǔn)則。
對(duì)于HPV沒有已知的治療。有生殖器疣的治療方案，盡管它們即使不進(jìn)行治療也經(jīng)常消失。治療方法取決于諸如生殖器疣的尺寸和部位等因素。在所采用的治療方案中，使用咪喹莫特乳膏、20％的鬼臼樹脂抗有絲分裂劑溶液、0.5％普達(dá)非洛溶液、5％的5-氟尿嘧啶乳膏和三氯乙酸。對(duì)于孕婦不推薦使用鬼臼樹脂或普達(dá)非洛，因?yàn)樗鼈儽黄つw吸收，并可能導(dǎo)致分娩缺陷。5-氟尿嘧啶乳膏也不推薦孕婦使用。小的生殖器疣可以通過冷凍(冷凍破壞法)、灼燒(電烙術(shù))或激光治療而物理去除。對(duì)其他治療無反應(yīng)的大疣可能只能通過手術(shù)去除。已知生殖器疣在物理去除后會(huì)復(fù)發(fā)，在這些情況下使用α-干擾素直接注入這些疣中。然而，α-干擾素是昂貴的，并且其使用不能降低生殖器疣的復(fù)發(fā)率。
因此對(duì)于有效的HPV治療存在未滿足的需求?，F(xiàn)在已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了滿足該需求并且還具有其他益處的化合物。
發(fā)明概述式I的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，
其中Y1A和Y1B獨(dú)立地為Y1；RX1和RX2獨(dú)立地為RX；Y1為＝O、-O(RX)、＝S、-N(RX)、-N(O)(RX)、-N(ORX)、-N(O)(ORX)或-N(N(RX)(RX))；RX獨(dú)立地為R1、R2、R4、W3或保護(hù)基；R1獨(dú)立地為-H或1～18個(gè)碳原子的烷基；R2獨(dú)立地為R3或R4，其中每個(gè)R4獨(dú)立地被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代或者兩個(gè)R2基團(tuán)在碳原子上結(jié)合在一起，形成3～8個(gè)碳的環(huán)，并且該環(huán)可以被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；R3為R3a、R3b、R3c或R3d，條件是，當(dāng)R3連接到雜原子上時(shí)，R3為R3c或R3d；R3a為-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CN、N3、-NO2或-OR4；R3b為＝O、-O(R4)、＝S、-N(R4)、-N(O)(R4)、-N(OR4)、-N(O)(OR4)或-N(N(R4)(R4))；R3c為-R4、-N(R4)(R4)、-SR4、-S(O)R4、-S(O)2R4、-S(O)(OR4)、-S(O)2(OR4)、-OC(R3b)R4、-OC(R3b)OR4、-OC(R3b)(N(R4)(R4))、-SC(R3b)R4、-SC(R3b)OR4、-SC(R3b)(N(R4)(R4))、-N(R4)C(R3b)R4、-N(R4)C(R3b)OR4、-N(R4)C(R3b)(N(R4)(R4))、W3或-R5W3；R3d為-C(R3b)R4、-C(R3b)OR4、-C(R3b)W3、-C(R3b)OW3或-C(R3b)(N(R4)(R4))；R4為-H或1～18個(gè)碳原子的烷基；2～18個(gè)碳原子的烯基或2～18個(gè)碳原子的炔基；R5為1～18個(gè)碳原子的亞烷基、2～18個(gè)碳原子的亞烯基或2～18個(gè)碳原子的亞炔基；W3為W4或W5；W4為R6、-C(R3b)R6、-C(R3b)W5、-SOM2R6或-SOM2W5，其中R6為R4，其中每個(gè)R4被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；W5為碳環(huán)或雜環(huán)，其中W5獨(dú)立地被0～3個(gè)R2基團(tuán)所取代；和M2為0、1或2。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了下式的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中A為 Y1A和Y1B獨(dú)立地為Y1；RX1和RX2獨(dú)立地為RX；Y1為＝O、-O(RX)、＝S、-N(RX)、-N(O)(RX)、-N(ORX)、-N(O)(ORX)或-N(N(RX)(RX))；RX獨(dú)立地為R1、R2、R4、W3或保護(hù)基；R1獨(dú)立地為-H或1～18個(gè)碳原子的烷基；R2獨(dú)立地為R3或R4，其中每個(gè)R4獨(dú)立地被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代或者兩個(gè)R2基團(tuán)在碳原子上結(jié)合在一起，形成3～8個(gè)碳的環(huán)，并且該環(huán)可被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；R3為R3a、R3b、R3c或R3d，條件是，當(dāng)R3連接到雜原子上時(shí)，R3為R3c或R3d；R3a為-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CN、N3、-NO2或-OR4；R3b為＝O、-O(R4)、＝S、-N(R4)、-N(O)(R4)、-N(OR4)、-N(O)(OR4)或-N(N(R4)(R4))；R3c為-R4、-N(R4)(R4)、-SR4、-S(O)R4、-S(O)2R4、-S(O)(OR4)、-S(O)2(OR4)、-OC(R3b)R4、-OC(R3b)OR4、-OC(R3b)(N(R4)(R4))、-SC(R3b)R4、-SC(R3b)OR4、-SC(R3b)(N(R4)(R4))、-N(R4)C(R3b)R4、-N(R4)C(R3b)OR4、-N(R4)C(R3b)(N(R4)(R4))、W3或-R5W3；
R3d為-C(R3b)R4、-C(R3b)OR4、-C(R3b)W3、-C(R3b)OW3或-C(R3b)(N(R4)(R4))；R4為-H或者1～18個(gè)碳原子的烷基、2～18個(gè)碳原子的烯基或2～18個(gè)碳原子的炔基；R5為1～18個(gè)碳原子的亞烷基、2～18個(gè)碳原子的亞烯基或2～18個(gè)碳原子的亞炔基；W3為W4或W5；W4為R6、-C(R3b)R6、-C(R3b)W5、-SOM2R6或-SOM2W5，其中R6為R4，其中每個(gè)R4被0～3個(gè)R3個(gè)基團(tuán)所取代；W5為碳環(huán)或雜環(huán)，其中W5獨(dú)立地被0～3個(gè)R2基團(tuán)所取代；和M2為0、1或2。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供了式I的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中Y1A和Y1B獨(dú)立地為Y1；RX1和RX2獨(dú)立地為RX；Y1為＝O、-O(RX)、＝S、-N(RX)、-N(O)(RX)、-N(ORX)、-N(O)(ORX)或-N(N(RX)(RX))；RX獨(dú)立地為R1、R2、R4、W3或保護(hù)基；R1獨(dú)立地為-H或1～18個(gè)碳原子的烷基；R2獨(dú)立地為R3或R4，其中每個(gè)R4獨(dú)立地被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代或者兩個(gè)R2基團(tuán)在碳原子上結(jié)合在一起，形成3～8個(gè)碳的環(huán)，并且該環(huán)可以被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；R3為R3a、R3b、R3c或R3d，條件是，當(dāng)R3連接到雜原子上時(shí)，R3為R3c或R3d；R3a為-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CN、N3、-NO2或-OR4；R3b為＝O、-O(R4)、＝S、-N(R4)、-N(O)(R4)、-N(OR4)、-N(O)(OR4)或-N(N(R4)(R4))；R3c為-R4、-N(R4)(R4)、-SR4、-S(O)R4、-S(O)2R4、-S(O)(OR4)、-S(O)2(OR4)、-OC(R3b)R4、-OC(R3b)OR4、-OC(R3b)(N(R4)(R4))、-SC(R3b)R4、-SC(R3b)OR4、-SC(R3b)(N(R4)(R4))、-N(R4)C(R3b)R4、-N(R4)C(R3b)OR4、-N(R4)C(R3b)(N(R4)(R4))、W3或-R5W3；R3d為-C(R3b)R4、-C(R3b)OR4、-C(R3b)W3、-C(R3b)OW3或-C(R3b)(N(R4)(R4))；R4為-H或者1～18個(gè)碳原子的烷基、2～18個(gè)碳原子的烯基或2～18個(gè)碳原子的炔基；R5為1～18個(gè)碳原子的的亞烷基、2～18個(gè)碳原子的亞烯基或2～18個(gè)碳原子的亞炔基；W3為W4或W5；W4為R6、-C(R3b)R6、-C(R3b)W5、-SOM2R6或-SOM2W5，其中R6為R4，其中每個(gè)R4被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；W5為碳環(huán)或雜環(huán)，其中W5獨(dú)立地被0～3個(gè)R2基團(tuán)所取代；和M2為0、1或2。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供了式IA的化合物， 其中Y1A和Y1B如上所定義。
本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物，
本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物，
本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物，
本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物，
本發(fā)明實(shí)施方案提供了下式的化合物， 本發(fā)明實(shí)施方案提供了適用作抗增殖藥物的化合物。
本發(fā)明實(shí)施方案提供了適用作細(xì)胞凋亡藥物的化合物。
本發(fā)明實(shí)施方案提供了適用作抗-HPV藥物的化合物。
本實(shí)施方案一方面提供了適用作局部抗-HPV藥物的化合物。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供了含有有效量的式1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
本實(shí)施方案一方面提供了藥物組合物，其中該組合物為凝凝膠組合物。
本實(shí)施方案另一方面提供了藥物組合物，其中該組合物為軟膏組合物。
本發(fā)明實(shí)施方案提供了含有有效量的式1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和有效量的至少一種抗病毒藥物和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
本實(shí)施方案一方面提供了藥物組合物，其中該組合物為凝凝膠組合物。
本實(shí)施方案另一方面提供了藥物組合物，其中該組合物為軟膏組合物。
定義術(shù)語“PMEG”是指化合物9-(2-膦酰基甲氧基乙基)鳥嘌呤， 術(shù)語“PMEDAP”是指化合物9-(2-膦?；籽趸一?-2，6-二氨基嘌呤， 術(shù)語“cprPMEDAP”是指化合物9-(2-膦酰基甲氧基乙基)-2-氨基-6-(環(huán)丙基)嘌呤， “生物利用度”是指藥物活性劑在該藥劑引入軀體后對(duì)于目標(biāo)組織而言可利用的程度。藥物活性劑生物利用度的提高可以為患者提供更有效率和有效的治療，因?yàn)?，?duì)于給定劑量而言，在目標(biāo)組織位置上可以使用更多的藥物活性劑。
術(shù)語“膦酸酯”和”膦酸酯基團(tuán)”包括含亞磷的分子里的官能團(tuán)或部分，所述亞磷1)單鍵鍵合到碳上、2)雙鍵鍵合到雜原子上、3)單鍵鍵合到雜原子上和4)單鍵鍵合到另一個(gè)雜原子上，其中每個(gè)雜原子可以相同或不同。術(shù)語“膦酸酯”和“膦酸酯基”還包括含有與上述亞磷相同氧化態(tài)的亞磷的官能團(tuán)或部分，以及含有前藥部分的官能團(tuán)或部分，所述前藥部分可以從化合物分離，使得該化合物保留具有上述特征的亞磷。例如，術(shù)語“膦酸酯”和“膦酸酯基”包括膦酸、膦酸單酯、膦酸二酯、膦酸酰胺化物(phosphonamidate)和硫代磷酸酯(phosphonthioate)官能團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，術(shù)語“膦酸酯”和“膦酸酯基”包括含亞磷的分子內(nèi)的官能團(tuán)或部分，所述亞磷1)單鍵鍵合到碳上、2)雙鍵鍵合到氧上、3)單鍵鍵合到氧上和4)單鍵鍵合到另一個(gè)氧上，以及含有前藥部分的官能團(tuán)或部分，所述前藥部分可以從化合物分離，使得該化合物保留具有這樣特征的亞磷。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，術(shù)語“膦酸酯”和“膦酸酯基”包括含亞磷的分子內(nèi)的官能團(tuán)或部分，所述亞磷1)單鍵鍵合到碳上、2)雙鍵鍵合到氧上、3)單鍵鍵合到氧或氮上和4)單鍵鍵合到另一個(gè)氧或氮上，以及含有前藥部分的官能團(tuán)或部分，所述前藥部分可以從化合物分離，使得該化合物保留具有這樣特征的亞磷。
測(cè)定化合物在腸胃分泌物替代品中穩(wěn)定性的配方和方法是已知的?；衔镌谶@里定義為在腸胃道中是穩(wěn)定的，當(dāng)在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后低于50摩爾％的被保護(hù)基團(tuán)在腸或胃液替代品中被脫保護(hù)。這樣的化合物適合用于該實(shí)施方案中。注意的是，僅僅因?yàn)樵摶衔飳?duì)腸胃道是穩(wěn)定的并不意味著它們不能在體內(nèi)被水解。前藥一般在消化系統(tǒng)中是穩(wěn)定的，但通常在消化腔、肝臟或其他代謝器官中或者在細(xì)胞內(nèi)部基本上水解成母體藥物。
本發(fā)明化合物在某些情況下還可以以互變異構(gòu)體存在。例如，對(duì)于咪唑、胍、脒和四唑體系可以存在烯-胺互變異構(gòu)體，它們所有可能的互變形式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
文中所用術(shù)語”前藥”是指向生物系統(tǒng)給藥時(shí)，由于自發(fā)化學(xué)反應(yīng)；酶催化的化學(xué)反應(yīng)；光解作用和/或代謝性化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的藥物物質(zhì)，即活性成分的任何化合物。因此前藥是治療活性化合物的共價(jià)修飾類似物或潛在形式。
“前藥部分”是指不穩(wěn)定的官能團(tuán)，其在細(xì)胞內(nèi)部的代謝期間通過水解、酶裂解或者通過一些其他過程從活性抑制化合物中系統(tǒng)性分離出來(Bundgaard，Hans，“Design and Application of Prodrugs”在A Textbook of Drug Designand Development(1991)，P.Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard，Eds.Harwood Academic Publishers，第113-191頁)。對(duì)本發(fā)明膦酸酯前藥化合物具有酶激活機(jī)理的酶包括但不限于，酰胺酶、酯酶、微生物酶、磷脂酶、膽堿酯酶和磷酶(phosphases)。前藥部分可以用來提高溶解性、吸收性和親油性，從而優(yōu)化藥物傳遞、生物利用度和功效。前藥部分可以包括活性代謝物或藥物自身。
示例性前藥部分包括水解敏感的或不穩(wěn)定的酰氧基甲基酯-CH2OC(＝O)R和酰氧基甲基碳酸酯-CH2OC(＝O)OR，其中在這種情況下R為C1-C6烷基、C1-C6取代烷基、C6-C20芳基或C6-C20取代芳基。酰氧基烷基酯首先用作羧酸的前藥策略，然后由Farquhar等人(1983)J.Pharm.Sci.72324以及美國(guó)專利第4816570、No.4968788、No.5663159和No.5792756號(hào)用于磷酸酯和膦酸酯。然后，酰氧基烷基酯被用于穿過細(xì)胞膜傳遞膦酸，并提高口服生物利用度。酰氧基烷基酯的相近變體、烷氧基羰基氧基烷基酯(碳酸酯)作為本發(fā)明組合的化合物中的前藥部分也可以提高口服生物利用度。示例性酰氧基甲基酯是異丙基羰基氧基甲氧基-OCH2OC(＝O)C(CH3)2。示例性酰氧基甲基碳酸酯前藥部分是異丙基羰基氧基甲基碳酸酯HOC(＝O)OCH2OC(＝O)C(CH3)2。
膦酸酯基可以是膦酸酯前藥部分。前藥部分可以對(duì)水解敏感，例如，但不限于，異丙基羰基-氧基甲氧基或異丙基羰基氧基甲基碳酸酯基?；蛘?，前藥部分可以對(duì)酶強(qiáng)化的裂解敏感，例如乳酸酯或膦酸酰胺化物-酯基。
據(jù)報(bào)道，磷的芳基酯基團(tuán)，特別是苯基酯能提高口服生物利用度(DeLombaert等人(1994)J.Med.Chem.37498)。還描述了在磷酸酯鄰位包含羧酸酯的苯基酯(Khamnei和Torrence，(1996)J.Med.Chem.394109-4115)。據(jù)報(bào)道，芐基酯產(chǎn)生母體膦酸。在某些情況下，處于鄰位或?qū)ξ坏娜〈梢源龠M(jìn)水解。具有?；踊蛲榛拥钠S基類似物通過酶，例如酯酶、氧化酶等的作用可以產(chǎn)生酚類化合物，其依次經(jīng)歷芐型C-O鍵裂解而產(chǎn)生磷酸和醌甲基化物中間體。這類前藥的實(shí)例由Mitchell等人(1992)J.Chem.Soc.Perkin Trans.II 2345；Glazier WO 91/19721所描述。還描述了其他芐型前藥，其包含連接至芐型亞甲基的含有羧酸酯的基團(tuán)(Glazier WO 91/19721)。據(jù)報(bào)道，含硫前藥可用于膦酸酯藥物的細(xì)胞內(nèi)傳遞。這些前酯包含乙硫基，其中硫醇基或者被?；セ?，或者與另一個(gè)硫醇基結(jié)合形成二硫化物。二硫化物脫酯或者還原產(chǎn)生游離的硫中間體，其隨后分解成磷酸和環(huán)硫化物(Puech等人(1993)AntiviralRes.，22155-174；Benzaria等人(1996)J.Med.Chem.394958)。環(huán)狀的膦酸酯也被描述為含磷化合物的前藥(Erion等人，美國(guó)專利No.6312662)。
“保護(hù)基”是指屏蔽或改變官能團(tuán)性質(zhì)或者化合物整體性質(zhì)的化合物的部分。在本領(lǐng)域中化學(xué)保護(hù)基和用于保護(hù)/脫保護(hù)的策略是眾所周知的。例如參見Protective Groups in Organic Chemistry，Theodora W.Greene，John Wiley& Sons，Inc.，New York，1991。保護(hù)基經(jīng)常用于屏蔽某些官能團(tuán)的反應(yīng)性，以助于所期望化學(xué)反應(yīng)的效率，例如，按安排和計(jì)劃的方式形成和斷裂化學(xué)鍵。對(duì)化合物官能團(tuán)的保護(hù)除了改變被保護(hù)官能團(tuán)的反應(yīng)性外還改變其他物理性質(zhì)，例如極性、親油性(疏水性)和可以通過常規(guī)分析工具測(cè)量的其他性質(zhì)。被化學(xué)保護(hù)的中間體本身可以是生物活性的或非活性的。
被保護(hù)的化合物在體外和體內(nèi)還可以顯示出改變的、在某些情況下優(yōu)化的性能，例如穿過細(xì)胞膜的通過性和對(duì)酶降解或螯合的耐受性。在這個(gè)角色中，具有預(yù)料的治療效果的被保護(hù)化合物被稱為前藥。
保護(hù)基的另一功能是將母體藥物轉(zhuǎn)化成前藥，因此，母體藥物在前藥在體內(nèi)轉(zhuǎn)化時(shí)被釋放出來。因?yàn)榛钚郧八幙梢员饶阁w藥物更有效地吸收，因此前藥在體內(nèi)可能比母體藥物具有更大的效價(jià)。保護(hù)基或者在化學(xué)中間體情況下在體外除去，或者在前藥情況下在體內(nèi)除去。對(duì)于化學(xué)中間體，脫保護(hù)之后所得產(chǎn)物，例如醇，是生理可接受的并不是特別重要的，不過一般更希望該產(chǎn)物是藥理上無害的。
對(duì)本發(fā)明任意化合物的任何提及還包括提及其生理可接受的鹽。本發(fā)明化合物生理可接受的鹽的實(shí)例包括從合適的堿例如堿金屬(例如鈉)、堿土金屬(例如鎂)、銨和NX4+(其中X為C1-C4烷基)衍生的鹽。氫原子或氨基的生理可接受的鹽包括如下酸的鹽有機(jī)羧酸，例如乙酸、安息香酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、馬來酸、丙二酸、蘋果酸、羥乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸；有機(jī)磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和對(duì)-甲苯磺酸；和無機(jī)酸，例如鹽酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸。羥基化合物生理可接受的鹽包括與適宜陽離子例如Na+和NX4+(其中X獨(dú)立選自H或C1-C4烷基)結(jié)合的所述化合物的陰離子。
文中所用術(shù)語“凝膠”是指由用小無機(jī)粒子構(gòu)成的懸浮液組成或者由較大有機(jī)分子(環(huán)繞并被液體所滲透)所組成的半固體系統(tǒng)。其中凝膠塊由絮狀小粒子組成，凝膠被分類為兩相系統(tǒng)，有時(shí)稱作漿糊。氫氧化鋁凝膠和皂土乳漿是兩相系統(tǒng)的實(shí)例。單相凝膠由均勻分布于液體中的有機(jī)大分子組成，其分布方式使得在分散的大分子和該液體之間無明顯界限。這樣的凝膠實(shí)例是羧甲基纖維素鈉和黃蓍膠。盡管凝膠通常是水性的，但醇和油可以用作連續(xù)相。
文中所用術(shù)語“軟膏”是指供外部涂抹的半固體制劑，其稠度使得它們通過涂抹易于涂敷在皮膚上。它們應(yīng)該是這樣的組合物，當(dāng)被涂敷到身體時(shí)它們軟化但不必熔化。他們作為媒介物用于局部涂敷藥用物質(zhì)，對(duì)皮膚還起到保護(hù)和潤(rùn)膚的作用。
為了治療使用，本發(fā)明化合物活性成分的鹽應(yīng)該是生理可接受的，即，它們將是從生理可接受的酸或堿衍生的鹽。然而，生理上不可接受的酸或堿的鹽也可以有用，例如，用于制備或純化生理可接受的化合物。所有的鹽，不管其是否由生理可接受的酸或堿衍生的，都在本發(fā)明范圍內(nèi)。
“烷基”是包含正構(gòu)、仲、叔或環(huán)狀碳原子的C1-C18烴。實(shí)例是甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正-丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，i-丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正-丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，i-丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，s-丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，t-丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
“烯基”是包含正構(gòu)、仲、叔或環(huán)狀碳原子的具有至少一個(gè)不飽和位，即碳-碳、sp2雙鍵的C2-C18烴。實(shí)例包括但不限于，乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、環(huán)戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“炔基”是包含正構(gòu)、仲、叔或環(huán)狀碳原子的至少一個(gè)不飽和位，即碳-碳、sp三鍵的C2-C18烴。實(shí)例包括但不限于，乙炔基(-C≡CH)和炔丙基(-CH2C≡CH)。
“亞烷基”是指飽和的、支鏈或直鏈或環(huán)狀1-18個(gè)碳原子的烴基，并具有通過從母體烷烴的相同或兩個(gè)不同碳原子上除去兩個(gè)氫原子衍生得到的兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)中心。典型的亞烷基包括但不限于，亞甲基(-CH2-)、1，2-乙基(-CH2CH2-)、1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
“亞烯基”是指不飽和的、支鏈或直鏈或環(huán)狀2-18個(gè)碳原子的烴基，并具有通過從母體烯烴的相同或兩個(gè)不同碳原子上除去兩個(gè)氫原子衍生得到的兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)中心。典型的亞烯基包括但不限于，1，2-乙烯基(-CH＝CH-)。
“亞炔基”是指不飽和的、支鏈或直鏈或環(huán)狀2-18個(gè)碳原子的烴基，并具有通過從母體炔烴的相同或兩個(gè)不同碳原子上除去兩個(gè)氫原子衍生得到的兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)中心。典型的亞炔基包括但不限于，乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
“芳基”是指6-20個(gè)碳原子的單價(jià)芳香烴基，其是通過從母體芳香環(huán)體系的單個(gè)碳原子上除去一個(gè)氫原子而衍生得到的。典型的芳基包括但不限于，從苯、取代苯、萘、蒽、聯(lián)苯基等衍生的基團(tuán)。
“芳烷基”是指其中鍵合到碳原子、一般為末端或sp3碳原子的氫原子之一被芳基所取代的非環(huán)烷基。典型的芳烷基包括但不限于，芐基、2-苯乙烷-1-基、萘甲基、2-萘基乙烷-1-基、萘并芐基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。芳烷基含有6～20個(gè)碳原子，例如，芳烷基的烷基部分，包括烷基、烯基、烯基或炔基，為1～6個(gè)碳原子并且芳基部分為5～14個(gè)碳原子。
“取代烷基”、“取代芳基”和“取代芳烷基”分別是指其中一個(gè)或多個(gè)氫原子分別獨(dú)立地被非氫取代基所替代的烷基、芳基和芳烷基。典型的取代基包括但不限于，-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NRR-S(＝O)2O-、-S(＝O)2OH、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NHR、-S(＝O)R、-OP(＝O)O2RR、-P(＝O)O2RR-P(＝O)(O-)2、-P(＝O)(OH)2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(S)R、-C(O)OR、-C(O)O-、-C(S)OR、-C(O)SR、-C(S)SR、-C(O)NRR、-C(S)NRR、-C(NR)NRR，其中每個(gè)X獨(dú)立地為鹵素F、Cl、Br或I；且每個(gè)R獨(dú)立地為-H、烷基、芳基、雜環(huán)、保護(hù)基或前藥部分。亞烷基、亞烯基和亞炔基也可以類似地被取代。
文中所用“雜環(huán)”例如包括但不限于在Paquette，Leo A.；Principles ofModern Heterocyclic Chemistry(W.A.Benjamin，New York，1968)，特別是第1、3、4、6、7和9章；The Chemistry of Heterocyclic Compounds，A Seriesof Monographs”(John Wiley & Sons，New York，1950至今)，特別是在第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)825566中所描述的這些雜環(huán)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，“雜環(huán)”包括文中所定義的“碳環(huán)”，其中一個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3或4個(gè))碳原子被雜原子(例如O、N或S)所替代。
雜環(huán)的實(shí)例例如包括但不限于吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化的四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫代萘、吲哚基、indolenyl、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、異苯并呋喃基、色烯基、呫噸基、吩噁啉基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、中氮茚基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、1，5-二氮雜萘基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、異苯并二氫吡喃基、苯并二氫吡喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、奎寧環(huán)基、嗎啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基、isatinoyl和雙-四氫呋喃基。
碳鍵合的雜環(huán)例如但不限于鍵合在吡啶的2、3、4、5或6位，噠嗪的3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氫呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，異噁唑、吡唑或異噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，氮雜環(huán)丁烷的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或者異喹啉的1、3、4、5、6、7或者8位。更典型地，碳鍵合的雜環(huán)包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
氮鍵合的雜環(huán)例如但不限于鍵合在氮丙啶、氮雜環(huán)丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1H-吲唑的1位，異吲哚或異二氫吲哚的2位，嗎啉的4位，以及咔唑或β-咔啉的9位。更典型地，氮鍵合的雜環(huán)包括1-氮丙啶基(aziridyl)、1-氮雜環(huán)丁烷基(azetedyl)、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
“碳環(huán)”是指飽和、不飽和或芳香環(huán)，作為單環(huán)具有3～7個(gè)碳原子、作為雙環(huán)具有7～12個(gè)碳原子和作為多環(huán)具有至多約20個(gè)碳原子。單環(huán)狀碳環(huán)具有3～6個(gè)環(huán)原子，更典型地為5或6個(gè)環(huán)原子。雙環(huán)狀碳環(huán)具有7～12個(gè)環(huán)原子，例如排列為雙環(huán)[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]體系，或者排列為雙環(huán)[5，6]或[6，6]體系的9或10個(gè)環(huán)原子。單環(huán)狀碳環(huán)的實(shí)例包括環(huán)丙基(c丙基)、環(huán)丁基(c丁基)、環(huán)戊基(c戊基)、1-環(huán)戊-1-烯基、1-環(huán)戊-2-烯基、1-環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己基、1-環(huán)己-1-烯基、1-環(huán)己-2-烯基、1-環(huán)己-3-烯基、苯基、螺烷基和萘基。
“連接物”或“鍵”是指含有將膦酸酯基共價(jià)連接到藥物上的共價(jià)鍵或鏈或原子基團(tuán)的化學(xué)部分。連接物包括以下部分烷氧基的重復(fù)單元(例如，聚乙烯氧、PEG、聚亞甲基氧)和烷基氨基(例如，聚乙烯氨、JeffamineTM)的重復(fù)單元；和包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二羥乙酸酯、丙二酸酯和己酰胺的二酸酯和酰胺。
文中所用術(shù)語“Aba”是指2-氨基丁酸的二價(jià)部分， 其中連接點(diǎn)由“*”指出。
文中所用術(shù)語“Ala”是指丙氨酸的二價(jià)部分，
其中連接點(diǎn)由“*”指出。
文中所用術(shù)語“Phe”是指丙氨酸二價(jià)部分， 其中連接點(diǎn)由“*”指出。
文中所用術(shù)語”Ala”是指丙氨酸的二價(jià)部分， 其中連接點(diǎn)由“*”指出。
文中所用術(shù)語“POC”是指碳酸羥甲基異丙基酯的二價(jià)部分， 其中連接點(diǎn)由“*”指出。
取代基Y1A和Y1B可使用合并上述二價(jià)氨基酸部分和二價(jià)烷基部分的命名法來描述，例如表80-3中所述。
例如，下式的化合物
可以使用式I的命名法來描述，其中Y1A和Y1B為-N(RX)，其中RX為R2，其中R2為R3d所取代的R4，其中R4為R3d所取代的乙基，此外其中R3d為-C(R3b)OW3，其中R3b為＝O，其中W3為W5，其中W5為碳環(huán)，其中R4為R3d所取代的丙基，其中R3d為-C(R3b)OR4，其中R3b為＝O，并且其中R4為乙基?；蛘撸绫?0-3所示，所述化合物可以以式I來描述，其中Y1A和Y1B為“Aba-Et”，其描述以下部分(其中“*”表示連接點(diǎn))， 其是連接到“Et”(乙基)的“Aba”。
例如，下式的化合物可以使用式I的命名法來描述， 其中Y1A和Y1B為-N(RX)，其中RX為R2，其中R2為R3d所取代的R4，其中R4為R3d所取代的乙基，其中R3d為-C(R3b)OR4，其中R3b為＝O，并且其中R4為正-丙基?；蛘撸绫?0-3所示，所述化合物可以以式I來描述，其中Y1A和Y1B為“Ala-nPr”，其描述以下部分(其中“*”表示連接點(diǎn))， 其是連接到“nPr”(正-丙基)的“Ala”。
術(shù)語“手性的”是指具有鏡像對(duì)子不重疊性質(zhì)的分子，而術(shù)語“非手性的”是指它們的鏡像對(duì)子可重疊的分子。
術(shù)語“立體異構(gòu)體”是指具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)、但是原子或者基團(tuán)的空間排列不同的化合物。
“非對(duì)映異構(gòu)體”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心并且其分子不是互為鏡像的立體異構(gòu)體。非對(duì)映異構(gòu)體具有不同的物理性質(zhì)，例如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、光譜性質(zhì)和反應(yīng)性。非對(duì)映異構(gòu)體的混合物可以借助高分辨率的分析方法例如電泳和色譜法進(jìn)行分離。
“對(duì)映體”是指化合物的兩個(gè)立體異構(gòu)體，它們是彼此非重疊的鏡像。
術(shù)語“治療”或“進(jìn)行治療”在某種程度上涉及疾病或病情，包括預(yù)防疾病或病情出現(xiàn)、抑制疾病或病情、消除疾病或病情和/或緩解疾病或病情的一種或多種癥狀。
術(shù)語“抗增殖”是指用于或傾向于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，例如對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用，或者對(duì)病毒感染細(xì)胞的抗增殖作用。
術(shù)語“細(xì)胞凋亡”是指程序性細(xì)胞死亡的主要類型之一。如本意所示，其是在多細(xì)胞生物中不需要的細(xì)胞的故意自殺過程。與壞死(其是一種由于急性組織損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡形式)不同，細(xì)胞凋亡是在生物體的生命周期內(nèi)以有次序的過程進(jìn)行的，通常帶來優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞死亡類型，其中細(xì)胞使用特定細(xì)胞工具來殺死自身；是一種細(xì)胞自殺機(jī)制，使得多細(xì)胞動(dòng)物能控制細(xì)胞數(shù)量并消除威脅動(dòng)物生存的細(xì)胞。例如當(dāng)細(xì)胞不能修復(fù)地受損害或者感染了病毒時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的刺激可以來自細(xì)胞本身、其周圍的組織或者來自作為免疫系統(tǒng)部分的細(xì)胞，其可以是化學(xué)性、生物性或物理性的。相關(guān)術(shù)語“細(xì)胞凋亡的”是指凋亡的過程。
文中所用的立體化學(xué)定義和協(xié)定通常依照S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley & Sons，Inc.，New York。很多有機(jī)化合物以光學(xué)活性的形式存在，即，它們具有使平面偏振光的平面旋轉(zhuǎn)的能力。在描述光學(xué)活性的化合物時(shí)，前綴D和L或者R和S用來表示分子關(guān)于其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型。前綴d和l或者(+)和(-)用來指明由化合物引起的平面偏振光的旋轉(zhuǎn)方向，(-)或l意指化合物是左旋的。前綴為(+)或d的化合物是右旋的。對(duì)于給定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，除了它們互為鏡像外，這些立體異構(gòu)體是相同的。特定的立體異構(gòu)體還可以被稱為對(duì)映體，這樣的異構(gòu)體的混合物經(jīng)常被稱為對(duì)映體混合物。50∶50的對(duì)映體混合物被稱為外消旋混合物或外消旋物，它們可以出現(xiàn)在化學(xué)反應(yīng)或過程中沒有立體選擇性或立體專一性情況下。術(shù)語“外消旋混合物”和“外消旋物”是指兩個(gè)對(duì)映體類型的等摩爾量混合物，沒有光學(xué)活性。
保護(hù)基在本發(fā)明內(nèi)容中，保護(hù)基包括前藥部分和化學(xué)保護(hù)基。
可以使用通常已知和慣用的保護(hù)基，并任選用于防止合成過程中，即制備本發(fā)明化合物的途徑或方法期間與被保護(hù)基團(tuán)發(fā)生的副反應(yīng)。至于決定要保護(hù)哪些基團(tuán)、何時(shí)加以保護(hù)以及化學(xué)保護(hù)基“PG”的性質(zhì)，在很大程度上取決于所要防止的反應(yīng)的化學(xué)性質(zhì)(例如，酸性、堿性、氧化性、還原性或其他情形)和所要合成的方向。如果化合物被多個(gè)PG取代的話，則PG基團(tuán)不必相同，而且通常也是不相同的。一般而言，PG用來保護(hù)諸如羧基、羥基、硫基或氨基的官能團(tuán)，因此用于預(yù)防副反應(yīng)或者另外用于促進(jìn)合成效率。脫保護(hù)從而產(chǎn)生游離的脫保護(hù)基團(tuán)的順序取決于所要的合成方向以及所要遇到的反應(yīng)條件，可以以技術(shù)人員所決定的任何順序進(jìn)行。
可以保護(hù)本發(fā)明化合物的不同官能團(tuán)。例如，用于-OH基團(tuán)(無論羥基、羧酸、膦酸或其他官能團(tuán))的保護(hù)基包括“成醚或成酯的基團(tuán)”。成醚或成酯的基團(tuán)能夠起到文中所述合成方案中的化學(xué)保護(hù)基的作用。然而，有些羥基和硫基保護(hù)基既不是成醚基團(tuán)也不是成酯基團(tuán)，這點(diǎn)可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，并包括以下所討論的酰胺。
大量羥基保護(hù)基和形成酰胺的基團(tuán)和相應(yīng)的化學(xué)裂解反應(yīng)描述在Protective Groups in Organic Synthesis，Theodora W.Greene(John Wiley& Sons，Inc.，New York，1991，ISBN 0-471-62301-6)(“Greene”)。還參見Kocienski Philip J.；Protecting Groups(Georg Thieme Verlag Stuttgart，New York，1994)，通過引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。特別是第1章，保護(hù)基綜述，第1-20頁，第2章，羥基保護(hù)基，第21-94頁，第3章，二醇保護(hù)基，第95-117頁，第4章，羧基保護(hù)基，第118-154頁，第5章，羰基保護(hù)基，第155-184頁。對(duì)于羧酸、膦酸、膦酸酯、磺酸的保護(hù)基以及酸的其他保護(hù)基參見以下提及的Greene。這樣的基團(tuán)例如包括但不限于酯、酰胺、酰肼等。
成醚和成酯的保護(hù)基成酯的基團(tuán)包括(1)形成膦酸酯的基團(tuán)，例如膦酸酰胺化物酯、硫代磷酸酯、膦酸酯和膦酸雙酰胺化物；(2)形成羧基酯的基團(tuán)，和(3)形成硫酯的基團(tuán)，例如磺酸酯、硫酸酯和亞磺酸酯。
本發(fā)明化合物的膦酸酯部分可以是或者不是前藥部分，即，它們對(duì)于水解或者酶裂解或修飾可以是敏感的或者可以不是敏感的。某些膦酸酯部分在大多數(shù)或者幾乎所有代謝作用條件下是穩(wěn)定的。例如，烷基有兩個(gè)或更多個(gè)碳的膦酸二烷基酯由于緩慢的水解速率而在體內(nèi)具有合適的穩(wěn)定性。
鹽和水合物本發(fā)明組合物任選含有本申請(qǐng)的本發(fā)明化合物的鹽，特別是包含例如Na+、Li+、K+、Ca++和Mg++的藥物可接受的非毒性鹽。這樣的鹽可以包括通過合適的陽離子例如堿金屬和堿土金屬離子或銨和季銨離子與酸陰離子部分結(jié)合而衍生的那些。如果想得到水溶性的鹽，則優(yōu)選單價(jià)鹽。
金屬鹽一般是通過本發(fā)明化合物與金屬氫氧化物進(jìn)行反應(yīng)而制備的。以此方式制備的金屬鹽實(shí)例是包含Li+、Na+和K+的鹽。溶解性較差的金屬鹽可以通過添加合適的金屬化合物而從溶解性較高的鹽溶液中沉淀出來。
此外，鹽可以從某些有機(jī)和無機(jī)酸例如HCl、HBr、H2SO4或有機(jī)磺酸向堿性中心或者向酸性基團(tuán)進(jìn)行酸加成而形成。最后，可以理解，此處的組合物以非離子化以及兩性離子形式含有本發(fā)明化合物，以及與如水合物中的化學(xué)計(jì)算量的水的結(jié)合物。
母體化合物與一個(gè)或多個(gè)氨基酸的鹽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。上述的任何氨基酸都適合，尤其是作為蛋白質(zhì)成分發(fā)現(xiàn)的天然存在的氨基酸，盡管該氨基酸典型地是帶有具有堿性或酸性基團(tuán)的側(cè)鏈的氨基酸，例如賴氨酸、精氨酸或谷氨酸，或者具有中性基團(tuán)的氨基酸，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸。
抑制HPV的方法本發(fā)明另一方面涉及抑制HPV活性的方法，包括用本發(fā)明化合物治療懷疑包含有HPV的樣品的步驟。
本發(fā)明組合物作為HPV的抑制劑、這類抑制劑的中間體，或者具有如下所述的其他用途。
本發(fā)明的治療步驟包括向樣品中加入本發(fā)明組合物，或者它包括向樣品中加入該組合物的前體。該加入步驟包括上述的任何給藥方法。
如果需要，使用本發(fā)明組合物后的HPV活性可以通過任何包括直接和間接檢測(cè)HPV活性的方法來觀察。測(cè)量HPV活性的定量、定性和半定量方法都是可以的。通常使用上述的篩查方法之一，然而，也可以使用任何其他方法，例如觀察活生物體的生理特性。
HPV抑制劑的篩選通過測(cè)量EC50，也就是達(dá)到50％抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物濃度來篩選本發(fā)明化合物和組合物的治療實(shí)用性。在未感染和感染了HPV細(xì)胞中的EC50比例提供了化合物對(duì)病毒感染細(xì)胞選擇性的度量。實(shí)施例中教導(dǎo)了用于獲得這些度量方法的規(guī)程。
藥物制劑和給藥途徑本發(fā)明的化合物是用常規(guī)的載體和賦形劑來配制的，根據(jù)一般實(shí)踐來選擇載體和賦形劑。片劑包含有賦形劑、助流劑、填充劑、粘合劑等。含水制劑以無菌形式制成，當(dāng)希望通過非口服方式傳遞時(shí)一般是等滲的。所有制劑任選含有例如在“Handbook of Pharmaceutical Excipients”(1986)中所提及的賦形劑。賦形劑包括抗壞血酸和其他抗氧化劑、諸如EDTA的螯合劑、諸如糊精的糖類、羥烷基纖維素、羥烷基甲基纖維素、硬脂酸等。制劑的pH范圍為約3～約11，但是通常約為7～10。
本發(fā)明的一種或多種化合物(在本文中，這里稱作活性成分)通過適于所要治療的病情的任何途徑進(jìn)行給藥。合適的途徑包括經(jīng)口、直腸、鼻、局部(包括口腔和舌下)、陰道和胃腸道外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外)等給藥?？梢岳斫猓瑑?yōu)選的途徑可以隨接受者的病情而變化。本發(fā)明化合物的優(yōu)點(diǎn)在于，它們是口服可生物利用的，并且可以是口服給藥的。
雖然對(duì)于活性成分可以單獨(dú)給藥，但它們優(yōu)選作為藥用制劑存在。獸用和人類用的本發(fā)明制劑含有至少一種如上所定義的活性成分，還包括一種或多種可接受的載體和任選的其他治療成分。載體必須是“可接受的”，意指與制劑的其他成分是相容的，并且對(duì)其接受者生理上是無害的。
制劑包括適用于上述給藥途徑的那些。制劑可以以單位劑型便利地存在，并可以通過制藥領(lǐng)域眾所周知的任何方法進(jìn)行制備。技術(shù)和制劑一般在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)中可找到。這樣的方法包括使活性成分與形成一種或多種附加成分的載體結(jié)合的步驟。通常，通過使活性成分均勻且緊密地與液體載體或細(xì)碎的固體載體或者兩者結(jié)合而制得制劑，然后，如果需要的話，將產(chǎn)品成形。
適合于口服給藥的本發(fā)明制劑被制成分離的單元，例如各自含有預(yù)定量活性成分的膠囊、扁囊劑或片劑；被制成粉末或顆粒；被制成水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液；或者被制成水包油型液體乳劑或者油包水型液體乳劑?；钚猿煞诌€可以作為一次性推劑(bolus)、藥糖劑或糊劑存在。
通過壓縮或模壓而制得片劑，任選含有一種或多種附加成分。壓制的片劑是通過在合適的機(jī)器中將自由流動(dòng)形式例如粉末或顆粒的活性成分，任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合進(jìn)行壓縮而制備的。模壓的片劑是通過在合適的機(jī)器中將被惰性液體稀釋劑所潤(rùn)濕的粉末狀活性成分的混合物模壓而成的。片劑可以任選被包衣或劃痕，并且任選進(jìn)行配制，從而從其中提供緩釋或控釋活性成分。
對(duì)于眼睛或其他外部組織例如嘴和皮膚的感染，該制劑優(yōu)選作為局部軟膏或乳膏涂用，所述軟膏或乳膏含有的活性成分量例如，為0.075～20％w/w(包括0.1～20％的活性成分，0.1％w/w的增量，例如0.6％w/w、0.7％w/w等)，優(yōu)選為0.2～15％w/w，最優(yōu)選為0.5～10％w/w。當(dāng)在軟膏中配制時(shí)，活性成分可以與石蠟或水可混溶的軟膏基質(zhì)一起使用。或者，活性成分可以在含有水包油型乳膏基質(zhì)的乳膏中進(jìn)行配制。
如果希望，乳膏基質(zhì)的水相可以包括例如至少30％w/w的多元醇，即具有兩個(gè)或更多羥基的醇，例如丙二醇、丁烷1，3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及其混合物。局部制劑理想地可以包括能增強(qiáng)活性成分通過皮膚或其他受影響部位的吸收性或滲透性的化合物。這樣皮膚滲透增強(qiáng)劑的實(shí)例包括二甲亞砜和有關(guān)類似物。
本發(fā)明乳劑的油相可以從已知成分用已知方法形成。雖然該相可以只含有乳化劑(或者稱為乳化劑)，但理想地該相含有至少一種乳化劑與脂肪或油或者與脂肪和油兩者所形成的混合物。優(yōu)選地，包括親水性乳化劑和起穩(wěn)定劑作用的親脂性乳化劑。還優(yōu)選包括油和脂肪兩者。總之，具有或不具有穩(wěn)定劑的乳化劑形成所謂的乳化蠟，并且該蠟與油和脂肪一起形成所謂的乳化軟膏基質(zhì)，其形成乳膏制劑的油性分散相。
適用于本發(fā)明制劑的乳化劑和乳劑穩(wěn)定劑包括吐溫_60、司盤_80、十八十六醇、苯甲醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
選擇適合于制劑的油或脂肪以達(dá)到所希望的美容性能為準(zhǔn)。乳膏應(yīng)該優(yōu)選為非油脂性、非著色并可洗掉的產(chǎn)品，其具有合適的稠度以防止從管或其他容器中泄漏?？梢允褂弥辨溁蛑ф?、單或二代烷基酯，例如二-異己二酸酯、硬脂酸異十六烷基酯、椰子油脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己基酯或者稱為Crodamol CAP的支鏈酯混合物，后三者是優(yōu)選的酯。這些酯根據(jù)所需要的性能可單獨(dú)使用或組合使用?；蛘撸褂酶呷埸c(diǎn)的脂質(zhì)，例如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其他礦物油。
適于向眼睛局部給藥的制劑還包括滴眼液，其中活性成分溶解或懸浮于合適的載體中，對(duì)于活性成分而言優(yōu)選水性溶劑?；钚猿煞衷谶@些制劑中的濃度優(yōu)選為0.5～20％，有利地為0.5～10％，特別是約1.5％w/w。
適于在口中局部給藥的制劑包括糖錠，其含有在調(diào)味基質(zhì)、通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠中的活性成分；錠劑，其含有在惰性基質(zhì)例如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯膠中的活性成分；和漱口劑，其含有在合適液體載體中的活性成分。
直腸給藥的制劑可以以具有合適基質(zhì)(例如包含可可脂或水楊酸酯)的栓劑形式存在。
適于肺內(nèi)或經(jīng)鼻給藥的制劑的粒徑例如為0.1～500微米(包括0.1到500微米的粒徑，增量為微米，例如0.5、1、30微米、35微米等)，其通過經(jīng)由鼻部通道快速吸入或者通過經(jīng)口吸入進(jìn)行給藥，從而到達(dá)肺泡。合適的制劑包括活性成分的水性或油性溶液。適于氣霧劑或干粉給藥的制劑可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行制備，并且可以與其他治療藥物例如下述用于治療或預(yù)防流感A或B感染的化合物一起傳遞。
適于陰道給藥的制劑可以作為陰道栓劑、棉塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧制劑存在，除了含有活性成分之外還含有本領(lǐng)域已知的適當(dāng)載體。
適于胃腸道外給藥的制劑包括水性和非水性無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得該制劑與想要接受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。
制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在冷凍干燥(凍干的)條件下貯存，只是需要在使用前立刻加入無菌的液體載體，例如注射用水。臨時(shí)注射液和懸浮液從前述種類的無菌粉末、顆粒和片劑制得。優(yōu)選的單位劑量制劑是含有活性成分如上所述的日劑量或單位日亞劑量，或者其合適分量的那些。
應(yīng)該理解的是，除了成分，特別是上述成分之外，考慮到所討論制劑的類型，本發(fā)明的制劑還可以包括本領(lǐng)域常用的其他試劑，例如適于口服給藥的那些制劑可以包括調(diào)味劑。
本發(fā)明還提供了獸用組合物，其含有至少一種以上所定義的活性成分和獸用的載體。
獸用的載體是適用于對(duì)組合物進(jìn)行給藥目的的材料，可以是固體、液體或氣體材料，此外其在獸醫(yī)領(lǐng)域是惰性或可接受的，并且與活性成分相容。這些獸用組合物可以口服、胃腸道外或者通過所希望的任何其他途徑進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的化合物被用于提供包含作為活性成分的一種或多種本發(fā)明化合物的控釋型藥用制劑(“控釋制劑”)，其中活性成分的釋放受到控制和調(diào)整，使得給定的活性成分低頻率給藥，或者改善其藥物動(dòng)力學(xué)或毒性特征。
活性成分的有效劑量至少取決于要治療的病情性質(zhì)、毒性(無論該化合物是否預(yù)防性使用(低劑量)還是抗活性的流感傳染、傳遞方法和藥物制劑，通過臨床醫(yī)生使用常規(guī)劑量逐步上升研究進(jìn)行確定。可以預(yù)計(jì)為，約0.0001～約100mg/kg體重/天；典型的為約0.01～約10mg/kg體重/天；更典型的為約0.01～約5mg/kg體重/天；最典型的為約0.05～約0.5mg/kg體重/天。例如，對(duì)于吸入劑，約70kg體重的成年人每天候選劑量為1mg～1000mg，優(yōu)選為5mg到500mg，可以以單劑量或多劑量形式進(jìn)行服用。
本發(fā)明的活性成分還與其他的活性成分組合使用。這樣的組合是根據(jù)要治療的病情、成分的交叉反應(yīng)性和組合的藥學(xué)性質(zhì)來選擇的。例如，治療呼吸系統(tǒng)的病毒性感染時(shí)，特別是流感感染時(shí)，本發(fā)明的組合物與抗病毒藥(例如金剛烷胺、金剛烷乙胺和病毒唑)、粘液溶解藥、化痰劑、支氣管擴(kuò)張藥、抗生素、退熱藥或止痛藥組合使用。通常，抗生素、退熱藥和止痛藥與本發(fā)明化合物一起給藥。
本發(fā)明化合物的代謝產(chǎn)物本發(fā)明還提供了文中所述化合物在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在一定程度上這些產(chǎn)物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)是新穎的和非顯而易見的。這樣的產(chǎn)物例如可以由所給藥的化合物的氧化、還原、水解、酰胺化、酯化等，主要由于酶解過程而得到。因此，本發(fā)明包括通過包括將本發(fā)明化合物與哺乳動(dòng)物接觸足夠長(zhǎng)時(shí)間以產(chǎn)生其代謝產(chǎn)物的方法所產(chǎn)生的新穎并且非顯而易見的化合物。這樣的產(chǎn)物一般通過如下步驟進(jìn)行鑒別制備用同位素標(biāo)記(例如，C14或H3)的本發(fā)明化合物，將其以可檢測(cè)到的劑量(例如大于約0.5mg/kg)向動(dòng)物例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或向人進(jìn)行胃腸道外給藥，使其進(jìn)行足夠長(zhǎng)時(shí)間的代謝(一般約30秒～30小時(shí))，并從尿、血液或其他生物樣品中分離出其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。這些產(chǎn)物易于分離，因?yàn)樗鼈兪潜粯?biāo)記的(其他的則通過使用能與代謝產(chǎn)物中存活的表位結(jié)合的抗體進(jìn)行分離)。通過常規(guī)方法，例如通過MS或NMR分析來確定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。一般說來，以與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那些常規(guī)藥物代謝研究相同方法來分析代謝產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，只要它們沒有在體內(nèi)被另外發(fā)現(xiàn)，就可以用于本發(fā)明化合物治療性給藥的診斷試驗(yàn)中，即使它們本身不具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性。
本發(fā)明化合物的其他用途本發(fā)明的化合物，或從這些化合物在體內(nèi)通過水解或代謝所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，被用作免疫原或者用來與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而它們作為免疫原性組合物的成分用于制備能與蛋白質(zhì)、化合物或它們的代謝產(chǎn)物特異結(jié)合的抗體，該代謝產(chǎn)物保留有免疫識(shí)別表位(抗體結(jié)合的部位)。因此，該免疫原性組合物適用作抗體制備中的中間體，用于診斷、質(zhì)量控制等方法中，或者用于該化合物或其新穎的代謝產(chǎn)物的測(cè)定中。這些化合物適用于培養(yǎng)抗其他非免疫原性多肽的抗體，因?yàn)樵摶衔镉米鞔碳っ庖邞?yīng)答的半抗原位點(diǎn)，與未修飾的綴合蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)。
有意義的水解產(chǎn)物包括以上所討論的被保護(hù)的酸性和堿性基團(tuán)的水解產(chǎn)物。如上所提及的，含有免疫原性多肽例如白蛋白或鑰孔_形血藍(lán)蛋白的酸性或堿性酰胺一般適用作免疫原。上述的代謝產(chǎn)物可以保留有與本發(fā)明化合物實(shí)質(zhì)程度的交叉反應(yīng)性。因此，本發(fā)明的抗體能夠與未保護(hù)的本發(fā)明化合物結(jié)合，而不與被保護(hù)的本發(fā)明化合物結(jié)合；或者，代謝產(chǎn)物能夠與被保護(hù)的本發(fā)明化合物和/或代謝產(chǎn)物結(jié)合，不與被保護(hù)的本發(fā)明化合物結(jié)合，或者能與任何一個(gè)特異結(jié)合或者與三者全部特異結(jié)合。該抗體理想地基本上不與自然存在的材料進(jìn)行交叉反應(yīng)。物質(zhì)的交叉反應(yīng)性是在特定試驗(yàn)條件下對(duì)于特定分析物足以干擾試驗(yàn)結(jié)果的反應(yīng)性。
本發(fā)明的免疫原包含本發(fā)明的化合物，其具有與免疫原性物質(zhì)相結(jié)合的所希望的表位。在本發(fā)明內(nèi)容中，這樣的結(jié)合是指共價(jià)鍵結(jié)合，以形成免疫原性共軛物(當(dāng)可適用時(shí))或者非共價(jià)鍵結(jié)合物質(zhì)的混合物，或者上述的組合。免疫原性物質(zhì)包括佐劑例如Freund′s佐劑、免疫原性蛋白例如病毒、細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物多肽、特別是鑰孔_形血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，以及免疫原性多糖。通常，具有所希望表位結(jié)構(gòu)的化合物通過使用多官能(一般是雙官能)交聯(lián)劑而共價(jià)綴合到免疫原性多肽或多糖上。用來生產(chǎn)半抗原免疫原的方法本身是常規(guī)方法，任何此前所用的將半抗原綴合到免疫原性多肽等上的方法都適合使用于此，要考慮適用于交聯(lián)的前體或水解產(chǎn)物上的官能團(tuán)以及生產(chǎn)抗免疫原性物質(zhì)的所討論表位的特異抗體的可能性。
通常，多肽綴合到遠(yuǎn)離要識(shí)別的表位的本發(fā)明化合物的位點(diǎn)上。
以常規(guī)方法制備該綴合物。例如，交聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺、琥珀酸酐或alkN＝C＝Nalk適用于制備本發(fā)明的綴合物。該綴合物含有本發(fā)明的化合物，其通過鍵或者1-100個(gè)，通常1-25個(gè)，更特別是1-10個(gè)碳原子的連接基團(tuán)連接到免疫原性物質(zhì)上。使用色譜法等將該綴合物從原料和副產(chǎn)物中分離出來，然后無菌過濾并用小瓶貯存。
通常，將動(dòng)物對(duì)所述免疫原性綴合物或衍生物和以常規(guī)方式制得的抗血清或單克隆抗體進(jìn)行免疫。
本發(fā)明的化合物在制備親和性吸收基體、用于過程控制的固化酶或免疫測(cè)定試劑中適用作連接物或隔離物。此處的化合物包含許多官能團(tuán)，這些官能團(tuán)適合作為用于交聯(lián)所希望物質(zhì)的位點(diǎn)。例如，通常將親合性試劑，例如激素、肽、抗體、藥物等連接到不溶性基質(zhì)上。這些不溶性試劑以已知方式用于從生產(chǎn)得到的制劑、診斷樣品和其他不純凈的混合物中吸收親合性試劑的結(jié)合配偶體。相似地，固化酶用來進(jìn)行用酶易于恢復(fù)的催化轉(zhuǎn)化。雙官能的化合物通常在制備診斷試劑中用來連接分析物至可檢出基團(tuán)上。
篩查試驗(yàn)優(yōu)選使用來自對(duì)HPV感染敏感的特定組織的細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)適用于測(cè)定體內(nèi)的生物利用度，包括腸腔穩(wěn)定性、細(xì)胞滲透、肝臟勻漿穩(wěn)定性和血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)。然而，即使酯、酰胺或其他被保護(hù)的衍生物在體內(nèi)不能轉(zhuǎn)化成游離的羧基、氨基或羥基，但它們?nèi)匀贿m用作化學(xué)中間體。
使用抗增殖試驗(yàn)教導(dǎo)了本發(fā)明的實(shí)用性。抗增殖試驗(yàn)測(cè)量化合物對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞的增殖的作用。在各種濃度化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞7天。在第7天，用染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行著色，并通過分光光度計(jì)測(cè)量著色強(qiáng)度(與細(xì)胞數(shù)量成比例)。將數(shù)據(jù)相對(duì)于化合物濃度制圖，擬合成S型劑量響應(yīng)曲線，從該曲線測(cè)定降低細(xì)胞增殖率50％的化合物濃度(50％有效濃度或EC50)。在抗增殖試驗(yàn)中的活性化合物可以是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的(抑制細(xì)胞分裂)和/或殺細(xì)胞的(殺死細(xì)胞)。通過在HPV陽性癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中進(jìn)行抗增殖試驗(yàn)，我們鑒別出抑制HPV陽性癌細(xì)胞增殖比抑制來自正常人組織細(xì)胞更有效的化合物。
制造本發(fā)明化合物的示例性方法本發(fā)明還涉及制造本發(fā)明組分的方法。該組分是通過任何可用的有機(jī)合成技術(shù)制得的。很多這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然而，多種熟知技術(shù)描述在“Compendium of Organic Synthetic Methods”(John Wiley & Sons，New York)，第1卷，Ian T.Harrison and Shuyen Harrison，1971；第2卷，Ian T.Harrisonand Shuyen Harrison，1974；第3卷，Louis S.Hegedus and Leroy Wade，1977；第4卷，Leroy G.Wade，jr.，1980；第5卷，Leroy G.Wade，Jr.，1984；和第6卷，Michael B.Smith；以及March，J.，“Advanced OrganicChemistry，第三版”，(John Wiley & Sons，New York，1985)，“ComprehensiveOrganic Synthesis.Selectivity，Strategy & Efficiency in Modern OrganicChemistry.第9卷”，Barry M.Trost，主編(Pergamon Press，New York，1993出版)。
以下給出多種用于制備本發(fā)明組分的示例性方法。這些方法是用來說明這些制備法的本質(zhì)，而不是要限制可用方法的范圍。
一般而言，反應(yīng)條件例如溫度、反應(yīng)時(shí)間、溶劑、后處理過程等采用通常在本領(lǐng)域中用于進(jìn)行特定反應(yīng)的那些條件。所引用的參考材料與其中所引用的材料一起都包含這些條件的詳細(xì)描述。通常的溫度為-100℃到200℃，溶劑為非質(zhì)子或質(zhì)子性溶劑，反應(yīng)時(shí)間為10秒到10天。后處理通常包括淬滅任何未反應(yīng)的試劑，然后分配在水/有機(jī)層體系之間(萃取)，并分離含有產(chǎn)物的層。
氧化和還原反應(yīng)通常在接近室溫(約20℃)的溫度下進(jìn)行，不過對(duì)應(yīng)金屬氫化物還原而言，溫度通常降低至0℃到-100℃，還原用的溶劑通常是非質(zhì)子性的，氧化用的溶劑可以是質(zhì)子性的或非質(zhì)子性的。調(diào)節(jié)還原時(shí)間以獲得理想的轉(zhuǎn)化率。
縮合反應(yīng)通常在接近室溫的溫度下進(jìn)行，不過對(duì)于非平衡的、動(dòng)力學(xué)控制的縮合而言，降低的溫度(0℃到-100℃)也是常見的。溶劑可以是質(zhì)子性的(常見于平衡反應(yīng))或非質(zhì)子性的(常見于動(dòng)力學(xué)控制的反應(yīng))。
標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)例如共沸除去反應(yīng)副產(chǎn)物和使用無水反應(yīng)條件(例如惰性氣體環(huán)境)在本領(lǐng)域中是常見的，并可在需要時(shí)進(jìn)行使用。
以下流程給出本發(fā)明化合物的示例性制備方法。這些方法的詳細(xì)描述在以下實(shí)驗(yàn)部分可以找到，并參考特定的流程。
流程流程1
流程2
流程3
流程4
流程5
流程6
流程7
流程8
流程9 流程10
流程11 流程12
流程13
流程14
流程15
流程16
流程17
流程18
流程19
流程20
流程21
流程22
流程23 以下過程中的每種產(chǎn)物在其用于隨后過程中之前任選被分離、分開、和/或純化。
術(shù)語”被處理”、”進(jìn)行處理”、”處理”等，當(dāng)用于化學(xué)過程、規(guī)程或制備方面時(shí)，意指接觸、混合、反應(yīng)、允許反應(yīng)、進(jìn)行接觸，以及本領(lǐng)域中通常用于表示一種或多種化學(xué)實(shí)體以此方式被處理，使得將其轉(zhuǎn)化為一種或多種其他化學(xué)實(shí)體的其他術(shù)語。這意味著“用化合物二處理化合物一”與以下是同義的“允許化合物一與化合物二反應(yīng)”、“使化合物一與化合物二接觸”、“使化合物一與化合物二反應(yīng)”以及有機(jī)合成領(lǐng)域中通常用于合理地表示用化合物二使化合物一被“處理”、“反應(yīng)”、”允許反應(yīng)”等的其他表達(dá)方式。
在化學(xué)處理、規(guī)程或制備方面中，“處理”表示其中有機(jī)化學(xué)品被允許進(jìn)行反應(yīng)的合理和常用方式。如果沒有其他說明，是指正常的濃度(0.01M到10M，通常為0.1M到1M)、溫度(-100℃到250℃，通常為-78℃到150℃，更常見為-78℃到100℃，最常見為0℃到100℃)、反應(yīng)容器(通常為玻璃、塑料、金屬制的)、溶劑、壓力、氣氛(通常是空氣，用于對(duì)氧和水不敏感的反應(yīng)，或者氮?dú)饣驓鍤?，用于?duì)氧或水敏感的反應(yīng))等。使用有機(jī)合成領(lǐng)域已知的相似反應(yīng)的知識(shí)來選擇給定過程中用于“處理”條件和設(shè)備。特別地，有機(jī)合成領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于本領(lǐng)域知識(shí)來合理地選擇條件和設(shè)備預(yù)期它成功進(jìn)行所述過程的化學(xué)反應(yīng)。
對(duì)以上每個(gè)流程的改進(jìn)得到以上制得的具體示例性物質(zhì)的各種類似物。描述合適的有機(jī)合成方法的以上引用的引文可用于這些改進(jìn)中。
在每個(gè)以上示例性的流程中，有利地可以將反應(yīng)產(chǎn)物彼此分離和/或從原料中分離反應(yīng)產(chǎn)物。每步驟或者系列步驟的目標(biāo)產(chǎn)物通過本領(lǐng)域常用技術(shù)被分離和/或純化(以下為分離)到所希望的均化程度。通常這樣的分離包括多相萃取、從溶劑或溶劑混合物進(jìn)行結(jié)晶、蒸餾、升華或色譜法。色譜法可以包括任意數(shù)目的方法，例如包括尺寸排除或離子交換色譜法、高壓、中壓或低壓液相色譜法、小規(guī)模和制備性薄層或厚層色譜法，以及小規(guī)模薄層和急驟色譜法的技術(shù)。
另一類型的分離方法包括用試劑處理混合物，選擇該試劑以結(jié)合至或者以其它方式使目標(biāo)產(chǎn)物、未反應(yīng)的原料、反應(yīng)副產(chǎn)物等可分離。這樣的試劑包括吸附劑或吸收劑，例如活性炭、分子篩、離子交換介質(zhì)等?；蛘?，所述試劑可以是酸(在堿性物質(zhì)情況下)、堿(在酸性物質(zhì)情況下)、結(jié)合試劑，例如抗體、結(jié)合蛋白、選擇性螯合劑，例如冠醚、液/液離子萃取劑(LIX)等。
選擇合適的分離方法取決于所涉及物質(zhì)的本性，例如，蒸餾和升華中的沸點(diǎn)和分子量，色譜法中存在或不存在極性官能團(tuán)，多相萃取中酸性和堿性介質(zhì)中物質(zhì)的穩(wěn)定性，等等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將應(yīng)用最可能實(shí)現(xiàn)所希望的分離的技術(shù)。
以上引用的所有文獻(xiàn)和專利在它們的引用位置確切地通過參考而并入本文。以上引用著作特別引用的部分或頁數(shù)特別地通過引入而并入。本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，足以使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用以下權(quán)利要求的主題。顯然，在本發(fā)明的范圍內(nèi)和精神下可以對(duì)以下權(quán)利要求的方法和組合物進(jìn)行一定的改進(jìn)。以下實(shí)施例用于示范本發(fā)明，而絕不能將其解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例通則多次進(jìn)行某些實(shí)施例。在重復(fù)的實(shí)施例中，反應(yīng)條件如時(shí)間、溫度、濃度等，以及產(chǎn)率在正常的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)。在進(jìn)行了明顯改進(jìn)的重復(fù)性實(shí)施例中，注意結(jié)果與所述的那些結(jié)果明顯不同的這些改進(jìn)。在使用不同原料的實(shí)施例中，注意這些原料。當(dāng)重復(fù)的實(shí)施例涉及化合物的“相應(yīng)的”類似物例如“相應(yīng)的乙基酯”時(shí)，這意指其他還存在的基團(tuán)，在此情況下通常是甲基酯，被認(rèn)為是如所述改性的相同基團(tuán)。
實(shí)施例1到35參見以上流程1到9。
實(shí)施例1乙酰氧基乙氧基甲基氯15L三頸燒瓶裝配有機(jī)械攪拌器、溫度計(jì)、500mL附加的漏斗和吹掃用氬氣。加入在無水Et2O(800mL)中的1，3-二氧戊環(huán)(dioxalane)(140mL，2.00mol)和1.0M ZnCl2/Et2O(7.5mL，0.007mol)。在20分鐘內(nèi)，通過附加的漏斗滴加乙酰氯(157mL，2.20mol)在Et2O(200mL)中的溶液。使用冷水浴維持溫度始終在19-27℃之間。無外部冷卻下持續(xù)攪拌4h，反應(yīng)在20-25℃自加熱約1h。澄清、無色的溶液在氬氣下保持過夜。靜置3天，形成橙色溶液。在rotavap(水泵)上除去Et2O，直到在35℃浴中不再蒸餾。所得的產(chǎn)物的定量化產(chǎn)量為318g(理論產(chǎn)量306g)。
實(shí)施例2膦酸二異丙酯2500mL三頸燒瓶中裝有粗制的氯甲基醚1(317g，2.00mol)。通過附加的漏斗滴加亞磷酸三異丙酯(494mL)，同時(shí)在125℃油浴中加熱，并劇烈攪拌。在干冰冷卻的收集器中經(jīng)短徑頭收集2-氯丙烷餾出液，氬氣覆蓋(blanket)，收集140g餾出液(理論值157g)。亞磷酸酯漂白反應(yīng)成黃色，在125℃油浴中再連續(xù)加熱2h，然后使用真空泵進(jìn)行真空蒸餾。蒸餾出黃色的前餾分(140g，頭135℃，底190℃)，然后改用干凈的收集器。在頭溫度178-187℃(主要是185-187℃)和浴溫度222-228℃的未知真空下收集主餾分。得到258g產(chǎn)物2(從1，3-二氧戊環(huán)計(jì)產(chǎn)率為47％)。
實(shí)施例3醇3用濃HCl(11.2mL，0.112mol)處理2(125g，0.443mol)在純MeOH(440mL)中的溶液，并在氬氣下加熱至回流6h。在rotavap(水泵)上除去MeOH到55℃，剩下115g澄清的油狀物，其與甲苯(2×200mL)共蒸發(fā)。粗產(chǎn)物真空干燥，得到油狀物(102g，96％)。
實(shí)施例4膦酸二異丙酯4用6-氯嘌呤(12.72g，75mmoL)處理三苯基膦(25.57g，97.5mmol)和醇3(18g，75mmol)在DMF(120mL)中的溶液，并冷卻到-15℃。在80分鐘內(nèi)，通過附加的漏斗滴加二異丙基偶氮二羧酸酯(16.68g，82.5mmol)在DMF(50mL)中的溶液。該反應(yīng)混合物在-15℃保持2h，然后加熱到室溫，并再攪拌2h。渾濁的反應(yīng)混合物變?yōu)榱咙S色溶液。在減壓下蒸發(fā)反應(yīng)溶劑，用甲苯(3×)進(jìn)行共蒸發(fā)，并在純化前真空干燥過夜。通過硅膠柱色譜法(5％MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到膦酸二異丙酯(18.52g，63％)，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ7.95(s，1H)，4.70(m，2H)，4.31(m，2H)，3.93(m，2H)，3.73(m，2H)，1.29(m，12H)；31P NMR(CDCl3)δ18.42。
實(shí)施例5膦酸二異丙酯5將4(11.00g，28.08mmol)和環(huán)丙胺(4.86g，85.16mmol)在CH3CN(80mL)中的混合物放入反應(yīng)高壓容器中，并加熱到100℃達(dá)4h。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并在減壓下濃縮。產(chǎn)物分配在15％ MeOH/CH2Cl2(3×)和鹽水之間，用Na2SO4干燥，過濾并濃縮。通過硅膠柱色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到5(10.42g，90％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.59(s，1H)，5.83(寬，s，1H)，4.88(寬，s，2H)，4.70(m，2H)，4.21(m，2H)，3.88(m，2H)，3.72(d，J＝8.4Hz，2H)，3.03(寬，s，1H)，1.28(m，12H)，0.84(m，2H)，0.60(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ18.63。
實(shí)施例6cPrPMEDAP 6用溴三甲基硅烷(21.1mL，160.02mmol)處理5(11.00g，26.67mmol)在無水CH3CN(120mL)中的溶液。通過用鋁箔包裹燒瓶而使反應(yīng)避光。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。在減壓下蒸發(fā)揮發(fā)物。剩余物溶于H2O(250mL)中，并用氫氧化銨將pH調(diào)節(jié)到9。濃縮反應(yīng)混合物，獲得黃色固體。該固體溶于H2O(30mL)，并用10％ HCl將pH調(diào)節(jié)到2。收集細(xì)固體，并真空干燥，得到6(7.88g，90％)，為白色固體。
實(shí)施例7單膦酸鹽酸鹽7將酸6(3.00g，9.15mmol)和DMF(0.1mL)在環(huán)丁砜(9.2mL)中的混合物加熱到70℃。在1h時(shí)間內(nèi)滴加亞硫酰二氯(1.66mL，22.76mmol)。將溫度升高到90℃，加入TMSOPh(1.74mL，9.61mmol)，并攪拌1h。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫過夜。將該反應(yīng)混合物滴加到充分?jǐn)嚢璧?、冰冷丙?100mL)中。產(chǎn)物沉淀出來。在氬氣下過濾固體，用冷丙酮(100mL)洗滌，真空干燥，得到單膦酸鹽酸鹽(3.70g，92％)，為固體。
實(shí)施例8單膦酸酰胺化物8將單膦酸7(0.22g，0.50mmol)、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(0.14g，1.00mmol)和三乙胺(0.21mL，1.50mmol)在吡啶(3mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.39g，1.75mmol)和三苯基膦(0.46g，1.75mmol)在吡啶(2mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(97mg，39％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫。
實(shí)施例9單膦酸酰胺化物9將單膦酸7(0.88g，2.00mmol)、D-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(0.84g，6.00mmol)和三乙胺(0.84mL，6.00mmol)在吡啶(8mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(1.56g，7.00mmol)和三苯基膦(1.84g，7.00mmol)在吡啶(8mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。該產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.40g，41％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫。
實(shí)施例10單膦酸酰胺化物10將單膦酸7(0.88g，2.00mmol)、L-丙氨酸叔丁酯鹽酸鹽(1.31g，6.00mmol)和三乙胺(0.84mL，6.00mmol)在吡啶(8mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(1.54g，7.00mmol)和三苯基膦(1.84g，7.00mmol)在吡啶(8mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.38g，36％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺橙色泡沫。
實(shí)施例11單膦酸酰胺化物11將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(94mg，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(74mg，48％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.61(d，J＝4.2Hz，1H)，7.26-7.08(m，5H)，4.23(m，2H)，4.13(m，2H)，4.09(m，1H)，3.92-3.85(m，4H)，3.03(寬，s，1H)，1.30-1.26(m，3H)，1.24(m，3H)，0.88(m，2H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.94，20.68。
實(shí)施例12單膦酸酰胺化物12將膦酸6(1.50g，4.56mmol)、L-丙氨酸正丙基酯鹽酸鹽(1.59g，9.49mmol)、酚(2.25g，22.80mmol)和三乙胺(10.50mL，54.72mmol)在吡啶(8.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(6.54g，31.92mmol)和三苯基膦(7.32g，31.92mmol)在吡啶(8.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.43g，18％，化合物E，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.61(d，J＝5.1Hz，1H)，7.27-7.09(m，5H)，4.27-4.20(m，2H)，4.16-4.00(m，3H)，3.93-3.82(m，4H)，3.04(寬，s，1H)，1.63(m，2H)，1.30(dd，3H)，0.92(m，3H)，0.89(m，2H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.89，20.66。
實(shí)施例13單膦酸酰胺化物13將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(0.10g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(87mg，55％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，J＝2.1Hz，1H)，7.26-7.09(m，5H)，4.98(m，1H)，4.23(m，2H)，4.06(m，1H)，3.91-3.83(m，4H)，3.04(寬，s，1H)，1.29-1.21(m，9H)，0.89(m，2H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.85，20.68。
實(shí)施例14單膦酸酰胺化物14將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.11g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(80mg，50％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.61(d，J＝4.20Hz，1H)，7.27-7.08(m，5H)；5.93(寬，s，1H)，4.97(寬，s，2H)，4.23(m，2H)，4.10-4.08(m，3H)，3.91-3.84(m，4H)，3.03(寬，s，1H)，1.58(m，2H)，1.34-1.27(m，5H)，0.92-0.89(m，5H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.94，20.68。
實(shí)施例15單膦酸酰胺化物15將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯鹽酸鹽(0.13g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.10g，59％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.59(d，J＝4.20Hz，1H)，7.26-7.08(m，5H)，4.22(m，2H)，4.11(m，1H)，4.06(m，2H)，3.91-3.84(m，4H)，3.01(寬，s，1H)，1.59(m，2H)，1.31-1.27(m，9H)，0.89(m，3H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.94，20.68。
實(shí)施例16單膦酸酰胺化物16將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正辛酯鹽酸鹽(0.15g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.13g，73％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.59(d，J＝4.2Hz，1H)，7.25-7.07(m，5H)，4.22(m，2H)，4.10(m，1H)，4.07(m，2H)，3.90-3.84(m，4H)，3.02(寬，s，1H)，1.59(m，2H)，1.29-1.26(m，13H)，0.88(m，3H)，0.85(m，2H)，0.60(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.96，20.69。
實(shí)施例17單膦酸酰胺化物17將膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽(72mg，0.42mmol)、酚(0.10g，1.05mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(66mg，60％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.61(d，J＝7.2Hz，1H)，7.26-7.08(m，5H)，5.91(寬，s，1H)，4.97(寬，s，2H)，4.22-4.12(m，4H)，4.01-3.81(m，5H)，3.03(寬，s，1H)，1.71-1.60(m，2H)，1.24(m，3H)，0.89(m，2H)，0.84-0.76(m，3H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ22.15，20.93。
實(shí)施例18單膦酸酰胺化物18將膦酸6(1.00g，3.05mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯鹽酸鹽(1.19g，6.09mmol)、酚(1.43g，15.23mmol)和三乙胺(5.10mL，36.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(4.70g，21.32mmol)和三苯在膦(5.59g，21.32mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.7g，42％，化合物G，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，J＝6.60Hz，1H)，7.27-7.04(m，5H)，5.89(寬，s，1H)，4.94(寬，s，2H)，4.22(m，2H)，4.07-3.99(m，3H)，3.91-3.84(m，4H)，3.03(寬，s，1H)，1.70-1.57(m，4H)，1.35(m，2H)，0.92-0.75(m，8H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ22.21，20.95。
實(shí)施例19單膦酸酰胺化物19將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-2-氨基丁酸正辛酯鹽酸鹽(0.15g，0.60mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.13mmol)和三苯基膦(0.56g，2.13mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.12g，64％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.62(d，J＝6.60Hz，1H)，7.25-7.08(m，5H)，4.24-4.21(m 2H)，4.09-4.04(m，2H)，4.00(m，1H)，3.91-3.83(m，4H)，3.01(寬，s，1H)，1.70-1.58(m，4H)，1.27(m，10H)，0.89-0.76(m，8H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ22.22，20.92。
實(shí)施例20單膦酸酰胺化物20將膦酸6(1.5g，4.57mmol)、L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽(2.10g，9.14mmol)、酚(2.15g，22.85mmol)和三乙胺(7.64mL，54.84mmol)在吡啶(8.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(7.05g，31.99mmol)和三苯基膦(8.39g，31.99mmol)在吡啶(7.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到淺黃色固體1.32g，含有約10％雜質(zhì)。該黃色固體(1.32g，2.28mmol)溶于iPrOH(10mL)，并轉(zhuǎn)入熱的富馬酸(0.27g，2.28mmol)iPrOH(30mL)溶液中，并在80℃下攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物逐漸冷卻到室溫，并在0℃收集富馬酸鹽。所得的富馬酸鹽通過從NaHCO3(2×)和EtOAc分配而被中和。用鹽水、H2O洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并濃縮。真空干燥產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.70g，26％，化合物A，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為白色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.54(d，J＝2.4Hz，1H)，7.27-6.98(m，10H)，4.35(m，1H)，4.16(m，2H)，4.08(m，2H)，3.84-3.61(m，3H)，3.33(m，1H)，3.02(寬，s，1H)，2.95-2.87(m，2H)，1.17(m，3H)，0.87(m，2H)，0.61(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.88，21.07。
實(shí)施例21單膦酸酰胺化物21將膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.11g，0.42mmol)、酚(0.10g，1.05mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(30mg，23％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.55(d，J＝2.7Hz，1H)，7.25-6.98(m，10H)，4.36(m，1H)，4.17(m，2H)，4.02(m，2H)，3.83-3.35(m，4H)，3.02(寬，s，1H)，2.94-2.86(m，2H)，1.52(m，2H)，1.29(m，2H)，0.90(m，3H)，0.88(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.85，21.05。
實(shí)施例22單膦酸酰胺化物22將膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸異丁酯鹽酸鹽(0.11g，0.42mmol)、酚(0.10g，1.05mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(65mg，50％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.56(d，J＝3.6Hz，1H)，7.26-6.98(m，10H)，4.40(m，1H)，4.17(m，2H)，3.82(m，2H)，3.75-3.62(m，3H)，3.35(m，1H)，3.04(寬，s，1H)，2.96-2.87(m，2H)，1.83(m，1H)，0.90(m，2H)，0.86(m，6H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.82，21.03。
實(shí)施例23雙膦酸酰胺化物23將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(0.28g，1.80mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(80mg，50％，)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.63(s，1H)，5.88(寬，s，1H)，4.96(寬，s，2H)，4.24-4.16(m，6H)，4.00(m，2H)，3.86(m，2H)，3.72(m，2H)，3.01(寬，s，1H)，1.36(m，6H)，1.26(m，6H)，0.86(m，2H)，0.61(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.63。
實(shí)施例24雙膦酸酰胺化物24將膦酸6(1.00g，3.05mmol)、L-丙氨酸正丙酯鹽酸鹽(3.06g，18.30mmol)和三乙胺(5.10mL，36.50mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(4.70g，21.32mmol)和三苯基膦(5.59g，21.32mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(1.13g，71％，化合物F)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.65(s，1H)，5.92(寬，s，1H)，5.03(寬，s，2H)，4.24(m，2H)，4.10-4.02(m，6H)，3.87(m，2H)，3.73(m，2H)，3.03(寬，s，1H)，1.65(m，4H)，1.37(m，6H)，0.93(m，6H)，0.88(m，2H)，0.63(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.61。
實(shí)施例25雙膦酸酰胺化物25將膦酸6(0.60g，1.83mmol)、L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(1.84g，10.98mmol)和三乙胺(3.06mL，21.96mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(2.82g，12.80mmol)和三苯基膦(3.36g，12.80mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.53g，52％，化合物B)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.65(s，1H)，5.00(m，2H)，4.24(m，2H)，3.97(m，2H)，3.87(m，2H)，3.71(m，2H)，3.01(寬，s，1H)，1.34(m，6H)，1.23(m，12H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.59。
實(shí)施例26雙膦酸酰胺化物26將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.33g，1.82mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(97mg，55％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.63(s，1H)，4.24(m，2H)，4.09(m，4H)，4.01(m，2H)，3.86(m，2H)，3.72(m，2H)，3.01(寬，s，1H)，1.61(m，4H)，1.37(m，10H)，0.93(m，6H)，0.88(m，2H)，0.61(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.59。
實(shí)施例27雙膦酸酰胺化物27將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯鹽酸鹽(0.38g，1.80mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.13g，65％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.62(s，1H)，4.23(m，2H)，4.09(m，4H)，4.01(m，2H)，3.86(m，2H)，3.72(m，2H)，2.99(寬，s，1H)，1.61(m，4H)，1.36-1.29(m，18H)，0.88(m，6H)，0.84(m，2H)，0.60(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.61。
實(shí)施例28雙膦酸酰胺化物28將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正辛酯鹽酸鹽(0.43g，1.80mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.13g，61％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.61(s，1H)，4.21(m，2H)，4.07-4.00(m，6H)，3.84-3.70(m，4H)，2.98(寬，s，1H)，1.60(m，4H)，1.34(m，6H)，1.27(m，20H)，0.87(m，6H)，0.83(m，2H)，0.58(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.63。
實(shí)施例29雙膦酸酰胺化物29將膦酸6(0.70g，2.13mmol)、L-2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽(2.15g，12.80mmol)和三乙胺(3.57mL，25.56mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(3.29g，14.91mmol)和三苯基膦(3.92g，14.91mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.71g，60％，化合物D)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.64(s，1H)，4.24(m，2H)，4.16(m，4H)，3.89-3.87(m，4H)，3.72(d，J＝9.0Hz，2H)，3.01(寬，s，1H)，1.78-1.64(m，4H)，1.26(m，6H)，0.91(m，6H)，0.87(m，2H)，0.61(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.23。
實(shí)施例30雙膦酸酰胺化物30將膦酸6(0.70g，21.32mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯鹽酸鹽(2.50g，12.80mmol)和三乙胺(3.57mL，25.56mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(3.29g，14.91mmol)和三苯基膦(3.92g，14.91mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.40g，31％，化合物C)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.64(s，1H)，4.24(m，2H)，4.11(m，4H)，3.91(m，2H)，3.87(m，2H)，3.71(d，J＝9.0Hz，2H)，3.03(寬，s，1H)，1.79-1.64(m，4H)，1.60(m，4H)，1.37(m，4H)，0.94(m，6H)，0.90(m，6H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.25。
實(shí)施例31雙膦酸酰胺化物31將膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-2-氨基丁酸正辛酯鹽酸鹽(0.33g，1.82mmol)和三乙胺(0.51mL，3.60mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.10mmol)和三苯基膦(0.56g，2.10mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.12g，55％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.64(s，1H)，4.24(m，2H)，4.13-4.05(m，4H)，3.91(m，2H)，3.87-3.72(m，4H)，3.01(寬，s，1H)，1.78-1.65(m，4H)，1.61-1.29(m，24H)，0.91(m，6H)，0.89(m，6H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.20。
實(shí)施例32
雙膦酸酰胺化物32將膦酸6(0.60g，1.82mmol)、L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽(2.51g，10.96mmol)和三乙胺(3.06mL，21.84mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(2.82g，12.74mmol)和三苯基膦(3.36g，12.74mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.53g，43％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.48(s，1H)，7.22-7.06(m，10H)，4.20(m，1H)，4.12(m，4H)，4.09(m，2H)，4.04(m，1H)，3.63(m，2H)，3.33-3.21(m，2H)，3.04-2.78(m，5H)，1.20(m，6H)，0.83(m，2H)，0.58(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.38。
實(shí)施例33雙膦酸酰胺化物33將膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.33g，1.26mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.11g，70％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.51(s，1H)，7.23-7.06(m，10H)，4.23(m，1H)，4.11-4.05(m，7H)，3.65(m，2H)，3.35-3.23(m，2H)，3.01(m，1H)，3.04-2.78(m，4H)，1.57(m，4H)，1.33(m，4H)，0.92(m，6H)，0.86(m，2H)，0.61(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.35。
實(shí)施例34雙膦酸酰胺化物34將膦酸6(70mg，0.21mmol)、L-苯丙氨酸異丁酯鹽酸鹽(0.33g，1.26mmol)和三乙胺(0.36mL，2.52mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.33g，1.47mmol)和三苯基膦(0.39g，1.47mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(78mg，50％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.52(s，1H)，7.24-7.07(m，10H)，4.26(m，1H)，4.11(m，2H)，4.01(m，1H)，3.85(m，4H)，3.66(m，2H)，3.35-3.25(m，2H)，3.07-2.85(m，3H)，2.97-2.79(m，2H)，1.89(m，2H)，0.90(m，12H)，0.89(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.31。
實(shí)施例35cPrPMEDAP的BisPOC 35將膦酸6(0.20g，0.61mmol)和三乙胺(0.42mL，3.01mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)30分鐘。加入POCCl(0.45g，2.92mmol)。反應(yīng)混合物在60℃下攪拌3h，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到cPrPMEDAP的bisPOC(0.13g，39％)，為固體1H NMR(CDCl3)δ7.58(s，1H)，5.66(m，4H)，4.92(m，2H)，4.22(m，2H)，3.90-3.88(m，4H)，3.01(寬，s，1H)，1.81(m，12H)，0.86(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.93。
實(shí)施例36到38參見流程10。
實(shí)施例36雙膦酸酰胺化物37將膦酸36(0.32g，1.00mmol)、L-丙氨酸丁酯鹽酸鹽(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.43g，75％)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例37單膦酸38將二酸36(1.30g，4.10mmol)和DMF(0.1mL)在環(huán)丁砜(35mL)中的混合物加熱到70℃。在1h時(shí)間內(nèi)滴加亞硫酰二氯(0.54mL，7.38mmol)。將溫度升高到90℃，加入TMSOPh(0.75g，4.51mmol)，并攪拌1h。反應(yīng)混合物冷卻到室溫過夜。將該反應(yīng)混合物滴加到充分?jǐn)嚢璧摹⒈浔?100mL)中。產(chǎn)物沉淀出來。過濾固體，并溶于MeOH(40mL)中，用45％ KOH將pH調(diào)節(jié)到3。通過過濾收集固體。進(jìn)一步純化產(chǎn)物，將其溶于MeOH中，用45％ KOH調(diào)節(jié)pH到6，并從冰冷丙酮中結(jié)晶，得到單膦酸(0.20g，12％)，為米色固體。
實(shí)施例38單膦酸酰胺化物39將單膦酸38(0.20g，0.50mmol)、L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(0.17g，1.00mmol)和三乙胺(0.10g，1.00mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.39g，1.75mmol)和三苯基膦(0.46g，1.75mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.14g，54％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例39參見流程11實(shí)施例39雙膦酸酰胺化物41將膦酸40(0.36g，1.00mmol)、L-丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.32g，35％)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例40到56參見流程12到16。
實(shí)施例40雙膦酸酰胺化物43將膦酸42(0.37g，1.00mmol)、L-丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.53g，85％)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例41雙膦酸酰胺化物45將膦酸44(0.55g，2.00mmol)、L-丙氨酸丁酯鹽酸鹽(0.94g，5.20mmol)和三乙胺(0.54g，5.20mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(1.54g，7.00mmol)和三苯基膦(1.84g，7.00mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.48g，45％)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例42單膦酸46將二酸44(10.00g，36.30mmol)和DMF(0.2mL)在環(huán)丁砜(50mL)中的混合物加熱到70℃。在1h時(shí)間內(nèi)滴加亞硫酰二氯(4.72mL，64.70mmol)。將溫度升高到90℃，并加入TMSOPh(6.65g，40.00mmol)，并攪拌1h。將該反應(yīng)混合物冷卻到室溫過夜。將該反應(yīng)混合物滴加到充分?jǐn)嚢璧摹⒈浔?100mL)中。產(chǎn)物沉淀出來。過濾固體并溶于MeOH(40mL)，并用45％ KOH將pH調(diào)節(jié)到3。通過過濾收集固體，并真空干燥，得到單膦酸(12.40g，97％)，為固體。
實(shí)施例43單膦酸酰胺化物47將單膦酸46(1.00g，2.86mmol)、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(0.80g，5.73mmol)和三乙胺(0.58g，5.73mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(2.21g，10.00mmol)和三苯基膦(2.63g，10.00mmol)在吡啶(5.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(0.80g，64％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為淺黃色油狀物。
實(shí)施例44單膦酸酰胺化物48將單膦酸46(0.35g，1.00mmol)、L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(0.34g，2.00mmol)和三乙胺(0.20g，2.00mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(7％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物，含有一些雜質(zhì)。用在熱CH3CN(10mL)中的富馬酸(77mg)處理所得的化合物，并冷卻到室溫。產(chǎn)物沉淀出來，并真空干燥，得到單膦酸酰胺化物的富馬酸鹽(0.13g，22％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為固體。
實(shí)施例45PMEG的芐基醚50將二酸49(0.62g，2.00mmol)和芐基醇(10mL)的混合物在攪拌下冷卻到0℃。分批加入氫化鈉(0.24g，10.00mmol)，在1h內(nèi)將反應(yīng)混合物加熱到100℃。加入額外的芐基醇(20mL)和氫化鈉(0.12g，5.00mmol)。該反應(yīng)在140℃下攪拌1h，并冷卻到室溫。在減壓下蒸發(fā)揮發(fā)物，加入水(50mL)，并用NaOH將pH調(diào)節(jié)為11。產(chǎn)物分配在甲苯(3×)和H2O之間。水相用HCl酸化為pH＝3，并保持0℃過夜。收集產(chǎn)物并真空干燥，得到芐基醚(0.18g，22％)，為褐色固體。
實(shí)施例46單膦酸酰胺化物51將膦酸50(0.13g，0.34mmol)、L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(0.11g，0.68mmol)、酚(0.16g，1.69mmol)和三乙胺(0.28mL，2.03mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.52g，2.37mmol)和三苯基膦(0.62g，2.37mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(50mg，26％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為粘稠油狀物。
實(shí)施例47單膦酸酰胺化物52將單膦酸酰胺化物51(50mg，0.09mmol)和Pd(OH)2/C(50mg)在iPrOH(3mL)中的混合物在室溫下在1大氣壓H2(氣球)下攪拌過夜。反應(yīng)混合物通過硅藻土(celite)塞進(jìn)行過濾，并在減壓下在rotavap上除去溶劑。通過硅膠柱色譜法(5-15％ MeOH/CHCl3)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(40mg，95％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫。
實(shí)施例48雙膦酸酰胺化物54將膦酸53(0.10g，0.35mmol)、L-丙氨酸丁酯鹽酸鹽(0.38g，2.10mmol)和三乙胺(0.58mL，4.20mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.53g，2.45mmol)和三苯基膦(0.64g，2.45mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(15％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(25mg，13％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CD3OD)δ7.82(s，1H)，4.26(m，2H)，4.11(m，4H)，3.94(m，2H)，3.88(m，2H)，3.78(m，2H)，1.61(m，4H)，1.39(m，4H)，1.34(m，6H)，0.95(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ23.39。
實(shí)施例49膦酸二異丙酯55將4(3.00g，7.66mmol)和10％ Pd/C(0.60g)在MeOH(30mL)中的混合物在室溫下在1大氣壓H2(氣球)下攪拌過夜。該反應(yīng)混合物通過硅藻土塞過濾，并在rotavap上除去溶劑。通過硅膠柱色譜法(5％ MeOH/CHCl3)純化粗產(chǎn)物，得到膦酸二異丙酯(2.08g，76％)，為粘稠油狀物，靜置會(huì)固化1H NMR(CDCl3)δ8.72(s，1H)，7.94(s，1H)，4.73(m，2H)，4.33(m，2H)，3.97(m，2H)，3.73(d，J＝8.1Hz，2H)，1.31(m，12H)；31P NMR(CDCl3)δ18.47。
實(shí)施例50膦酸56將膦酸二異丙酯55(0.10g，0.28mmol)溶于CH3CN(1.5mL)中，并冷卻到0℃。加入溴三甲基硅烷(0.18mL，1.40mmol)。該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2h，并升溫到室溫過夜。加入DMF(0.5mL)，以形成溶液，并攪拌2h。加入MeOH并攪拌2h。在減壓下蒸發(fā)揮發(fā)物。將剩余的DMF溶液緩慢加入冰冷CH3CN中，產(chǎn)物沉淀出來。收集固體并真空干燥，得到膦酸(74mg，95％)，為白色固體。
實(shí)施例51雙膦酸酰胺化物57將膦酸56(23mg，0.08mmol)、L-丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(91mg，0.50mmol)和三乙胺(0.14mL，0.96mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.11g，0.56mmol)和三苯基膦(0.12g，0.56mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(17mg，38％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ8.65(s，1H)，7.94(s，1H)，5.20(s，寬，2H)，4.35(m，2H)，4.20-3.92(m，6H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，1.61(m，4H)，1.32(m，8H)，0.96(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ20.70。
實(shí)施例52單膦酸酰胺化物58將膦酸56(20mg，0.07mmol)、L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽(33mg，0.14mmol)、酚(33mg，0.35mmol)和三乙胺(0.12mL，0.84mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.11g，0.56mmol)和三苯基膦(0.12g，0.56mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(13mg，34％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ8.69(d，J＝15.0Hz，1H)，7.84(d，J＝4.2Hz，1H)，7.25-6.97(m，10H)，4.35(m，1H)，4.23(m，2H)，4.08(m，2H)，3.85(m，1H)，3.72(m，1H)，3.73-3.62(m，1H)，3.38(m，1H)，2.95-2.86(m，2H)，1.17(m，3H)；31P NMR(CDCl3)δ21.67，20.84。
實(shí)施例53膦酸二異丙酯59將化合物4(1.00g，2.56mmol)和烯丙基胺(3mL)在CH3CN(3.0mL)中的混合物放入閃爍管中，并加熱到65℃達(dá)5h。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并減壓濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和鹽水中，用Na2SO4干燥，過濾，并濃縮。產(chǎn)物溶于最少量CH3CN中，加入H2O，并凍干，得到膦酸二異丙酯(1.00g，95％)。
實(shí)施例54
膦酸60將膦酸二異丙酯59(1.00g，2.43mmol)溶于CH3CN(1.5mL)中，并冷卻到0℃。加入溴三甲基硅烷(0.31mL，12.15mmol)。該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2h，并升溫到室溫過夜。加入DMF(0.5mL)以形成溶液，并攪拌2h。加入MeOH并攪拌2h。在減壓下蒸發(fā)揮發(fā)物。將剩余的DMF溶液緩慢加入冰冷CH3CN中，產(chǎn)物沉淀出來。收集固體并真空干燥，得到膦酸(0.48g，60％)，為白色固體。
實(shí)施例55單膦酸酰胺化物61和雙膦酸酰胺化物62將二酸60(0.40g，1.20mmol)、L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(0.49g，2.40mmol)、酚(0.68g，7.20mmol)和三乙胺(1.0mL，7.20mmol)在吡啶(3.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(1.84g，8.40mmol)和三苯基膦(2.20g，8.40mmol)在吡啶(3.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(5-10％MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物61(0.52g，37％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)和雙膦酸酰胺化物62(0.13g，20％)。
實(shí)施例56雙膦酸酰胺化物63將膦酸60(0.33g，1.00mmol)、L-丙氨酸丁酯鹽酸鹽(0.47g，2.60mmol)和三乙胺(0.27g，2.60mmol)在吡啶(5.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.77g，3.50mmol)和三苯基膦(0.92g，3.50mmol)在吡啶(2.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠柱色譜法(10％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(0.32g，55％)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例57涉及流程17。
實(shí)施例576-烯丙基PMEDAP的BisPOC 64將膦酸60(0.20g，0.61mmol)和三乙胺(0.42mL，3.01mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)30分鐘。加入POCCl(0.45g，2.92mmol)。該反應(yīng)混合物在60℃下攪拌3h，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到6-烯丙基PMEDAP的bisPOC 64(0.11g，32％，GS 192727)，為固體1H NMR(CDCl3)δ7.60(s，1H)，6.00(m，1H)，5.66(m，4H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.92(m，2H)，4.80(s，2H)，4.22(m，4H)，3.95(m，4H)，1.35(m，12H)；31P NMR(CDCl3)δ20.94。
實(shí)施例58到61涉及流程18。
實(shí)施例58雙膦酸酰胺化物65將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(0.1g，0.65mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(23mg，41％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.70(s，1H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.30(m，4H)，4.20-4.00(m，6H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.42(m，1H)，3.22(m，1H)，1.45-1.25(m，12H)；31P NMR(CDCl3)δ 20.77。
實(shí)施例59雙膦酸酰胺化物66將膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸環(huán)丁酯鹽酸鹽(0.33g，0.91mmol)和三乙胺(0.50mL，3.59mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(45mg，26％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(s，1H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，5.00(m，2H)，4.78(s，2H)，4.30(m，4H)，4.00(m，2H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.38(m，1H)，3.19(m，1H)，2.38(m，4H)，2.10(m，4H)，1.85-1.60(m，4H)，1.45(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ20.61。
實(shí)施例60雙膦酸酰胺化物67將膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯鹽酸鹽(0.25g，1.21mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(80mg，41％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.65(s，1H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.80(s，2H)，4.25(m，4H)，4.20-4.00(m，6H)，3.85(m，2H)，3.72(m，2H)，3.42(m，1H)，3.20(m，1H)，1.70(m，4H)，1.32(m，18H)，0.96(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ20.61。
實(shí)施例61雙膦酸酰胺化物68將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯鹽酸鹽(0.13g，0.64mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(32mg，49％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.68(s，1H)，6.00(m，1H)，5.70(s，寬，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，4.80(s，2H)，4.25(m，4H)，4.20-4.05(m，6H)，3.89(m，2H)，3.72(m，2H)，3.35(m，1H)，3.15(m，1H)，1.86-1.60(m，8H)，1.40(m，4H)，0.96(m，12H)；31P NMR(CDCl3)δ21.25。
實(shí)施例62到71涉及流程19。
實(shí)施例62雙膦酸酰胺化物69將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽(0.15g，0.65mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入以上反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(28mg，39％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.58(s，1H)，7.28-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.25-4.00(m，8H)，3.65(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.15-2.77(m，6H)，1.23(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ20.34。
實(shí)施例63雙膦酸酰胺化物70將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(0.15g，0.58mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(49mg，63％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.58(s，1H)，7.28-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.70(s，寬，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(s，2H)，4.25-4.03(m，8H)，3.65(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.17-2.78(m，6H)，1.61(m，4H)，1.32(m，4H)，0.96(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ20.35。
實(shí)施例64雙膦酸酰胺化物71將膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-苯丙氨酸異丁酯鹽酸鹽(0.31g，1.20mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.44g，2.00mmol)和三苯基膦(0.53g，2.00mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(94mg，42％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.55(s，1H)，7.27-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.70(s，寬，1H)，5.25(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(s，2H)，4.25-4.08(m，4H)，3.87(m，4H)，3.65(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.17-2.78(m，6H)，1.97(m，2H)，0.96(m，12H)；31P NMR(CDCl3)δ20.31。
實(shí)施例65單膦酸酰胺化物72將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(32mg，0.20mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(12mg，22％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.62(d，1H)，7.30-7.04(m，5H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，4.30-4.05(m，7H)，3.90-3.80(m，4H)，1.23(m，6H)；31PNMR(CDCl3)δ21.89，20.65。
實(shí)施例66單膦酸酰胺化物73將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(39mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(16mg，28％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.61(d，1H)，7.32-7.06(m，5H)，6.00(m，1H)，5.80(s，寬，1H)，5.30(dd，1H)，5.20(dd，1H)，4.80(m，2H)，4.30-4.05(m，7H)，3.90-3.80(m，4H)，3.90-3.60(m，2H)，1.60(m，2H)，1.32(m，5H)，0.96(m，3H)；31P NMR(CDCl3)δ21.96，20.70。
實(shí)施例67
單膦酸酰胺化物74將膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸環(huán)丁酯鹽酸鹽(0.11g，0.61mmol)、酚(0.13g，1.39mmol)和三乙胺(0.5mL，3.59mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(28mg，17％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，5H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.18(dd，1H)，5.00(m，2H)，4.79(d，2H)，4.28-4.05(m，4H)，3.90(m，4H)，3.70(m，1H)，3.57(m，1H)，2.30(m，2H)，2.00-1.60(m，4H)，1.25(m，3H)；31P NMR(CDCl3)δ21.91，20.64。
實(shí)施例68單膦酸酰胺化物75將膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸正己酯鹽酸鹽(0.13g，0.61mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)的混合物中加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間，用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(28mg，16％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，5H)，6.00(m，1H)，5.85(s，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.35-4.05(m，7H)，3.90(m，4H)，3.70(m，1H)，1.60(m，2H)，1.30(m，9H)，0.96(m，3H)；31P NMR(CDCl3)δ21.97，20.69。
實(shí)施例69到72涉及流程21。
實(shí)施例69單膦酸酰胺化物76將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-2-氨基丁酸正丁酯鹽酸鹽(42mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(17mg，29％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，5H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.30-4.03(m，7H)，3.95-3.80(m，4H)，3.62(m，1H)，3.40(m，1H)，1.80-1.60(m，4H)，1.38(m，2H)，0.98-0.75(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ22.26，20.95。
實(shí)施例70單膦酸酰胺化物77將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽(48mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(14mg，23％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.80(m，2H)，4.40-4.08(m，7H)，3.85-3.65(m，4H)，3.38-3.25(m，2H)，2.95-2.86(m，2H)，1.20(m，3H)；31P NMR(CDCl3)δ21.86，21.06。
實(shí)施例71單膦酸酰胺化物78將膦酸60(35mg，0.11mmol)、L-苯丙氨酸正丁酯鹽酸鹽(55mg，0.21mmol)、酚(50mg，0.53mmol)和三乙胺(0.2mL，1.43mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.16g，0.74mmol)和三苯基膦(0.20g，0.75mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(18mg，28％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，1H)，7.25-6.97(m，10H)，6.00(m，1H)，5.80(s，寬，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.40-4.03(m，7H)，3.85-3.65(m，4H)，3.45-3.25(m，2H)，2.95-2.86(m，2H)，1.57(m，2H)，1.30(m，2H)，0.96(m，3H)；31P NMR(CDCl3)δ21.89，21.09。
實(shí)施例72單膦酸酰胺化物79將膦酸60(0.10g，0.30mmol)、L-苯丙氨酸異丁酯鹽酸鹽(0.16g，0.61mmol)、酚(0.14g，1.52mmol)和三乙胺(0.7mL，5.02mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(19mg，10％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(d，1H)，7.25-7.03(m，10H)，6.00(m，1H)，5.30(dd，1H)，5.17(dd，1H)，4.78(d，2H)，4.45(m，1H)，4.35-4.18(m，4H)，3.95-3.60(m，5H)，3.35(m，1H)，3.00-2.83(m，2H)，1.85(m，1H)，0.96(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ21.90，21.07。
實(shí)施例73到76涉及流程22。
實(shí)施例73單膦酸酰胺化物80將單膦酸6(0.10g，0.30mmol)、L-丙氨酸環(huán)丁酯鹽酸鹽(0.11g，0.61mmol)、酚(0.13g，1.4mmol)和三乙胺(0.51mL，3.67mmol)在吡啶(2mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.14mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)，然后通過Gilson HPLC純化法(CH3CN/H2O)純化粗產(chǎn)物，得到單膦酸酰胺化物(33mg，20％，1∶1非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，為米色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(s，1H)，7.30-7.03(m，5H)，5.80(s，寬，1H)，5.00(m，1H)，4.80(d，2H)，4.28-4.05(m，3H)，3.90(m，4H)，3.03(s，寬，1H)，2.35(m，2H)，2.05(m，2H)，1.80(m，2H)，1.30(m，3H)，0.90(m，2H)，0.62(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ21.91，20.61。
實(shí)施例74雙膦酸酰胺化物81將膦酸6(60mg，0.18mmol)、L-丙氨酸環(huán)丁酯鹽酸鹽(0.13g，0.72mmol)和三乙胺(0.31mL，2.16mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.28g，1.26mmol)和三苯基膦(0.34g，1.26mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(30mg，28％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.60(s，1H)，5.70(s，1H)，5.00(m，2H)，4.90(s，2H)，4.25(m，2H)，4.00(m，2H)，3.90(m，2H)，3.78(m，2H)，3.40(m，1H)，3.21(m，1H)，3.03(s，寬，1H)，2.35(m，4H)，2.05(m，4H)，1.90-1.65(m，4H)，1.32(m，6H)，0.90(m，2H)，0.60(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.70。
實(shí)施例75雙膦酸酰胺化物82將膦酸6(60mg，0.18mmol)、L-丙氨酸環(huán)戊酯鹽酸鹽(0.13g，0.72mmol)和三乙胺(0.31mL，2.16mmol)在吡啶(1.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.28g，1.26mmol)和三苯基膦(0.34g，1.26mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(30mg，27％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.62(s，1H)，5.72(s，1H)，5.20(m，2H)，4.80(s，2H)，4.25(m，2H)，4.04-3.88(m，4H)，3.74(m，2H)，3.40(m，1H)，3.23(m，1H)，3.03(s，寬，1H)，1.95-1.58(m，16H)，1.37(m，6H)，0.90(m，2H)，0.60(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.64。
實(shí)施例76雙膦酸酰胺化物83將膦酸6(40mg，0.12mmol)、L-苯丙氨酸環(huán)丁酯鹽酸鹽(0.13g，0.48mmol)和三乙胺(0.20mL，1.44mmol)在吡啶(0.5mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.19g，0.85mmol)和三苯基膦(0.22g，0.85mmol)在吡啶(0.5mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過硅膠色譜法(5％ MeOH/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(20mg，22％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.50(s，1H)，7.28-7.05(m，10H)，5.72(s，1H)，5.00(m，2H)，4.90(s，2H)，4.23-4.03(m，4H)，3.68(m，2H)，3.42-3.19(m，2H)，3.15-2.82(m，7H)，2.38(m，4H)，2.00(m，4H)，1.85-1.55(m，4H)，0.90(m，2H)，0.60(m，2H)；31P NMR(CDCl3)δ20.31。
實(shí)施例77和78涉及流程23。
實(shí)施例77膦酸二異丙酯84將4(5.0g，12.82mmol)和三氟乙基胺(6.35g，64.10mmol)在CH3CN(40mL)中的混合物被放入反應(yīng)高壓容器中，并加熱到80℃達(dá)4h。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并減壓濃縮。產(chǎn)物分配在15％ MeOH/CH2Cl2(3×)和鹽水中，用Na2SO4干燥，過濾，并濃縮。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)，然后通過Gilson HPLC純化法(CH3CN/H2O)純化粗產(chǎn)物，得到84(3.26g，56％)，為淺黃色泡沫。
實(shí)施例78雙膦酸酰胺化物85將膦酸42(0.11g，0.29mmol)、L-丙氨酸環(huán)丁酯鹽酸鹽(0.31g，1.75mmol)和三乙胺(0.52mL，3.67mmol)在吡啶(2.0mL)中的混合物加熱到60℃達(dá)5分鐘。將aldrithiol(0.47g，2.12mmol)和三苯基膦(0.56g，2.12mmol)在吡啶(1.0mL)中的新制得的亮黃色溶液加入上述反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)在60℃下攪拌過夜，冷卻到室溫，并濃縮。產(chǎn)物分配在EtOAc和飽和的NaHCO3之間。用鹽水洗滌有機(jī)相，用Na2SO4干燥，過濾，并減壓蒸發(fā)。通過ISCO色譜法(2-丙醇/CH2Cl2)純化粗產(chǎn)物，得到雙膦酸酰胺化物(97mg，54％)，為淺黃色泡沫1H NMR(CDCl3)δ7.65(s，1H)，5.90(s，寬，1H)，5.00(m，2H)，4.80(s，2H)，4.35-4.20(m，4H)，4.00(m，2H)，3.87(m，2H)，3.70(d，2H)，3.38(m，1H)，3.20(m，1H)，2.30(m，4H)，2.00(m，4H)，1.90-1.60(m，4H)，1.35(m，6H)；31P NMR(CDCl3)δ20.61。
實(shí)施例79
此實(shí)施例教導(dǎo)用于證明抗增殖活性的試驗(yàn)。
用于抗增殖試驗(yàn)的細(xì)胞類型在抗增殖試驗(yàn)中使用的人類癌細(xì)胞系包括具有三類HPV(HPV-16、HPV-18、HPV-39)的六種宮頸癌細(xì)胞系、一種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系和兩種來自舌的角質(zhì)細(xì)胞癌。所測(cè)試的正常人類細(xì)胞包括皮膚角質(zhì)細(xì)胞、宮頸角質(zhì)細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。皮膚角質(zhì)細(xì)胞和宮頸角質(zhì)細(xì)胞從Cambrex(East Rutherford，NJ)獲得，所有其他細(xì)胞從American Type Culture Collection(Manassas，VA)獲得。表79-1概括了每種細(xì)胞類型的特性和培養(yǎng)條件。
抗增殖試驗(yàn)過程1.細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)燒瓶中分離，計(jì)數(shù)，并制板于96-孔培養(yǎng)板(250-1000個(gè)細(xì)胞/孔，取決于細(xì)胞類型)中。下一天(定義為第0天，細(xì)胞依附于板底部后，一式兩份加入5倍連續(xù)稀釋的化合物。不加化合物和將10μM秋水仙堿(細(xì)胞分裂抑制劑)加入對(duì)照孔中，其分別代表100％增殖和0％增殖。
2.用磺酰羅丹明B使細(xì)胞著色加入化合物后七天，在4℃用10％三氯乙酸處理培養(yǎng)板1小時(shí)，然后用水洗滌。該過程使得來自細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)合到板的底表面。用在1％乙酸中的0.4％磺酰羅丹明B使蛋白質(zhì)著色10分鐘，然后用1％乙酸劇烈洗滌。結(jié)合到板底部的剩余染料溶于10mM Trizma堿中。這產(chǎn)生紫色，使用分光光度計(jì)，通過測(cè)量在510nm波長(zhǎng)的吸光度進(jìn)行量化。
3.數(shù)據(jù)分析從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，產(chǎn)生S形劑量響應(yīng)曲線，并使用Windows用的GraphPad Prism4.01版(GraphPad Software，San Diego California USA)計(jì)算50％有效濃度(EC50)。
表79-1.在抗增殖試驗(yàn)中使用的細(xì)胞類型
*培養(yǎng)基在以下培養(yǎng)基中，在37℃和5％ CO2下，細(xì)胞供養(yǎng)在加濕的培養(yǎng)箱中。
A1用于培養(yǎng)維持的培養(yǎng)基Eagle MEM，含有Earle′s BSS(Cambrex，EastRutherford，NJ)，補(bǔ)加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。
A2用于抗增殖試驗(yàn)的培養(yǎng)基Eagle MEM，含有Earle′s BSS，補(bǔ)加有5％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。
B1用于培養(yǎng)維持的培養(yǎng)基角質(zhì)細(xì)胞-SFM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，補(bǔ)加有0.01mg/mL牛垂體提取物，0.001μg/mL重組表皮生長(zhǎng)因子，100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。
B2用于抗增殖試驗(yàn)的培養(yǎng)基B1和A2的4∶1混合物。
結(jié)果
1.與正常成纖維細(xì)胞相比，酰胺化物前藥在HPV陽性SiHa細(xì)胞中的選擇性抗增殖活性。
目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)能抑制HPV轉(zhuǎn)化的損害生長(zhǎng)而不影響表皮和真皮中正常細(xì)胞(例如角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)的化合物。體外抗增殖試驗(yàn)使用SiHa細(xì)胞和HEL細(xì)胞建立，它們分別作為HPV-轉(zhuǎn)化的損害和正常成纖維細(xì)胞的模型。SiHa細(xì)胞來自由HPV-16感染引起的宮頸中的鱗狀細(xì)胞癌，HEL成纖維細(xì)胞來自正常人的胚胎肺(表79-1)。如表79-2所示，SiHa細(xì)胞中七種酰胺化物前藥的50％有效濃度(EC50)為0.13-3.2nM，而HEL細(xì)胞中的EC50為12-727nM，表明這些化合物抑制SiHa細(xì)胞的增殖比抑制HEL細(xì)胞更有效。HEL/SiHa選擇性指數(shù)(HEL EC50除以SiHa EC50)為72-559(表79-2)。
所有七種酰胺化物前藥產(chǎn)生相同的代謝物，cprPMEDAP。cprPMEDAP進(jìn)一步代謝為PMEG[Compton等人，1999；Haste等人，1999]。這些化合物在SiHa細(xì)胞中的抗增殖EC50遠(yuǎn)高于前藥中的那些值(表79-2)，這表明酰胺化物部分的連接提高了效價(jià)。而且，cprPMEDAP和PMEG的HEL/SiHa選擇性指數(shù)分別為17和4.1(表79-2)，表明前藥比cprPMEDAP具有更好的選擇性，并且cprPMEDAP比PMEG具有更好的選擇性。
已知PMEG被磷酸化為PMEGpp，其起到細(xì)胞DNA聚合酶的鏈終止抑制劑的作用[Compton等人，1999；Haste等人，1999]。在SiHa和HEL細(xì)胞中測(cè)試了四種已知的DNA聚合酶抑制劑(西多福韋、阿糖胞苷、去氧氟尿苷和阿非迪霉素)和具有不同的作用機(jī)理的其他抗癌藥物，包括DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(達(dá)卡巴嗪、橢圓玫瑰樹堿)、DNA烷化劑(阿霉素、米妥蒽醌、博萊霉素、氦芥)和微管蛋白抑制劑(長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷和Indanocine)(表79-2)。這些化合物在SiHa細(xì)胞中的抗增殖EC50不同，一些與所述七種酰胺化物前藥相當(dāng)或者比之更有效。但是，與所述七種酰胺化物前藥相比，所有這些都顯示出差的HEL/SiHa選擇性指數(shù)(0.01-3.98)。
總之，教導(dǎo)了獨(dú)特的一組化合物，它們?cè)贖PV-16陽性SiHa癌細(xì)胞中表現(xiàn)出亞低(sub-low)nM的抗增殖EC50，和當(dāng)與HEL成纖維細(xì)胞相比時(shí)其表現(xiàn)出大于50倍的選擇性。
2.與正常角質(zhì)細(xì)胞相比，酰胺化物前藥在HPV陽性SiHa細(xì)胞中的選擇性抗增殖活性。
為了測(cè)試這些化合物在來自表皮的正常細(xì)胞中的作用，使用從皮膚(PHK)和宮頸(CK)分離的初級(jí)人類角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行抗增殖試驗(yàn)。用所述七種前藥在PHK和CK中獲得的抗增殖EC50低于HEL中的EC50，表明角質(zhì)細(xì)胞比成纖維細(xì)胞更易受影響(表79-2和79-3)。但是，這些前藥和cprPMEDAP的PHK/SiHa和CK/SiHa選擇性指數(shù)仍好于對(duì)照化合物PMEG和DNA聚合酶抑制劑阿糖胞苷(表79-3)。因此，與來自皮膚和宮頸的正常角質(zhì)細(xì)胞相比，所述前藥優(yōu)先抑制HPV-16陽性SiHa細(xì)胞的增殖。
3.在其他HPV陽性細(xì)胞中的抗增殖活性然后在抗增殖試驗(yàn)中，在來自HPV誘導(dǎo)的宮頸癌的五種其他細(xì)胞系(列于表79-1中)中測(cè)試了這七種前藥，數(shù)據(jù)與SiHa數(shù)據(jù)一起顯示在表4中。在SiHa、C-4I和MS751細(xì)胞中，除了化合物C外的所有化合物都表現(xiàn)出亞低nM抗增殖EC50。不過，在CaSki、HeLa和ME-180中，所有化合物的效價(jià)明顯較差，EC50為7.8-410nM。看起來，抗性和HPV類型(16、18或39)或者抗性和轉(zhuǎn)移(來自轉(zhuǎn)移部位的CaSki、MS751和ME180)之間沒有相關(guān)性。對(duì)照化合物阿糖胞苷(DNA聚合酶抑制劑)均勻抑制所有細(xì)胞系，EC50值為94-257nM。
4.HPV陰性癌細(xì)胞中的抗增殖活性為了研究這些化合物對(duì)HPV陰性癌細(xì)胞系的作用，在抗增殖試驗(yàn)中測(cè)試了三種細(xì)胞系(HT-3、SCC4、SCC9，表79-1)。如表79-4所示，與對(duì)照化合物阿糖胞苷相比，所有七種前藥是相當(dāng)?shù)幕蛘弑戎行А?br> 表79-2.與HEL成纖維細(xì)胞相比，HPV16+SiHa細(xì)胞的選擇性抑制
表79-3.與初級(jí)角質(zhì)細(xì)胞相比，HPV16+SiHa細(xì)胞的選擇性抑制
表79-4.在其他HPV陽性和陰性癌細(xì)胞中的抗增殖活性
實(shí)施例80抗增殖試驗(yàn)抗增殖試驗(yàn)測(cè)量化合物對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞增殖的作用?？乖鲋吃囼?yàn)中的活性化合物可以是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的(抑制細(xì)胞分裂)和/或殺細(xì)胞的(殺死細(xì)胞)。通過使用HPV陽性癌細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行抗增殖試驗(yàn)，我們鑒別了與來自正常人組織的細(xì)胞相比，選擇性抑制HPV陽性癌細(xì)胞增殖的化合物。表80-1概括了每種細(xì)胞類型的特性，包括六種由HPV轉(zhuǎn)化的宮頸癌細(xì)胞系、正常人皮膚角質(zhì)細(xì)胞(PHK)和正常肺成纖維細(xì)胞(HEL)。皮膚角質(zhì)細(xì)胞是從Cambrex(EastRutherford，NJ)獲得的。所有其他細(xì)胞從American Type Culture Collection(Manassas，VA)獲得。
用胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)燒瓶中分離，計(jì)數(shù)，并制板于96-孔培養(yǎng)板(250-100個(gè)細(xì)胞/孔，取決于細(xì)胞類型)。下一天(定義為第0天)，一式兩份加入5倍連續(xù)稀釋的化合物。加入化合物后七天，在4℃用10％三氯乙酸處理培養(yǎng)板1小時(shí)，并用水洗滌。該過程使得細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)合到板的底表面。用在1％乙酸中的0.4％磺酰羅丹明B使蛋白質(zhì)著色10分鐘，然后用1％乙酸劇烈洗滌。結(jié)合到板底部的剩余染料溶于10mM Trizma堿中，產(chǎn)生紫色。色強(qiáng)度(與細(xì)胞數(shù)成比例)是通過使用分光光度計(jì)測(cè)量在510nm波長(zhǎng)的吸光度而量化。用沒有進(jìn)行藥物處理的細(xì)胞(＝100％增殖)和用10μM秋水仙堿(細(xì)胞分裂抑制劑)處理的細(xì)胞(＝0％增殖)作對(duì)照物，用于確定抑制％。將抑制％值相對(duì)于化合物濃度作圖，擬合成S形劑量響應(yīng)曲線，從該曲線確定減少細(xì)胞增殖率50％(＝EC50)的化合物濃度。使用Windows用的GraphPad Prism 4.00版(GraphPad Software，San Diego California USA)用于曲線擬合和EC50計(jì)算。
細(xì)胞凋亡試驗(yàn)(半胱天冬酶3誘導(dǎo)方法)半胱天冬酶誘導(dǎo)是一種與細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡有關(guān)的早期事件。半胱天冬酶活性可以使用熒光底物定量檢測(cè)。直接對(duì)細(xì)胞凋亡路徑起作用的化合物可以在較短培養(yǎng)時(shí)間(＜24小時(shí))內(nèi)誘導(dǎo)半胱天冬酶。干擾其他細(xì)胞生理(其最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡)的化合物為了誘導(dǎo)半胱天冬酶可能需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間(＞48小時(shí))。
將10000個(gè)細(xì)胞制板于96-孔培養(yǎng)板中，并用5倍連續(xù)稀釋的化合物培養(yǎng)24、48和72小時(shí)。細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞溶解，根據(jù)生產(chǎn)商的用法說明(半胱天冬酶試驗(yàn)試劑盒，Roche，Indianapolis，IN)，使用熒光底物來測(cè)量細(xì)胞溶解物中半胱天冬酶的活性。
細(xì)胞凋亡試驗(yàn)(膜聯(lián)蛋白V著色方法)磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)部向外部的易位是一種與細(xì)胞凋亡或者程序性細(xì)胞死亡有關(guān)的早期/中間事件。易位的磷脂酰絲氨酸可以通過用FITC-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(一種Ca++依賴性磷脂-結(jié)合蛋白)培養(yǎng)細(xì)胞來檢測(cè)。當(dāng)用膜聯(lián)蛋白-FITC和碘化丙錠(其著色死亡的細(xì)胞)為細(xì)胞著色時(shí)，活細(xì)胞對(duì)兩種染料都呈陰性，死亡的細(xì)胞對(duì)兩者都呈陽性，而細(xì)胞凋亡的細(xì)胞只對(duì)膜聯(lián)蛋白-FITC呈陽性。
用三種不同濃度的化合物培養(yǎng)HPV-16 SiHa細(xì)胞3天或7天，同時(shí)用膜聯(lián)蛋白-FITC和碘化丙錠進(jìn)行著色。通過流式細(xì)胞儀檢查每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的著色。
結(jié)果選擇性抗增殖活性該方法的目的是鑒別抑制HPV轉(zhuǎn)化的損害生長(zhǎng)而不影響表皮和真皮中正常細(xì)胞(例如角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)的化合物。因此，在SiHa、PHK和HEL細(xì)胞中測(cè)試化合物，這些細(xì)胞分別作為HPV-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、正常角質(zhì)細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞的模型。
本發(fā)明的代表性化合物，例如在表80-2中所列舉的那些，在SiHa細(xì)胞中表現(xiàn)出可檢測(cè)水平的抗增殖活性，50％有效濃度(EC50)小于25000nM。也在HEL細(xì)胞中測(cè)試了活性化合物。所有情況下，HEL細(xì)胞中的EC50高于SiHa細(xì)胞中的EC50，表明活性化合物抑制SiHa細(xì)胞增殖比抑制HEL細(xì)胞更有效。其他核苷酸/核苷類似物，例如PMEG(2-膦?；籽趸一B嘌呤)、Ara-C(阿糖胞苷，CAS#147-94-4)和吉西他濱(CAS#95058-81-4)沒有表現(xiàn)出這樣的選擇性。普達(dá)非洛(CAS#518-28-5)，即抗-疣藥物普達(dá)非洛乙醇溶液的活性成分，也沒有表現(xiàn)出選擇性。
本發(fā)明的代表性前藥化合物，例如在表80-3中所列舉的那些，表現(xiàn)出活性。多數(shù)情況下，這些前藥比它們各自的母體化合物更有效，某些情況下更有選擇性。大多數(shù)膦酸酰胺化物前藥比普達(dá)非洛更有活性和選擇性。
總之，鑒定出這些化合物在HPV-16陽性SiHa細(xì)胞中具有亞nM抗增殖EC50，并且當(dāng)與PHK角質(zhì)細(xì)胞或者與HEL成纖維細(xì)胞相比時(shí)具有大于50倍的選擇性。
在其他HPV+細(xì)胞系中的抗增殖活性在五種來自HPV-誘導(dǎo)的宮頸癌的其他細(xì)胞系中也測(cè)試了所選擇的化合物(參見實(shí)施例79和表80-4)。每種化合物在六種HPV+細(xì)胞系中表現(xiàn)出不同水平的活性，不管存在的HPV類型。通常，這些化合物在SiHa(HPV-16)、C-4I(HPV-18)和MS751(HPV-18)細(xì)胞中比在CaSki(HPV-16)、HeLa(HPV-18)和ME-180(HPV-39)細(xì)胞中更有效。
細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(半胱天冬酶3誘導(dǎo)方法)測(cè)試了本發(fā)明代表性化合物對(duì)于SiHa細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)72小時(shí)(實(shí)心條)時(shí)，觀察到明顯的劑量響應(yīng)性半胱天冬酶的誘導(dǎo)，表明該化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖80-1)。48小時(shí)培養(yǎng)(陰影條)的半胱天冬酶誘導(dǎo)不太明顯，24小時(shí)培養(yǎng)(沒有顯示數(shù)據(jù))則沒有觀察到。
細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(膜聯(lián)蛋白V著色方法)使用膜聯(lián)蛋白V-碘化丙錠雙著色法，以三種不同濃度測(cè)試PMEG、N6-環(huán)丙基PMEDAP和本發(fā)明代表性化合物對(duì)SiHa細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。對(duì)所有三種化合物，在第7天比在第3天觀察到更大百分?jǐn)?shù)的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。上述本發(fā)明代表性化合物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中最有效；在第7天，在用0.2μg/m該化合物處理的培養(yǎng)基中63.8％的細(xì)胞是細(xì)胞凋亡的。與之相比，用0.2μg/mL PMEG和0.5μg/mL N6-環(huán)丙基PMEDAP處理的培養(yǎng)基分別只有1.2％和15.9％細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。
表80-1.在抗增殖試驗(yàn)中使用的細(xì)胞類型
*在細(xì)胞DNA中整合的HPV DNA亞型。
**培養(yǎng)基在以下培養(yǎng)基中，在37℃和5％ CO2下，細(xì)胞供養(yǎng)在加濕的培養(yǎng)箱中。
A1用于培養(yǎng)維持的培養(yǎng)基Eagle MEM，含有Earle′s BSS(Cambrex，EastRutherford，NJ)，補(bǔ)加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。
A2用于抗增殖試驗(yàn)的培養(yǎng)基Eagle MEM，含有Earle′s BSS，補(bǔ)加有5％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。
B1用于培養(yǎng)維持的培養(yǎng)基角質(zhì)細(xì)胞-SFM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，補(bǔ)加有0.01mg/mL牛垂體提取物，0.001μg/mL重組表皮生長(zhǎng)因子，100單位/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。
B2用于抗增殖試驗(yàn)的培養(yǎng)基B1和A2的4∶1混合物。
表80-2.N6-取代的PMEDAP在HPV16+SiHa細(xì)胞和HEL成纖維細(xì)胞中的抗增殖活性
表80-3.N6-取代的PMEDAP的膦酸酰胺化物前藥在HPV16+SiHa細(xì)胞、PHK角質(zhì)細(xì)胞和HEL成纖維細(xì)胞中的抗增殖活性

表80-4.N6-環(huán)脯氨酰PMEDAP及其膦酸酰胺化物前藥在六種不同HPV陽性細(xì)胞中的抗增殖活性
實(shí)施例81化合物A和B的兔皮膚刺激研究進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)本發(fā)明的兩種化合物當(dāng)通過皮膚涂抹給予雄兔連續(xù)七天時(shí)產(chǎn)生刺激的可能性。共分配了六只雄兔進(jìn)行研究，如下表所示。
在研究期間，媒介物、陽性對(duì)照物和測(cè)試物每天一次皮膚給藥，共七天。測(cè)試物以濃度0.01、0.03和0.1％給藥。陽性對(duì)照物以濃度0.1％(PMEG)或者1％(Cidofovir_)給藥。所有制劑的給藥體積是固定體積100μL。
每個(gè)動(dòng)物的測(cè)試位點(diǎn)在最初給藥前被剃毛，并在研究期間根據(jù)需要進(jìn)行剃毛。背左側(cè)的兩個(gè)位點(diǎn)被剪短，背右側(cè)的三個(gè)位點(diǎn)被剪短。各給藥處輪廓(各約1平方英寸)以不消去的墨水標(biāo)記。各動(dòng)物的總剪短區(qū)域含有不少于總體表的10％。媒介物和合適陽性對(duì)照物和測(cè)試物在約1平方英寸的給藥位點(diǎn)范圍內(nèi)向各動(dòng)物給藥。媒介物在嘴左側(cè)位點(diǎn)(給藥位點(diǎn)1)給藥，合適陽性對(duì)照物向尾左側(cè)位點(diǎn)(給藥位點(diǎn)2)給藥。合適測(cè)試物如下述進(jìn)行給藥0.01％給藥于嘴右側(cè)位點(diǎn)(給藥位點(diǎn)3)，0.03％給藥于中間右側(cè)位點(diǎn)(給藥位點(diǎn)4)，和0.1％給藥于尾右側(cè)位點(diǎn)(給藥位點(diǎn)5)。給藥后立即將頸放在動(dòng)物上1到2小時(shí)。
在第1天給藥前和以后每天給藥前，各劑量之后約24小時(shí)和下次劑量之前，評(píng)價(jià)位點(diǎn)的紅斑和水腫。給各位點(diǎn)賦予一個(gè)刺激分值，基于用來為皮膚刺激打分的Draize等級(jí)(Draize JH，Woodard G，Calvery HO，Methods for the studyof irritation and toxicity of substances applied topically to the skinand mucous membranes.J Pharmacol Exp Ther 1944；82377-90)。
對(duì)所有動(dòng)物每天兩次觀察死亡率、發(fā)病率以及對(duì)食物和水的利用率。在隨機(jī)選擇前、第1天給藥前以及之后每天給藥前進(jìn)行詳細(xì)臨床檢查。測(cè)量并記錄到達(dá)那天、隨機(jī)選擇前和第1、3和7天給藥前的體重。
通過過量用基于戊巴比妥鈉安樂死溶液靜脈內(nèi)麻醉和通過切斷股血管放血實(shí)行安樂死。仔細(xì)檢查動(dòng)物的外部異常性，包括質(zhì)量(masses)。從腹部中線切口反映皮膚，鑒別任何異常性，并與臨死前發(fā)現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。檢查腹腔、胸腔和顱腔的異常性，并取出該器官、檢查、如果需要，放在中性緩沖的福爾馬林中。收集并保存各動(dòng)物的給藥位點(diǎn)、腎和任何顯著的損害部位。對(duì)于所有動(dòng)物的各給藥位點(diǎn)進(jìn)行固定的蘇木精和曙紅-著色的石蠟切片微觀檢查。由獸醫(yī)病理學(xué)者檢查這些切片。為了在劑量組之間進(jìn)行比較，利用四步分級(jí)系統(tǒng)來定義可分級(jí)的損害。
結(jié)論在任何劑量濃度下，兩種測(cè)試物都沒有產(chǎn)生顯著的臨床發(fā)現(xiàn)、皮膚刺激、體重改變或者宏觀和微觀觀察現(xiàn)象。一種陽性對(duì)照與臨床發(fā)現(xiàn)有關(guān)，有輕微到中等的宏觀和微觀觀察現(xiàn)象。
實(shí)施例82化合物B和H的兔皮膚刺激研究進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)本發(fā)明的兩種化合物當(dāng)通過皮膚涂抹給予雄性兔連續(xù)七天后產(chǎn)生刺激的可能性。共分配了24個(gè)雄兔進(jìn)行研究。
在研究期間，測(cè)試物和對(duì)照物每天一次皮膚給藥，連續(xù)七天?；衔顱的劑量水平為0.03、0.1和0.3％。化合物H的劑量水平為0.03、0.1和0.3％。PMEG(陽性對(duì)照)的劑量水平為0.1％。cPrPMEDAP(陽性對(duì)照)的劑量水平為1.0％。媒介物對(duì)照的劑量水平為0.0％(其以凝膠和軟膏制劑給藥)。所有位點(diǎn)的給藥體積恒定為100μL。第一次給藥前不到24小時(shí)，從該動(dòng)物的背部剪短毛發(fā)。該剪短區(qū)域含有不少于總體表面積的10％。小心避免擦傷皮膚。
測(cè)試物、陽性對(duì)照物和媒介物對(duì)照物在約1”×1”的給藥位點(diǎn)進(jìn)行給藥。兩個(gè)給藥位點(diǎn)沿著左側(cè)背面排布。媒介物或陽性對(duì)照物在嘴位處給藥，低劑量的測(cè)試物在尾位處給藥。兩個(gè)給藥位點(diǎn)沿著右側(cè)背面排布。中劑量的測(cè)試物在嘴位處給藥，高劑量的測(cè)試物在尾位處給藥。給藥后立即將頸圈放在動(dòng)物上約2小時(shí)。加軛持續(xù)時(shí)間記錄在原始數(shù)據(jù)中。
對(duì)所有動(dòng)物每天兩次觀察死亡率、發(fā)病率以及對(duì)食物和水的利用率。在第1次給藥前和每次給藥后約24小時(shí)(在下次預(yù)定的給藥之前)和在7天恢復(fù)期間每天都評(píng)價(jià)測(cè)試位點(diǎn)的紅斑和水腫。在皮膚觀察的同時(shí)，研究期間每天都觀察臨床體征。測(cè)量并記錄收到后那天、隨機(jī)化前、在第1天以及在第7和第14天測(cè)試物給藥之前以及驗(yàn)尸時(shí)(第8和第15天)的體重。收到時(shí)和隨機(jī)前測(cè)得的體重沒有報(bào)導(dǎo)，但保留在研究文件中。從結(jié)束時(shí)的6個(gè)動(dòng)物/組和恢復(fù)時(shí)的3個(gè)動(dòng)物/組，從頸靜脈或者其他合適的靜脈收集血樣(4-6mL)，用于評(píng)價(jià)臨床病理學(xué)參數(shù)。
在第7天給藥后約2小時(shí)，從所有動(dòng)物，從頸靜脈或者其他合適的適宜靜脈取額外的血樣(約1mL)，用于測(cè)定測(cè)試物的血漿濃度。將試樣放于含有EDTA鉀的管中，并存放在冰塊上，直到進(jìn)行離心。在取血前動(dòng)物沒有被禁食。試樣存放在-70°，直到檢查。
在獸醫(yī)病理學(xué)者認(rèn)可的程序下，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行完全驗(yàn)尸檢查。通過經(jīng)耳靜脈/動(dòng)脈或者其他合適的靜脈過量用基于戊巴比妥鈉的安樂死溶液麻醉和通過切斷股血管放血實(shí)行安樂死。仔細(xì)檢查動(dòng)物的外部異常性，包括質(zhì)量。從腹部中線切口反映皮膚，鑒別任何異常性，并與臨死前發(fā)現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。檢查腹腔、胸腔和顱腔的異常性，并除去該器官、檢查、如果需要，放在中性緩沖的福爾馬林中。對(duì)來自給藥位點(diǎn)(4個(gè)/動(dòng)物)、腎和任何顯著的損害的組織切片，微觀檢查固定的蘇木精和曙紅-著色的石蠟切片。
在驗(yàn)尸時(shí)，對(duì)于主要研究的動(dòng)物在第8天，對(duì)于恢復(fù)動(dòng)物在第15天，鑒別每個(gè)動(dòng)物的四個(gè)給藥位點(diǎn)。各給藥位點(diǎn)的約一半被切離，然后按如上關(guān)于組織學(xué)處理所述收集并保存。而各給藥位點(diǎn)的另外約一半仍未受損地在動(dòng)物上，進(jìn)行以下過程。用三塊乙醇(95％)紗布擦給藥位點(diǎn)，并使之完全干燥。膠帶(3M_包裝帶或等效物)用于各給藥位點(diǎn)十次。一條干凈的膠帶用于區(qū)域外敷(reachapplication)。然后用剪刀剪掉給藥位點(diǎn)的剩余部分。在各給藥位點(diǎn)和動(dòng)物之間，用丙酮或乙醇清洗剪刀。給藥位點(diǎn)除去的次序?yàn)槊浇槲锘蜿栃詫?duì)照位點(diǎn)、低劑量位點(diǎn)、中劑量位點(diǎn)和高劑量位點(diǎn)。從各給藥位點(diǎn)切除1cm2組織。稱重并記錄組織試樣。皮膚試樣(punch)用干凈剪刀剪碎在單個(gè)適當(dāng)尺寸的閃爍管中。將冷磷酸鹽緩沖的鹽水(5mL)加入閃爍管中。然后用機(jī)械勻漿器以20秒脈沖使組織均化。在約-20℃使勻漿迅速冷凍。
結(jié)論基于皮膚刺激分值和微觀發(fā)現(xiàn)，一種測(cè)試物在媒介物凝膠中是非刺激的，但在媒介物軟膏中是溫和到中等刺激的。第二種測(cè)試物在媒介物凝膠中是非常輕微刺激的，當(dāng)在媒介物軟膏中配制時(shí)是溫和刺激的。
實(shí)施例83局部凝膠藥物組合物的制備該實(shí)施例說明含式I活性化合物的代表性局部凝膠組合物的制備。
制備具有以下組成的局部凝膠組合物
*X＝化合物范圍為0.01％到1.0％
其他式I化合物，例如根據(jù)本說明書制備的那些，可以作為活性化合物用于制備該實(shí)施例的凝膠制劑。
在開發(fā)該制劑過程中也可以評(píng)價(jià)以下成分的適用性異丙基肉豆蔻酸酯(mysritate)(溶劑/助溶劑/滲透增強(qiáng)劑)，聚乙二醇，三醋精(溶劑)，鯨蠟醇和硬脂醇(硬化劑)，卡波姆(粘度增強(qiáng)劑)，和吐溫，司盤(乳化劑)。
實(shí)施例84局部軟膏藥物組合物的制備該實(shí)施例說明含有式I活性化合物的代表性局部軟膏組合物的制備。
制備具有以下組成的局部軟膏組合物
*X＝化合物范圍為0.01％到1.0％其他式I化合物，例如根據(jù)本說明書制備的那些，可以作為活性化合物用于制備該實(shí)施例的軟膏制劑。
在開發(fā)該制劑過程中也可以評(píng)價(jià)以下成分的適用性異丙基肉豆蔻酸酯(溶劑/助溶劑/滲透增強(qiáng)劑)，聚乙二醇，三醋精(溶劑)，鯨蠟醇和硬脂醇(硬化劑)，卡波姆(粘度增強(qiáng)劑)，和吐溫，司盤(乳化劑)。
權(quán)利要求
1.式I的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中Y1A和Y1B獨(dú)立地為Y1；RX1和RX2獨(dú)立地為RX；Y1為＝O、-O(RX)、＝S、-N(RX)、-N(O)(RX)、-N(ORX)、-N(O)(ORX)或-N(N(RX)(RX)；RX獨(dú)立地為R1、R2、R4、W3或保護(hù)基；R1獨(dú)立地為-H或1～18個(gè)碳原子的烷基；R2獨(dú)立地為R3或R4，其中每個(gè)R4獨(dú)立地被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代或者兩個(gè)R2基團(tuán)在碳原子上結(jié)合在一起，形成3～8個(gè)碳的環(huán)，并且該環(huán)可以被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；R3為R3a、R3b、R3c或R3d，條件是，當(dāng)R3連接到雜原子上時(shí)，則R3為R3c或R3d；R3a為-H、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、-CN、N3、-NO2或-OR4；R3b為＝O、-O(R4)、＝S、-N(R4)、-N(O)(R4)、-N(OR4)、-N(O)(OR4)或-N(N(R4)(R4))；R3c為-R4、-N(R4)(R4)、-SR4、-S(O)R4、-S(O)2R4、-S(O)(OR4)、-S(O)2(OR4)、-OC(R3b)R4、-OC(R3b)OR4、-OC(R3b)(N(R4)(R4))、-SC(R3b)R4、-SC(R3b)OR4、-SC(R3b)(N(R4)(R4))、-N(R4)C(R3b)R4、-N(R4)C(R3b)OR4、-N(R4)C(R3b)(N(R4)(R4))、W3或-R5W3；R3d為-C(R3b)R4、-C(R3b)OR4、-C(R3b)W3、-C(R3b)OW3或-C(R3b)(N(R4)(R4))；R4為-H或1～18個(gè)碳原子的烷基、2～18個(gè)碳原子的烯基或2～18個(gè)碳原子的炔基；R5為1～18個(gè)碳原子的亞烷基、2～18個(gè)碳原子的亞烯基或2～18個(gè)碳原子的亞炔基；W3為W4或W5；W4為R6、-C(R3b)R6、-C(R3b)W5、-SOM2R6或-SOM2W5，其中R6為R4，其中每個(gè)R4被0～3個(gè)R3基團(tuán)所取代；W5為碳環(huán)或雜環(huán)，其中W5獨(dú)立地被0～3個(gè)R2基團(tuán)所取代；和M2為0、1或2。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中RX1是H。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中RX2是W3。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中W3是W5。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中W5是環(huán)丙基。
6.權(quán)利要求5的式IA化合物，
7.權(quán)利要求6的化合物，其中Y1A和Y1B是-N(RX)。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中RX是R2。
9.權(quán)利要求8的化合物，其中R2是R3d取代的R4。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中R4是R3d取代的乙基。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中R3d是-C(RY3d)OR4。
12.權(quán)利要求11的化合物，其中R3b是＝O。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中R4是丙基。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中R4是正-丙基。
15.權(quán)利要求14的下式化合物，
16.權(quán)利要求13的化合物，其中R4是異-丙基。
17.權(quán)利要求16的下式化合物，
18.權(quán)利要求10的化合物，其中R3d是-C(R3b)OW3。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中R3b是＝O。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中W3是W5。
21.權(quán)利要求20的化合物，其中W5是碳環(huán)。
22.權(quán)利要求9的化合物，其中R4是R3d取代的丙基。
23.權(quán)利要求22的化合物，其中R3d是-C(R3b)OR4。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中R3b是＝O。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中R4是乙基。
26.權(quán)利要求25的下式化合物，
27.權(quán)利要求24的化合物，其中R4是丁基。
28.權(quán)利要求27的化合物，其中R4是正-丁基。
29.權(quán)利要求28的下式化合物，
30.權(quán)利要求24的化合物，其中R4是丙基。
31.權(quán)利要求30的化合物，其中R4是異-丙基。
32.權(quán)利要求31的下式化合物，
33.權(quán)利要求8的化合物，其中R2是獨(dú)立地被兩個(gè)R3基團(tuán)取代的R4。
34.權(quán)利要求33的化合物，其中R4是被兩個(gè)R3基團(tuán)取代的甲基。
35.權(quán)利要求34的化合物，其中一個(gè)R3基團(tuán)是R3c。
36.權(quán)利要求35的化合物，其中R3d是-R5W3。
37.權(quán)利要求36的化合物，其中R3是亞甲基。
38.權(quán)利要求37的化合物，其中W3是W5。
39.權(quán)利要求38的化合物，其中W5是苯基。
40.權(quán)利要求35的化合物，其中另一個(gè)R3基團(tuán)是R3d。
41.權(quán)利要求40的化合物，其中R3d是-C(R3b)OR4。
42.權(quán)利要求41的化合物，其中R3b是＝O。
43.權(quán)利要求42的化合物，其中R4是丁基。
44.權(quán)利要求43的化合物，其中R4是異-丁基。
45.權(quán)利要求44的下式化合物，
46.權(quán)利要求6的化合物，其中Y1A是-N(RX)。
47.權(quán)利要求46的化合物，其中RX是R2。
48.權(quán)利要求47的化合物，其中R2是R3d取代的R4。
49.權(quán)利要求48的化合物，其中R4是R3d取代的乙基。
50.權(quán)利要求49的化合物，其中R3d是-C(R3b)OR4。
51.權(quán)利要求50的化合物，其中R3b是＝O。
52.權(quán)利要求51的化合物，其中R4是丙基。
53.權(quán)利要求52的化合物，其中R4是異-丙基。
54.權(quán)利要求46的化合物，其中Y1B是-N(RX)。
55.權(quán)利要求54的化合物，其中RX是R2。
56.權(quán)利要求55的化合物，其中R2是獨(dú)立地被兩個(gè)R3基團(tuán)取代的R4。
57.權(quán)利要求56的化合物，其中R4是被兩個(gè)R3基團(tuán)取代的甲基。
58.權(quán)利要求57的化合物，其中一個(gè)R3基團(tuán)是R3C。
59.權(quán)利要求58的化合物，其中R3c是-R5W3。
60.權(quán)利要求59的化合物，其中-R5-是亞甲基。
61.權(quán)利要求60的化合物，其中W3是W5。
62.權(quán)利要求61的化合物，其中W5是苯基。
63.權(quán)利要求58的化合物，其中另一個(gè)R3基團(tuán)是R3d。
64.權(quán)利要求63的化合物，其中R3d是-C(R3b)OR4。
65.權(quán)利要求64的化合物，其中R3b是＝O。
66.權(quán)利要求65的化合物，其中R4是丁基。
67.權(quán)利要求66的化合物，其中R4是異-丁基。
68.權(quán)利要求67的下式化合物，
69.權(quán)利要求63的化合物，其中R3d是-C(R3b)OW3。
70.權(quán)利要求69的化合物，其中R3b是＝O。
71.權(quán)利要求70的化合物，其中W3是W5。
72.權(quán)利要求71的化合物，其中W5是碳環(huán)。
73.權(quán)利要求6的化合物，其中Y1B是-O(RX)。
74.權(quán)利要求73的化合物，其中Y1B是-O(W3)。
75.權(quán)利要求74的化合物，其中W3是W5。
76.權(quán)利要求75的化合物，其中W5是碳環(huán)。
77.權(quán)利要求76的化合物，其中所述碳環(huán)是苯基。
78.權(quán)利要求77的下式化合物，
79.權(quán)利要求78的化合物，其中Y1A是-N(RX)。
80.權(quán)利要求79的化合物，其中RX是R2。
81.權(quán)利要求80的化合物，其中R2是R3d取代的R4。
82.權(quán)利要求81的化合物，其中R4是R3d取代的乙基。
83.權(quán)利要求82的化合物，其中R3d是-C(R3b)OR4。
84.權(quán)利要求83的化合物，其中R3b是＝O。
85.權(quán)利要求84的化合物，其中R4是丙基。
86.權(quán)利要求85的化合物，其中R4是正-丙基。
87.權(quán)利要求86的下式化合物，
88.權(quán)利要求81的化合物，其中R4是R3d取代的丙基。
89.權(quán)利要求88的化合物，其中R4是R3d取代的正-丙基。
90.權(quán)利要求89的化合物，其中R3d是-C(R3b)OR4。
91.權(quán)利要求90的化合物，其中R3b是＝O。
92.權(quán)利要求91的化合物，其中R4是丁基。
93.權(quán)利要求92的化合物，其中R4是正-丁基。
94.權(quán)利要求93的下式化合物，
95.權(quán)利要求79的化合物，其中RX是R2。
96.權(quán)利要求95的化合物，其中R2是被R3c和R3d取代的R4。
97.權(quán)利要求96的化合物，其中R4是被R3c和R3d取代的乙基。
98.權(quán)利要求97的化合物，其中R3c是-R5W3。
99.權(quán)利要求98的化合物，其中-R5是亞甲基。
100.權(quán)利要求99的化合物，其中W3是W5。
101.權(quán)利要求100的化合物，其中W5是碳環(huán)。
102.權(quán)利要求101的化合物，其中所述碳環(huán)是苯基。
103.權(quán)利要求102的化合物，其中R2d是-C(R3b)OR4。
104.權(quán)利要求103的化合物，其中R3b是＝O。
105.權(quán)利要求104的化合物，其中R4是乙基。
106.權(quán)利要求105的下式化合物，
107.權(quán)利要求6的化合物，其中Y1A和Y1B是-O(RX)。
108.權(quán)利要求2的化合物，其中RX2是R4。
109.權(quán)利要求108的化合物，其中R4是烷基。
110.權(quán)利要求108的化合物，其中R4是烯基。
111.權(quán)利要求108的化合物，其中R4是炔基。
112.權(quán)利要求110的化合物，其中R4是2-丙烯基。
113.權(quán)利要求2的化合物，其中RX2是R2。
114.權(quán)利要求113的化合物，其中R2是被一個(gè)R3取代的R4。
115.權(quán)利要求114的化合物，其中R4是被一個(gè)R3取代的甲基。
116.權(quán)利要求115的化合物，其中R3是R3a。
117.權(quán)利要求116的化合物，其中R3a是-CF3。
118.權(quán)利要求115的化合物，其中R4是-CH2-CF3。
119.作為抗增殖劑使用的權(quán)利要求1的化合物。
120.作為細(xì)胞凋亡劑使用的權(quán)利要求1的化合物。
121.作為抗-HPV劑使用的權(quán)利要求1的化合物。
122.作為局部抗-HPV劑使用的權(quán)利要求1的化合物。
123.作為抗增殖劑使用的權(quán)利要求1的化合物。
124.作為細(xì)胞凋亡劑使用的權(quán)利要求1的化合物。
125.藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受的載體。
126.權(quán)利要求125的藥物組合物，其中所述組合物是凝膠組合物。
127.權(quán)利要求125的藥物組合物，其中所述組合物是軟膏組合物。
128.藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和有效量的至少一種抗病毒劑，和藥學(xué)上可接受的載體。
129.權(quán)利要求128的藥物組合物，其中所述組合物是凝膠組合物。
130.權(quán)利要求128的藥物組合物，其中所述組合物是軟膏組合物。
全文摘要
描述了式(I)的化合物和組合物，適用作抗增殖劑，特別是抗－HPV藥物。
文檔編號(hào)C07F9/6561GK1950383SQ200480039469
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者程小勤, G·P·庫克, M·C·德賽, E·多爾夫勒, 何公欣, C·U·金, W·A·李, J·C·羅洛夫, 王建英, 楊征宇 申請(qǐng)人:吉里德科學(xué)公司