一種制備硫代異鼠李糖甘油二酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能性油脂制備領(lǐng)域，特別涉及一種制備硫代異鼠李糖甘油二酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硫代異鼠李糖甘油二酯(SQDG)是一種含硫的糖酯，具有抗病毒和抗腫瘤功能，其能抑制人類免疫缺陷病毒反轉(zhuǎn)錄酶HIV-RT活性，并且這些抑制效應(yīng)是依賴劑量的。Gustafson等從人工培養(yǎng)的藍(lán)綠藻L.1agerheimii和P.tenue細(xì)胞提取物中分離出含磺酸基的甘油糖脂，能抑制HIV的復(fù)制，可以作為一種新型的抗HIV藥物的先導(dǎo)化合物。從五種藍(lán)藻中分離的11種，能不同程度的抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)酶活性，其中四種能有效抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶活性，當(dāng)濃度為10 μ mo I/L時(shí)，幾乎100%抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶活性，但對(duì)RNA酶抑制活性很低；脂肪酸側(cè)鏈對(duì)其抗病毒能力起決定性作用，水解側(cè)鏈脂肪酸將使SQDG失去大部分抑制HIV-RT活性的能力。海藻硫酸甘油糖脂化合物的體外抗腫瘤活性研究表明，SQDG對(duì)正常細(xì)胞Vero和MC的毒性很小，其IC50值大于500 μ g/mL，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-27的生長抑制效果最明顯，能選擇性地有效抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的生長；在質(zhì)量濃度為125 μ g/mL時(shí)能完全抑制MCF-7細(xì)胞生長。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，SQDG能擾亂MCF-7的細(xì)胞周期，促使細(xì)胞凋亡或壞死，從而產(chǎn)生有效的生長抑制效果，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤藥物。
[0003]天然的SQDG —般是從高等植物、蘚類植物、蕨類植物或藻類植物以及大多數(shù)光合細(xì)菌中提取，其在藻類中的含量最多，可高達(dá)總脂含量的70%。而SQDG的提取方法的技術(shù)步驟為:采用Bligh-Dyer法制備總酯，通過硅膠柱層析法，從總酯中分離提取出SQDG，再利用高壓液相色譜分離純化SQDG。這類方法存在的不足之處是:1，采用高壓液相色譜純化分離制備，工藝繁瑣，不利于規(guī)?；苽?；2，采用Bligh-Dyer法制備的總酯率低，總酯中混入大量的其他甘油酯，降低了 SQDG豐度，不利于SQDG的下游純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于突破現(xiàn)有SQDG制備技術(shù)中的不足，提供一種簡單且易于生產(chǎn)的硫代異鼠李糖甘油二酯(SQDG)的制備方法，同時(shí)增加了 SQDG在樣品中的豐度。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下方式來實(shí)現(xiàn):
[0006]—種制備硫代異鼠李糖甘油二酯的方法，具體包括有制備總甘油酯階段、SQDG的QSepharose柱層析分離階段、SQDG的純化階段和SQDG干粉制備階段，各個(gè)階段具體步驟如下:
[0007](I)制備總甘油酯階段
[0008]將干燥的藻粉(藻粉以克或千克計(jì)量)在常壓和室溫的情況下用提取液(提取液以毫升或升計(jì)量)I進(jìn)行溶解，藻粉的質(zhì)量與提取液I的體積數(shù)值之比為1:3?6，所述提取液I為含有氯仿、甲醇和氯化鉀水溶液的混合液，其中氯仿:甲醇:氯化鉀水溶液的體積數(shù)值之比為3?5:1?3:1，將藻粉和提取液I的溶液攪拌4?5h，利用離心機(jī)分離收集有機(jī)相I，
[0009]將有機(jī)相I添加到提取液II中，有機(jī)相I與提取液II的體積數(shù)值之比為1:2?4，所述提取液II為含有氯仿和氯化鉀水溶液的混合液，其中氯仿與氯化鉀水溶液的體積數(shù)值之比為I?2:1，再利用離心機(jī)分離收集有機(jī)相II，將有機(jī)相II用低壓色譜柱進(jìn)行純化，收集得到極性總甘油酯，通過減壓濃縮至恒重，去除極性總甘油酯中的有機(jī)溶劑；
[0010](2) SQDG的Q Sepharose柱層析分離階段
[0011]將步驟(I)中制備的總甘油酯分別用Q Sepharose柱層析分離與洗脫峰進(jìn)行薄層層析(TLC)檢測，收集含有SQDG的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮至恒重，得到SQDG粗品；
[0012](3) SQDG的純化階段
[0013]將步驟(2)中所獲得的SQDG粗品分別用疏水柱層析分離與洗脫峰進(jìn)行薄層層析檢測，收集含有SQDG的洗脫液，將SQDG的洗脫液減壓濃縮至恒重，得到SQDG純品；
[0014](4) SQDG干粉制備階段
[0015]將步驟(3)中制備的SQDG純品用水溶解，通過20kD?50kD萬截留分子量的超濾膜超濾，把超濾后的濾液經(jīng)冷凍干燥制得SQDG干粉。
[0016]步驟(I)中所述的低壓色譜柱層析的具體條件如下:將硅膠用體積比值為2:2?5的四氯化碳與二氧六環(huán)勻漿混勻后裝入柱內(nèi)，然后依次用洗脫液A、洗脫液B、洗脫液C進(jìn)行淋洗，直至基線恒定；其中所述的洗脫液A是體積比值為50:5:1?40:5:1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液，洗脫液B是體積比值為30:5:1?20:5:1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液，洗脫液C是體積比值為30:6:1?25:4:1的氯仿、甲醇及甲酸的混合溶液。
[0017]步驟(2)中所述的Q Sepharose柱層析分離的具體步驟如下:
[0018]21)對(duì) Q Sepharose 柱進(jìn)行處理；
[0019]22)將柱床體積4?5倍的總甘油酯溶液按照400?450ml/h流速上樣，并用柱床體積5?10倍的洗脫液D以800?1000ml/h流速進(jìn)行淋洗；
[0020]23)再分別用柱床體積5?10倍的洗脫液D和洗脫液E進(jìn)行梯度洗脫；
[0021]其中，所述洗脫液D是體積比值為4?5:6?8:1的氯仿、甲醇及水的混合溶液，洗脫液E是體積比值為4?5:6?8:1的氯仿、甲醇及0.4M乙酸鈉-乙酸的混合溶液。
[0022]進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟21)中所述Q Sepharose柱進(jìn)行處理的步驟為:將裝填QSepharose的空柱用柱床體積10?20倍的0.4M乙酸鈉-乙酸溶液淋洗并浸泡過夜，然后用柱床體積10?20倍洗脫液E淋洗，再用柱床體積5?10倍的洗脫液D淋洗，直至基線恒定。
[0023]步驟(3)中所述SQDG的純化步驟是:將SQDG溶液上樣至疏水柱，SQDG溶液與柱體積數(shù)值比為1:1?3，其中SQDG溶液的溶劑為IM乙酸鈉-乙酸緩沖液，然后分別用柱體積5?10倍的IM乙酸鈉-甲醇溶液和0.005M乙酸鈉-甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果:
[0025]1、制備SQDG步驟不僅工藝流程簡單，操作安全，易于放大，而且所選擇的提取液配方有利于提高SQDG的得率；
[0026]2、采用Q Sepharose柱層析和疏水柱組合分離總甘油脂，可直接得到較純的SQDG,而且避免了 MGDG、D⑶G等甘油脂類對(duì)SQDG的污染。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0028]實(shí)施例1
[0029]將干燥的藻粉在常壓、室溫下用提取液I溶解，藻粉以克或公斤計(jì)量，提取液以毫升或升計(jì)量，藻粉的質(zhì)量與提取液I的體積數(shù)值之比為1:3，所述提取液I為氯仿、甲醇和氯化鉀水溶液的混合液，氯仿體積:甲醇體積:氯化鉀水溶液=I:1:1，將藻粉溶液攪拌4h?5h，然后離心分離并收集有機(jī)相I，將上述制備的有機(jī)相I加入提取液II，有機(jī)相1:提取液II的體積=1:2，所述提取液II為氯仿和氯化鉀水溶液的混合液，氯仿體積:氯化鉀水溶液=1:1，然后離心分離并收集有機(jī)相II，將有機(jī)相II用低壓色譜柱進(jìn)行純化，收集得到極性總甘油酯，通過減壓濃縮至恒重，去除極性總甘油酯中的有機(jī)溶劑。
[0030]低壓色譜柱層析條件如下:將硅膠用四氯化碳-二氧六環(huán)按(四氯化碳體積??二氧六環(huán)體積=2:5?1:1)勻楽混勻后裝入柱內(nèi)(1X30?50cm)，然后依次用洗脫液A、洗脫液B、洗脫液C淋洗，直至基線恒定；其中洗脫液A為氯仿體積:甲醇體積:甲酸體積=50:5:1的氯仿-甲醇-甲酸溶液，洗脫液B為氯仿體積:甲醇體積:甲酸體積=20:5:1的氯仿-甲醇-甲酸溶液，洗脫液C為氯仿體積:甲醇體積:甲酸體積=25:4:1的氯仿-甲醇-甲酸溶液。
[0031]將制備的總甘油酯用Q Sepharose柱層析分離，首先對(duì)Q Sepharose柱進(jìn)行處理，Q Sepharose柱體積為50ml，然后將4倍柱床體積的總甘油脂溶液以400ml/h流速上樣，用5倍柱床體積的洗脫液D以800ml/h流速進(jìn)行淋洗，分別以5倍柱床體積的洗脫液D和洗脫液E進(jìn)行梯度洗脫。
[0032]Q Sepharose柱處理為:將空柱裝填Q Sepharose，以10倍柱床體積的0.4M乙酸鈉-乙酸溶液淋洗并浸泡過夜，然后用10倍柱床體積的洗脫液E淋洗，再用5倍柱床體積的洗脫液D淋洗，直至基線恒定；所述洗脫液D的配方為氯仿體積:甲醇體積:水體積=4:6:1，洗脫液E的配方為氯仿體積:甲醇體積: