專利名稱：表達(dá)人源輪狀病毒外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品及其預(yù)防嬰幼兒腹瀉的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)人源輪狀病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，并進(jìn)而通過直接食用或腸道給藥方式利用這些含有人源輪狀病毒外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動(dòng)物對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
背景技術(shù)：
人源輪狀病毒(human rotavirus，HRV)導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的主要病因，也是第三世界國(guó)家中兒童死亡率最高的疾病(1998年世界衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告)。HRV在世界各地傳播，每年約有近百萬兒童死于RV腹瀉，在我國(guó)初步的資料表明每年也有約10萬。衛(wèi)生措施似乎對(duì)RV的傳播影響甚小，營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)發(fā)病危險(xiǎn)的重要性也遠(yuǎn)低于細(xì)菌性腹瀉，因?yàn)闊o論發(fā)達(dá)國(guó)家或是發(fā)展中國(guó)家，3歲前的嬰兒約有90％都要受RV感染，輕者表現(xiàn)為自限性的輕度水樣便，重者可出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐及嚴(yán)重腹瀉，進(jìn)而導(dǎo)致脫水、電解質(zhì)紊亂和酸中毒，甚至死亡。資料顯示，由于輪狀病毒所帶來的社會(huì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)費(fèi)用是驚人的。僅在美國(guó)，每年因此增加500,000門診次數(shù)和50,000住院治療次數(shù)，直接醫(yī)療費(fèi)用為2.64億美元，總社會(huì)費(fèi)用超過10億美元。另外，迄今尚無治療RV的特效藥物，因此預(yù)防顯得極為重要。為此，世界衛(wèi)生組織多次呼吁各國(guó)科學(xué)家研制開發(fā)有效的輪狀病毒疫苗，指出只有疫苗預(yù)防接種才是遏制輪狀病毒腹瀉唯一有效的手段。
近年來輪狀病毒疫苗的研究策略有兩種途徑一種是研制減毒活疫苗，另一種是亞單位疫苗。前者是用G1～G4型病毒共同感染培養(yǎng)細(xì)胞，在一定選擇壓力下挑選出合適的疫苗候選株。目前僅有美國(guó)(1998年)和我國(guó)(2000年)獲準(zhǔn)用于臨床。但其活疫苗的穩(wěn)定性以及由于病毒毒力回復(fù)帶來的安全性問題是減毒活疫苗面臨的本質(zhì)上的缺陷，如美國(guó)的恒河猴輪狀病毒疫苗(RRV)就因健康兒童接種該疫苗后屢屢出現(xiàn)腸套疊問題而禁用，而且其價(jià)格偏高(如RRV疫苗需120美元)，因而大大地限制了該疫苗的推廣、普及。如何保證其安全性并降低成本成為其問題的關(guān)鍵。亞單位疫苗的研制策略是運(yùn)用基因工程方法進(jìn)行輪狀病毒重組多肽疫苗的研究，目前尚沒有成功應(yīng)用于臨床的先例。況且，通過重組細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗，因需要發(fā)酵、純化技術(shù)，使其設(shè)備復(fù)雜、成本高，目前生產(chǎn)的疫苗也遠(yuǎn)不能滿足全球免疫計(jì)劃的需要。因此，如何使?fàn)畈《疽呙绺鼮榘踩?、?jīng)濟(jì)、有效和更容易推廣使用將是今后各國(guó)研究的主要方向。
輪狀病毒屬呼腸弧病毒家族成員，病毒具分段的雙股RNA，含11個(gè)基因片斷。除基因11可編碼2種不同的蛋白外，每一基因片斷可分別編碼一種單一的蛋白。對(duì)輪狀病毒病毒粒體結(jié)構(gòu)組成的研究表明，其包膜蛋白主要有三種，依據(jù)編碼基因的不同，分別稱為VP4、VP7和VP6(1)。
第一層外層為表面蛋白VP4形成的60個(gè)刺突狀結(jié)構(gòu)向外突出，VP4即病毒血凝素，是病毒毒力的重要決定簇，病毒借以能侵入腸壁細(xì)胞。第一層內(nèi)層為VP7(由基因9表達(dá)的蛋白)形成平滑的波浪形，其成分占病毒表面蛋白的30％。在此層上裂開形成132個(gè)直接通達(dá)核心的孔，以供病毒與外界傳遞信息。VP7是一種高糖蛋白，為病毒確定亞型的依據(jù)。第二層是由VP6形成的三聚體，VP6約占病毒顆粒重量的一半，為病毒組和亞組確定的依據(jù)。
早在1985年，Hoshino等人發(fā)現(xiàn)VP7是主要中和性抗原，隨后的重組輪狀病毒活疫苗正是基于這一點(diǎn)，選擇僅VP7被人源輪狀病毒替換的重配株，均具有較好的保護(hù)力。Anderew等人分別在1990年和1992年證實(shí)經(jīng)過改造的VP7基因在重組痘苗病毒中表達(dá)，具有與相同感染滴度的SA11活病毒相當(dāng)。而且其保護(hù)性免疫力可遺傳給下一代幼鼠。Wang等人1999年將豬源輪狀病毒VP7基因改造后在大腸桿菌中表達(dá)，也具有很好的中和病毒能力，何金生等人2001年以腺病毒表達(dá)人源輪狀病毒VP7免疫小鼠，產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和粘膜免疫應(yīng)答(已申請(qǐng)國(guó)內(nèi)專利，申請(qǐng)?zhí)朇N_02104125.3)，次年彭世勇等人用pCI分別進(jìn)行VP7、VP4和VP6基因的DNA疫苗研究，結(jié)果僅VP7誘導(dǎo)最強(qiáng)的免疫應(yīng)答；其次，VP7基因是高度保守的，在相同血清型其同源性可高達(dá)94-99％，不同血清型其同源性也可高達(dá)67-85％，因而具有較寬的疫苗保護(hù)性范圍。上述研究表明輪狀病毒的外殼蛋白VP7是主要中和性抗原，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和粘膜免疫應(yīng)答、產(chǎn)生保護(hù)性免疫方面起決定性作用。從而為下一步制備高效輪狀病毒疫苗提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。
絕大多數(shù)的人類病原體，是通過與粘膜表面相互作用而引起疾病的。通過這種機(jī)制起作用的細(xì)菌和病毒病原體，首先與粘膜表面接觸，它們能夠在粘膜表面粘附和克隆，或者由位于覆蓋派氏集合淋巴結(jié)和其它淋巴濾泡的上皮中的專門吸收細(xì)胞(M細(xì)胞)所吸收。當(dāng)抗原傳輸?shù)綖V泡內(nèi)的免疫細(xì)胞時(shí)(例如輪狀病毒)，在淋巴濾泡內(nèi)可能很容易殺傷進(jìn)入淋巴組織的病原體，從而激發(fā)一個(gè)潛在的保護(hù)性免疫應(yīng)答。換句話說，能夠幸免于局部防御機(jī)制的病原微生物，則可能自淋巴濾泡播散，隨后引起局部的或全身性疾病(例如在免疫受損宿主中的沙門氏菌屬和脊髓灰質(zhì)炎病毒。)。機(jī)體受到病原侵染后會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程至少涉及以下三種免疫機(jī)制之一粘膜、體液或細(xì)胞。粘膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生分泌型抗體IgA(sIgA)，sIgA通過阻止粘附和/或克隆、中和表面活性毒素或防止入侵宿主細(xì)胞，可以防止病原體與粘膜表面的最初相互作用，從而保護(hù)呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)和腺體表面不受侵染。粘膜抗體可阻止病原在粘膜表面定居從而構(gòu)成第一道防御屏障。粘膜抗體的產(chǎn)生可通過分泌性腺體和組織的局部免疫而獲得，也可通過刺激腸道和呼吸道淋巴組織產(chǎn)生。
腸胃外注射滅活的整個(gè)細(xì)胞和整個(gè)病毒標(biāo)本，在誘發(fā)抵抗病原體的保護(hù)性血清IgG和遲發(fā)性超敏反應(yīng)中是有效的，在這些病原體的發(fā)病機(jī)理中有明顯的血清階段(例如傷寒沙門氏菌，乙型肝炎)。然而，腸胃外疫苗在誘發(fā)粘膜的sIgA應(yīng)答時(shí)無效，并且對(duì)與粘膜表面相互作用但不入侵粘膜的細(xì)胞亦無效(例如，輪狀病毒)。
一旦抗原被提呈到派氏集合淋結(jié)內(nèi)的T-淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞以及輔助細(xì)胞，口服途徑給藥的疫苗就能有效地誘導(dǎo)特異的sIgA應(yīng)答，在派氏集合淋巴結(jié)內(nèi)，首先啟動(dòng)優(yōu)先的IgA B-細(xì)胞發(fā)育。派氏集合淋巴結(jié)包含輔助T-(TH)細(xì)胞，它能介導(dǎo)B-細(xì)胞同型直接從IgM細(xì)胞轉(zhuǎn)向IgA細(xì)胞。然后，B-細(xì)胞遷移至腸系膜淋巴結(jié)并且進(jìn)行胸導(dǎo)管及全身循環(huán)，隨后種植在體內(nèi)所有的內(nèi)分泌組織中，包括消化道和呼吸道的固有層。然后成熟的漿細(xì)胞產(chǎn)生IgA，與膜結(jié)合的分泌成分形成復(fù)合體，隨后被運(yùn)輸?shù)秸衬け砻?，在粘膜表面與入侵的病原體相互作用。這種粘膜免疫系統(tǒng)是應(yīng)用活的口服疫苗和口服免疫制劑保護(hù)性抵御病原體的基礎(chǔ)，這些病原體可通過首次與粘膜表面相互作用引起感染。鑒于IgA的保護(hù)力是短壽的，一個(gè)理想的粘膜疫苗應(yīng)該是價(jià)廉、有效、安全和便于給藥(如口服給藥)，以便多次服用。
轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的發(fā)展使上述假設(shè)成為可能。含有外源基因的植物細(xì)胞可再生出完整植株，并將外源基因穩(wěn)定地遺傳給后代。迄今有些單子葉和雙子葉植物都已經(jīng)進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)化。例如煙草、馬鈴薯、西紅柿、大豆和玉米等。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的雙子葉植物轉(zhuǎn)化已有眾多報(bào)道。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法可有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移、選擇和再生。
植物是一種多樣化、低成本和可再生的材料資源，而生物技術(shù)的迅速發(fā)展則使我們進(jìn)一步拓寬了植物的使用范圍，國(guó)外在植物中采用這種“分子農(nóng)業(yè)”的方法，已經(jīng)成功地生產(chǎn)了越來越多的有用物質(zhì)，其中包括一些高價(jià)值藥用蛋白多肽，如人的細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長(zhǎng)激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等，一些研究機(jī)構(gòu)和公司已經(jīng)開始從這些藥物蛋白的生產(chǎn)中獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
特別值得指出的是，1998年4月，美國(guó)國(guó)家過敏癥和傳染病研究所(Natiomnal Instituteof Allergy and Infectious Diseases，NIAID)首次報(bào)道了人食用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后體內(nèi)能夠產(chǎn)生對(duì)大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素B亞基的特異性抗體，在11個(gè)志愿者中有10人(91％)血清中抗體增加了4倍，有6人(55％)粘膜抗體也增加了4倍。這一研究結(jié)果清楚地表明(1)在植物中高效表達(dá)一些病原蛋白基因是可行的。
(2)病原蛋白在植物中可完成翻譯后加工過程，如糖基化和高級(jí)結(jié)構(gòu)的空間折疊，從而使這種重組蛋白多肽與天然蛋白具有相同免疫原性，這是原核生物表達(dá)系統(tǒng)無法比擬的，后者無法對(duì)源自真核生物的蛋白進(jìn)行糖基化。
(3)植物中產(chǎn)生的抗原蛋白可安全地通過動(dòng)物的消化道而不會(huì)被蛋白酶降解，原因是它們能夠與腸粘膜細(xì)胞膜表面上的糖蛋白分子受體結(jié)合并刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這類蛋白也被稱謂粘膜性抗原(mucosal immumogen)，但并不是所有的蛋白都具有這種能力，現(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)病毒和細(xì)菌含有這種抗原。
(4)研究也證實(shí)了粘膜性抗原只需要口服少量蛋白，就可以產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并不比肌內(nèi)注射所需要量大。
這些研究結(jié)果預(yù)示植物將成為繼微生物發(fā)酵系統(tǒng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)之后又一個(gè)新的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
利用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)輪狀病毒包膜蛋白抗原具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)更安全轉(zhuǎn)基因植物中除只增加了輪狀病毒重組抗原蛋白外，沒有改變植物其它的遺傳組成，因此，它絕不會(huì)含有對(duì)人體有害成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。
(2)價(jià)格更低廉因?yàn)樗恍枰兓屠洳?，抗原蛋白的生產(chǎn)可能只是簡(jiǎn)單地種植農(nóng)作物，因此可大大降低生產(chǎn)成本。
(3)便用更方便接種方式只是簡(jiǎn)單地食用含有該抗原蛋白的植物組織或由該植物組織加工而成的某種膠囊、沖劑或其它制劑，省去了較麻煩的注射過程，這種接種方式非常適用于中國(guó)或其它發(fā)展中國(guó)家。
(4)免疫力更持久人或動(dòng)物每隔一定時(shí)間服用含該抗原蛋白的膠囊或沖劑，可使體內(nèi)抗體始終維持在一個(gè)較高的水平，增強(qiáng)了對(duì)輪狀病毒感染的抵抗能力。
已有人嘗試在植物中表達(dá)牛源輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6、鼠源非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4的B細(xì)胞表位，(3)。然而，在本發(fā)明之前，還沒有人利用植物表達(dá)人源輪狀病毒VP7蛋白抗原，而正如前文所述該蛋白具有比其它蛋白更強(qiáng)的免疫原性。而且，不同種屬來源的輪狀病毒抗原不能有效的保護(hù)其它種屬的輪狀病毒感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將含有輪狀病毒VP7蛋白抗原的轉(zhuǎn)基因植物加工成膠囊、沖劑或其它制劑的方法，對(duì)其中所含的抗原蛋白進(jìn)行嚴(yán)格定量，從而對(duì)人或哺乳動(dòng)物的食用間隔和食用量有了明確的規(guī)定，由此克服了直接食用轉(zhuǎn)基因植物存在的上述缺點(diǎn)。
在沒有成功的輪狀病毒疫苗可供利用的情況下，非常有必要尋找新的更加安全和廉價(jià)的抗原蛋白生產(chǎn)途徑。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)病原體抗原重組蛋白是一種較好的選擇，它可能為人類和哺乳動(dòng)物抵御各種傳染性疾病提供一條新途徑。
本發(fā)明提供表達(dá)輪狀病毒重組外殼蛋白抗原轉(zhuǎn)基因植物以及如何應(yīng)用含該重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的方法。本項(xiàng)發(fā)明適用于任何國(guó)家，特別適用于中國(guó)或其它發(fā)展中國(guó)家。
本發(fā)明利用可以食用的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)病毒抗原蛋白，這些重組抗原蛋白在免疫原性方面與天然蛋白類似。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，就是本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物、與人或動(dòng)物疾病相關(guān)的病毒重組抗原蛋白的生產(chǎn)方法以及如何具體應(yīng)用這種含重組抗原蛋白轉(zhuǎn)基因植物的方法。這里所指的疾病是指那些具有在自然狀態(tài)下能夠引起免疫應(yīng)答、特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)抗原的病毒病原。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，病毒病原指的是輪狀病毒，植物指的是人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹参铩?br> 本發(fā)明克服了以前一些病毒抗原蛋白生產(chǎn)方法如微生物發(fā)酵和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)，它利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)病毒抗原蛋白，如果將其加工成口服膠囊、沖劑或其它制劑，則具有廉價(jià)、安全和使用方便的特點(diǎn)，會(huì)使更多人或動(dòng)物得到保護(hù)。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，人或哺乳動(dòng)物只需食用這些轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)、汁液、根、莖、葉或植物的其它部分，或以腸道給藥的方式利用這些轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物粗提取物制備的膠囊、沖劑或其它制劑便可獲得對(duì)疾病的免疫能力。這里的植物是指人們?nèi)粘Ｋ秤玫?，同時(shí)由于避免提純過程，降低了生產(chǎn)成本和存在的其它一些不利因素。
按照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)含抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的方法。生產(chǎn)這種膠囊、沖劑或其它制劑的轉(zhuǎn)基因植物材料可以有多種方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果實(shí)、葉子、莖和塊莖，或植物某一部分的粗提物、或經(jīng)完全純化以及部分純化源自轉(zhuǎn)基因植物的病毒抗原蛋白?？傊?，采用何種方式主要取決于抗原蛋白本身的免疫原性，產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)所需這種源自轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的抗原的劑量以及在這種成份中所含的干擾免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)的多少，如糖類、熱原和毒素等，并盡量降低免疫耐受性的產(chǎn)生。
本發(fā)明所指的抗原蛋白是指在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)的，首先是編碼病原抗原蛋白的基因被分離出來。然后插入到一個(gè)含有選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上，啟動(dòng)子位于該基因的上游，它操縱該基因在植物中的表達(dá)。外源基因在植物各器官或可食用部分中表達(dá)后，人或動(dòng)物可食用這部分植物組織。
本發(fā)明提供了在植物細(xì)胞中生產(chǎn)病毒重組蛋白的方法，而該蛋白已知在天然狀態(tài)直可引起哺乳動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。或者說，本發(fā)明所指的病毒重組蛋白可作為抗原，具有與源自哺乳動(dòng)物和其它常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的該抗原蛋白如酵母和細(xì)菌一樣的免疫原性，或者更確切說，本發(fā)明的抗原蛋白與源自哺乳動(dòng)物和其它常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣，均能夠通過口服和腸道給藥的方式引起免疫應(yīng)答反應(yīng)。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，這種病毒重組蛋白是一種抗原蛋白，它可以在植物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生，且具有與源自哺乳動(dòng)物或其它常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白相似的免疫原性。
本發(fā)明的抗原源自一種哺乳動(dòng)物的病毒，它可在植物中表達(dá)產(chǎn)生。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，抗原源自一種哺乳動(dòng)物病毒病原。因此，可以說在植物中表達(dá)產(chǎn)生的最有用的病毒抗原是那些來源自哺乳動(dòng)物如人的病毒病原的抗原。
本發(fā)明的抗原可在植物中表達(dá)產(chǎn)生，而表達(dá)產(chǎn)生該抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或經(jīng)過粗加工后可以食用。這種植物或植物的食用部分不應(yīng)具有毒性，因此，許多常見的食用植物，例如西紅柿、萵苣、胡蘿卜、黃瓜等都包括在本發(fā)明所定義的植物范圍之內(nèi)。此外，在某些情況下，如馬鈴薯，在這里也被認(rèn)為是可食用植物，盡管它的某些部分被認(rèn)為是有毒的(馬鈴薯塊莖部分是無毒的，因此屬于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，但它的果實(shí)是有毒的)，在這種情況下，這種植物也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。植物可以是雙子葉植物或是單子葉植物。
按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗原應(yīng)該是一個(gè)粘膜性抗原。它具有引起粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力。按照一個(gè)更加優(yōu)先的實(shí)施方案，這些粘膜抗在一定劑量范圍之內(nèi)能夠引起粘膜和體液產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，而不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生免疫耐受性和過敏反應(yīng)。免疫耐受性在這里被定義為在人或哺乳動(dòng)物多次食用該抗原之后，導(dǎo)致隨后的特異性抗原-抗體反應(yīng)能力消失。當(dāng)然，本發(fā)明中的抗原也有可能產(chǎn)生粘膜系統(tǒng)免疫耐受性，但如果改為注射后，該抗原仍然能保持它的免疫原性。
本發(fā)明的重組抗原蛋白可以是病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具體實(shí)施方案中，抗原也可能只是該天然蛋白分子的一部分。有時(shí)，抗原可與另外一個(gè)多肽或蛋白分子如細(xì)菌病原蛋白多肽結(jié)合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價(jià)結(jié)合的方式，或者通過DNA重組技術(shù)使基因在翻譯前就連接在一起。這兩種技術(shù)是本領(lǐng)域?qū)＜以缫咽熘募夹g(shù)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原將指的是來自一種肝炎病毒的抗原，在某些更優(yōu)先的實(shí)施方案中，將選擇使用輪狀病毒外殼蛋白抗原。并且優(yōu)選所說的抗原是具有Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列的基因所編碼的人源輪狀病毒VP7抗原；其中術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并序列”是指基于密碼子的冗余可以根據(jù)植物宿主細(xì)胞密碼子的偏好性而在編碼抗原的基因序列中引入適當(dāng)?shù)暮?jiǎn)并密碼子加以替換，這樣得到的抗原蛋白的氨基酸序列保持不變，但是表達(dá)效率大為提高。更進(jìn)一步地，所說的抗原是具有Seq.ID.No.5所示的氨基酸序列的VP7抗原。因此，按照一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案，輪狀病毒外殼蛋白抗原基因在植物中表達(dá)，而該重組抗原可引起免疫應(yīng)答反應(yīng)、特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)就如同天然蛋白或其它表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，一種表達(dá)哺乳動(dòng)物病毒重組抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物被構(gòu)建。就本發(fā)明而言，一種轉(zhuǎn)基因植物至少應(yīng)該在該植物的部分細(xì)胞中表達(dá)了某種病毒抗原。按照本發(fā)明的某些優(yōu)先實(shí)施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表達(dá)的抗原是輪狀病毒包膜中蛋白抗原，它能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。
本發(fā)明涉及到了一種食物的組成問題，該食物中至少含有轉(zhuǎn)基因植物的某些食用部分，這里的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)能夠表達(dá)輪狀病毒包膜中蛋白抗原。就本發(fā)明而言，植物或植物的某一部分被認(rèn)為應(yīng)該具有某些營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，它能夠?yàn)槿嘶蚱渌溉閯?dòng)物提供代謝所需的能量，維生素的其他輔助因子。盡管萵苣并不大量提供能量、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪，但就因?yàn)樗兄亟M抗原蛋白而被人們特意食用的話，萵苣也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。萵苣的粗纖維對(duì)哺乳動(dòng)物的健康是有利的，即使哺乳動(dòng)物并不能夠消化萵苣的粗纖維。
本發(fā)明涉及到了一種膠囊、沖劑或其它制劑的組成成份問題，膠囊、沖劑或其它制劑中可以含有適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或賦形劑等，但至少含有轉(zhuǎn)基因植物的某些食用部分，這里的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)能夠表達(dá)一種重組病毒抗原蛋白。就本發(fā)明而言，膠囊、沖劑或其它制劑中含有的抗原蛋白應(yīng)該能夠精確定量，以避免人或動(dòng)物食用后產(chǎn)生免疫耐受性。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)先實(shí)施方案，本發(fā)明的膠囊、沖劑或其它制劑所含有的抗原是輪狀病毒包膜中蛋白抗原，它能夠引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，就如同天然蛋白或其它表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原蛋白一樣。
正如上述所述，按照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，這里的食物將包括含有粘膜性抗原蛋白的食物，這種粘膜性抗原蛋白能夠與粘膜細(xì)胞表面糖基化分子受體結(jié)合，它可以是一種融合蛋白或者是源自某種肝炎病毒的抗原。因此，按照一個(gè)更加具體的實(shí)施方案，本發(fā)明所指的食物將至少包括轉(zhuǎn)基因植物的一部分，它具有某些營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，關(guān)含有輪狀病毒外殼蛋白抗原，而該抗原能夠與粘膜細(xì)胞表面的糖基化分子受體結(jié)合。在任何情況下，本發(fā)明的食物都包括植物的根、莖、葉、果實(shí)或所說的植物種子。
對(duì)本發(fā)明所使用方法和其它相關(guān)事項(xiàng)極為重要的是一些質(zhì)粒載體的構(gòu)建，它們?cè)讷@得本發(fā)明所指的轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基因植物的加工應(yīng)用中起重要作用。用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體由編碼哺乳動(dòng)物病毒抗原的DNA序列和操縱該DNA序列在所說的植物中表達(dá)的一個(gè)植物啟動(dòng)子組成。在某些具體實(shí)施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個(gè)選擇或標(biāo)記基因，主要用于轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞的檢測(cè)。在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。正如上面所述，按照某些具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)化可食用植物，它編碼的抗原是一種粘膜抗原，更進(jìn)一步說，質(zhì)粒載體所編碼的抗原能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是粘膜性免疫應(yīng)答反應(yīng)，就象天然蛋白和源自其它表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的該抗原蛋白一樣。在一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案中，本發(fā)明用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒載體含有編碼輪狀病毒包膜中蛋白抗原的基因以及一個(gè)植物啟動(dòng)子，該基因編碼的蛋白抗原可引起免疫應(yīng)答反應(yīng)、特別是粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)就如同天然蛋白或源自其它表達(dá)系統(tǒng)的該抗原蛋白一樣，而植物啟動(dòng)子主要是操縱該基因在植物中的表達(dá)。在一個(gè)類似的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的DNA片段可用于基因槍法轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明也提供了獲得轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，它包括以下步驟1.構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個(gè)植物啟動(dòng)子的操縱之下；2.用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，還包括從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株的方法。
本發(fā)明提供了各種植物細(xì)胞或植物的轉(zhuǎn)化方法。盡管在下面描述的某些優(yōu)先實(shí)施方案中僅利用了特定的轉(zhuǎn)化方法，但顯而易見的是，本領(lǐng)域?qū)＜宜缫咽熘钠渌参镛D(zhuǎn)化方法也應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，這些方法包括微管注射、PEG融合、電融合。按照某些優(yōu)先實(shí)施方案，使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，特別指Ti質(zhì)粒參與的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。在其它一些優(yōu)先實(shí)施方案中，還可以使用基因槍法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物。
本發(fā)明植物轉(zhuǎn)化方法中所用的質(zhì)粒載體是一個(gè)雙元載體系統(tǒng)。按照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明使用的質(zhì)粒是一個(gè)整合性載體。按照一個(gè)更加優(yōu)先的實(shí)施方案，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒是pBI121。
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因食物的生產(chǎn)方法。它包括以下步驟1.構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個(gè)植物啟動(dòng)子操縱之下；2.用質(zhì)粒載體或上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；3.從轉(zhuǎn)化基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物；4.收獲轉(zhuǎn)基因植物的食用部分；5.食用一定量的這種轉(zhuǎn)基因植物，盡量避免產(chǎn)生免疫耐受性，以達(dá)到預(yù)防疾病的效果。
本發(fā)明也提供了含確定數(shù)量抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟1.構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原蛋白的基因，而且該基因被置于一個(gè)植物啟動(dòng)子操縱之下；2.用質(zhì)粒載體將上述DNA片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；3.從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物；4.自轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成膠囊、沖劑或其它制劑。按照一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案，含有抗原蛋白的完整轉(zhuǎn)基因植物或者其某些食用部分可直接進(jìn)行冷凍、干燥的粉碎，然后加工成膠囊、沖劑或其它制劑，并確定其中含有的抗原蛋白數(shù)量。
本發(fā)明包括以下幾個(gè)組成部分1.利用DNA重組技木構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，它含有輪狀病毒外殼蛋白抗原基因或其衍生物，人或其它哺乳動(dòng)物在食用該抗原蛋白后有可能產(chǎn)生針對(duì)輪狀病毒的特異性中和抗體；2.選擇適宜的受體植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使編碼抗原蛋白的基因穩(wěn)定地整合入受體植物的染色體中并可遺傳給后代；3.從轉(zhuǎn)化的受體植物細(xì)胞中再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物，而且該植物能夠穩(wěn)定、高效地產(chǎn)生輪狀病毒外殼蛋白抗原；4.人或哺乳動(dòng)物直接食用這種轉(zhuǎn)基因植物或以腸道給藥的方式口服以該轉(zhuǎn)基因?yàn)橹饕钚猿煞菁庸ざ傻哪z囊、沖劑或其它制劑后，有可能預(yù)防輪狀病毒的侵染。
本發(fā)明提供了表達(dá)輪狀病毒外殼蛋白或其衍生物轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，這種轉(zhuǎn)基因植物作為食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑后被人們食用有可能引起人或哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答的結(jié)果使人或哺乳動(dòng)物對(duì)輪狀病毒的感染具有抵抗能力。這種免疫應(yīng)答是由于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)輪狀病毒外殼蛋白抗原后而產(chǎn)生的結(jié)果，而輪狀病毒外殼蛋白抗原的產(chǎn)生則是由于該抗原蛋白基因整合入植物的基因組中并在啟動(dòng)子調(diào)控下能夠穩(wěn)定地表達(dá)的結(jié)果。


為了詳細(xì)描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實(shí)施方案，并以相應(yīng)的繪圖作參考圖1輪狀病毒VP7基因克隆示意2輪狀病毒VP7基因重組到植物表達(dá)載體構(gòu)建示意3質(zhì)粒PBI121-VP7所含的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控表達(dá)序列圖4不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片中VP7蛋白的含量圖5轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片基因組總DNA Southern blot結(jié)果圖6轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖可溶性總蛋白Western blot結(jié)果圖7轉(zhuǎn)基因西紅柿果實(shí)可溶性總蛋白Western blot結(jié)果在圖3中，Nos-Pro＝胭脂堿合成酶；NPT-II＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶；Nos-Ter＝胭脂堿合成酶終止子；35S Pro＝花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；RB＝T-DNA右邊邊界；LB＝T-DNA左邊邊界在圖4中，1.陰性對(duì)照株塊莖抽提可溶性總蛋白；2-21.轉(zhuǎn)基因馬玲薯塊莖抽提可溶性總蛋白；在圖5中，1.陽(yáng)性對(duì)照，10ng重組PBI121-VP7質(zhì)粒；2-9.轉(zhuǎn)基因馬玲薯植株；10.陰性對(duì)照株.
在圖6中，1.陽(yáng)性對(duì)照，市售重組VP7蛋白；2-5.轉(zhuǎn)基因馬玲薯塊莖抽提可溶性總蛋白；6陰性對(duì)照株塊莖抽提可溶性總蛋白.
在圖7中，1.陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)基因西紅柿葉片抽提總RNA；2-8.不同轉(zhuǎn)基因西紅柿植株葉片抽提總RNA.
本發(fā)明的詳細(xì)描述1.HRV疫苗的發(fā)展歷史人類輪狀病毒(HRV)是引起嬰幼兒急性腹瀉和死亡的重要病原體，占所有腸道感染病因的50％以上。全球每年因RV感染致死的病例超過100萬，衛(wèi)生條件對(duì)RV的傳播影響很小，營(yíng)養(yǎng)狀況與發(fā)病危險(xiǎn)的關(guān)系也不如細(xì)菌性腹瀉那樣密切，無論衛(wèi)生條件較好的發(fā)達(dá)國(guó)家，還是在衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國(guó)家，3歲以下的嬰幼兒約有90％都要受到RV的感染。美國(guó)每年由此的醫(yī)療和間接開支逾10億美元。輪狀病毒腹瀉在全球已成為一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)開發(fā)其疫苗給予了高度重視。發(fā)展輪狀病毒疫苗，預(yù)防病毒性腹瀉是刻不容緩的任務(wù)。近20年來RV疫苗的研制工作進(jìn)展很快，取得的一些突破性成果簡(jiǎn)述如下。
第一代輪狀病毒疫苗-輪狀病毒口服減毒活疫苗 人和動(dòng)物輪狀病毒的VP6具有相同的抗原性，動(dòng)物毒株比人RV毒株易于在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)且對(duì)人天然減毒，省去了體外減毒的步驟，因此動(dòng)物RV株被用來研制減毒活疫苗。這種用動(dòng)物病毒株預(yù)防人類疾病的方法稱為“琴納法”?？诜p毒活疫苗可以有效地誘導(dǎo)局部粘膜免疫，產(chǎn)生抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，且免疫持續(xù)的時(shí)間比滅活疫苗更長(zhǎng)，因而成為首選疫苗。比較有代表性的有(1)比利時(shí)SmithNine-RIT所發(fā)展的多次傳代減毒的牛株(RIT-4237)疫苗，是把牛輪狀病毒NCDV株在原代牛腎(或猴腎)細(xì)胞中經(jīng)147次傳代后獲得的減毒株；(2)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院Kapikian等從3～5月齡腹瀉的恒河猴糞便中分離到的病株，經(jīng)猴腎細(xì)胞傳9代之后得到的減毒株，恒河猴輪狀病毒疫苗MMV-18006。該疫苗具有高度免疫原性，故接種劑量小，成本低，但引起發(fā)熱、水樣便和病毒排出率均高于RIT-4237，保護(hù)性不穩(wěn)定(0～85％)；(3)美國(guó)費(fèi)城Wistar研究所和法國(guó)erenx研究所聯(lián)合研究的低傳代牛RV疫苗Wister-eneux牛株疫苗(WC3)，是將牛RVWC3株在CV-1細(xì)胞中傳12代，為G6型。主要不足仍為保護(hù)性不穩(wěn)定。
第二代輪狀病毒疫苗為多價(jià)重組疫苗 由于早期的動(dòng)物輪狀病毒疫苗株型別單一，在嬰幼兒服苗者中誘發(fā)的主要是同型免疫。為了提高疫苗效力，開始了多價(jià)重配疫苗的研制。首例自然發(fā)生的人RV基因重配株37于1985年在委內(nèi)瑞拉新生兒感染糞樣中分離獲取。由于不同亞群重配株在自然狀態(tài)下很難見到，人們利用輪狀病毒RNA在自然或?qū)嶒?yàn)條件下易于發(fā)生基因重組的特性，運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建了單基因替換重組體，使之既能誘生對(duì)人RV親本株的免疫力又保留動(dòng)物RV親本株減毒特性及在體外高滴度生長(zhǎng)的能力。由Kapikian等分別以編碼人輪狀病毒3個(gè)主要血清型的VP7基因作為親本，其余10個(gè)基因都來自恒河猴輪狀病毒(MMU18006G3型)，構(gòu)建了4價(jià)恒河猴RV疫苗(RRV-TV)。申碩等組建了以羊RVLc40(G10)為背景，攜帶猴RVSA11(G3)第4，9基因片段的羊-猴RV基因重配株L-S4/9，該實(shí)驗(yàn)室還以羊RV為背景，組建了羊與人RV的雜交株L13XDS-1(G2)，L-S4/9XHochi(G4)。羊RVLL-85的弱毒株是我國(guó)獨(dú)有的相當(dāng)理想的受體株，這對(duì)于人用RV疫苗的開發(fā)具有重要意義。這些重組株對(duì)人RV所有4個(gè)血清型有刺激同源免疫的可能性，同時(shí)又獲得滿意的減毒和遺傳學(xué)穩(wěn)定性。獲得成功的是1998年8月31日在美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的Wyeth-Lederle公司生產(chǎn)的4價(jià)口服RRV-TV疫苗，ACIP(美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心免疫實(shí)施咨詢委員會(huì))批準(zhǔn)此疫苗納入兒童計(jì)劃疫苗(VFC)中。但次年11月，該疫苗不得不撤離市場(chǎng)的原因是接到輪狀病毒疫苗在15名嬰兒中導(dǎo)致腸套疊的疫苗有害事件報(bào)告。因此，安全性是成了研制RV疫苗的首要考慮因素。
第三代RV疫苗—基因工程疫苗。隨著基因工程的興起，采用基因工程原理與技術(shù)研制的新型疫苗克服了以上傳統(tǒng)疫苗的不足，取得了不少進(jìn)展。有代表性的有以下幾種(1)亞單位或多肽疫苗 運(yùn)用基因工程方法采用原核或真核表達(dá)載體表達(dá)病毒的抗原基因作為免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫。如1987年Meccrea等將VP7編碼基因中的不同區(qū)段分別與pEX重組，結(jié)果只有pEX3/8/5一種重組方式較為理想，經(jīng)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)后可高產(chǎn)量地合成β-Gal-VP融合蛋白，用之免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異的高滴度的免疫抗血清。試驗(yàn)證明此種疫苗安全、有效，與重組疫苗交替使用可成為其加強(qiáng)劑。但亞單位疫苗最大的缺點(diǎn)是高度純化的疫苗免疫原性較弱，不能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和局部免疫應(yīng)答，而預(yù)防輪狀病毒感染恰恰需要腸道的局部免疫。
(2)DNA疫苗 DNA疫苗是90年代初發(fā)展起來的一種疫苗形式。以其良好持久的免疫反應(yīng)性、制備簡(jiǎn)單、易于保存等傳統(tǒng)疫苗難以比擬的優(yōu)點(diǎn)而受到普遍重視。DNA疫苗是利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種外源蛋白的目的基因，或?qū)追N不同病原體的保護(hù)性抗原的DNA序列克隆到一個(gè)載體上制成的多價(jià)DNA疫苗，注入宿主體內(nèi)，使之長(zhǎng)期地在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，從而激發(fā)免疫反應(yīng)及保護(hù)性免疫應(yīng)答。也可將抗原基因與某些細(xì)胞因子克隆到同一載體上，起到聯(lián)合免疫和增強(qiáng)免疫效果的作用。Greenberg等將編碼鼠RV VP4、VP6、VP7基因的cDNA插入表達(dá)質(zhì)粒pCMV作為DNA疫苗，對(duì)同型RV有一定保護(hù)作用，表明DNA疫苗可能是控制RV腹瀉一種新方法。其缺點(diǎn)是免疫原性較低，口服免疫不能有效激發(fā)局部免疫。
(3)轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組蛋白，細(xì)胞易培養(yǎng)且保留重組蛋白天然免疫原性，轉(zhuǎn)化植株的種子易于儲(chǔ)存，具有安全、廉價(jià)、便于大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，使轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗成為當(dāng)前一大熱點(diǎn)，并為“生物制藥”提供了可能性。目前人們已建立了煙草、馬鈴薯、西紅柿、香蕉等轉(zhuǎn)植物基因表達(dá)系統(tǒng)，并成功地獲得了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、鏈球菌屬突變株表面蛋白(spaA)等十幾種疫苗。在發(fā)展中國(guó)家生產(chǎn)并接種這種由植物制備的“可食用疫苗”為RV疫苗的研究和發(fā)展開拓了更廣闊的前景。
2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)化疫苗目前，研究成功的轉(zhuǎn)基因疫苗中約80％是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。這種表達(dá)系統(tǒng)的成功構(gòu)建源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是一種寄主非常廣泛的土壤細(xì)菌，在自然狀態(tài)下它能通過傷口侵染大多數(shù)雙子葉植物，導(dǎo)致冠癭瘤的發(fā)生[4]。其侵染機(jī)理是基于農(nóng)桿菌體內(nèi)的Ti質(zhì)粒和vir基因即毒性區(qū)兩部分的共同參與，Ti質(zhì)粒中有一個(gè)DNA片斷，稱為轉(zhuǎn)移DNA(Transfer DNA，T-DNA)。大多數(shù)雙子葉植物組織受到創(chuàng)傷后，誘導(dǎo)植物細(xì)胞分泌某些酚類物質(zhì)，如乙酰丁香酮(acetosyringone，簡(jiǎn)稱AS)或羥基乙酰丁香酮(ahydroxyacetosyringone，簡(jiǎn)稱OH-AS)，這些酚類物質(zhì)即成為創(chuàng)傷信號(hào)分子或創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。vir基因受到創(chuàng)傷信號(hào)刺激后，轉(zhuǎn)錄活化其一系列基因VirA、B、C、D、E、F、G、H等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物最終形成膜通道以便于T-DNA復(fù)合物向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移。T-DNA復(fù)合物通過其左右邊界各為25bp的重復(fù)序列以單拷貝或多拷貝的形式將T-DNA復(fù)合物插入到宿主基因組中。將外源基因與T-DNA左右臂相連，同樣可以將外源基因整合進(jìn)植物基因組并得以表達(dá)，而且整合進(jìn)植物基因組的外源DNA片斷能夠通過減數(shù)分裂以孟德爾遺傳方式傳遞給后代[5]。
利用農(nóng)桿菌的這一特性，人們已構(gòu)建了多種Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)。Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)包括兩個(gè)基本要素第一，含有T-DNA邊界序列的一個(gè)重組質(zhì)粒載體，這個(gè)質(zhì)粒能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌之間進(jìn)行穿梭。這是因?yàn)門i質(zhì)粒是一個(gè)大質(zhì)粒，很難對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的基因克隆操作，必須借助于一個(gè)中間的載體質(zhì)粒，在大腸桿菌上進(jìn)行常規(guī)的基因操作，連接上外源基因，然后轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌中，與相應(yīng)的Disarmed Ti質(zhì)粒共同組成一個(gè)完整的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)；第二，作為載體系統(tǒng)的質(zhì)粒和農(nóng)桿菌株必須含有完整的vir基因。
目前，廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)有共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。共整合載體是指Ti質(zhì)粒上編碼致瘤基因的序列被一段pBR322 DNA所替代，帶外源基因的pBR322衍生中間載體由大腸桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，二者相同的pBR322序列發(fā)生同源重組，外源基因就此整合到disarmed Ti質(zhì)粒上。雙元載體系統(tǒng)是指一個(gè)農(nóng)桿菌株系中含有兩個(gè)彼此分離的質(zhì)粒一個(gè)是含有T-DNA和外源基因重組的多功能克隆載體質(zhì)粒，它即能在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制，又能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行復(fù)制，并能從大腸桿菌遷移到土壤農(nóng)桿菌中；另一個(gè)是含有vir基因序列的Ti衍生質(zhì)粒。
3.植物轉(zhuǎn)化方法有許多種方法可以將外源基因?qū)雴巫尤~植物和雙子葉植物。將外源基因穩(wěn)定整合入植物染色體基因組DNA的主要方法包括1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；2)DNA直接攝入法，包括PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)融合法、電激法、微管注射法以及使用基因槍將DNA直接送入植物細(xì)胞和組織等。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是利用質(zhì)粒載體將特定的DNA片段整合入植物染色體基因組DNA。植物組織的轉(zhuǎn)化方法因植物和農(nóng)桿菌系統(tǒng)而異。最常用的方法是葉盤法，它適用于任何易于再生成完整植株的植物外植體。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法特別適用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。
正如上面已提到的各種DNA直接攝入轉(zhuǎn)化方法，電激法是先將原生質(zhì)體置于放在一個(gè)強(qiáng)電場(chǎng)中，在電流作用下將外源DNA送入原生質(zhì)體內(nèi)。微管注射法是用微管將DNA直接注射入細(xì)胞中?；驑尫ㄊ菍NA先吸附在硫酸鎂或鎢粒上，這些顆粒被加速射入植物細(xì)胞或組織中。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)先實(shí)施方案，農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒系統(tǒng)被選用。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中含有一段叫做轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的，它可以進(jìn)入植物細(xì)胞并整合入植物的染色體中。轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建分為兩步，首先是構(gòu)建一個(gè)可以在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒，這個(gè)質(zhì)粒含有目的基因(在這里專指輪狀病毒外殼蛋白抗原基因)；抗原基因的兩端含有T-DNA邊界序列，它負(fù)責(zé)目的基因在植物基因組中的插入位點(diǎn)。通常另外一個(gè)選擇標(biāo)志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右邊界序列中，該基因在植物細(xì)胞中表達(dá)后可提供一個(gè)選擇標(biāo)記證實(shí)植物或植物細(xì)胞是否含有整合的T-DNA序列。載體構(gòu)建的第二步是將質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。這可以通過電穿孔直接導(dǎo)入方式完成。為了T-DNA的轉(zhuǎn)移，所用的農(nóng)桿菌菌株中還要含有一套誘導(dǎo)基因，它們?cè)赥-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中起重要作用。
植物組織的轉(zhuǎn)化方法因植物和農(nóng)桿菌介導(dǎo)系統(tǒng)而異。最常用的是植物葉盤轉(zhuǎn)化法，它適于多種易于再生的植物外植體。在某些情況下，還需要加入一些輔助細(xì)胞。其他的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，繼而由原生質(zhì)體再生出植物細(xì)胞及完整植株。
4.基因表達(dá)啟動(dòng)子在受體植物和轉(zhuǎn)化方法確定之后，一個(gè)組成型的、發(fā)育調(diào)節(jié)型的或組織特異型的表達(dá)啟動(dòng)子被選擇以便外源基因能夠在植物中表達(dá)。
所有已知能操縱外源基因在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子都可以在應(yīng)用在本發(fā)明中。這些啟動(dòng)子可從植物或病毒中獲得，如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(包括經(jīng)過拼接、加倍和突變改造后的35S啟動(dòng)子)；光誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子如核糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)；逆境誘導(dǎo)基因如乙醇脫氫酶(Adh1)或玉米肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子生成，但不僅限于此。本發(fā)明也可利用已知在植物可食部分高效表達(dá)的啟動(dòng)子如馬鈴薯質(zhì)體基因啟動(dòng)子。
用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒通常含有一個(gè)選擇標(biāo)志基因。許多有此功能的基因已被開發(fā)出來。
具體實(shí)施例方式
下面以轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和西紅柿生產(chǎn)輪狀蛋白抗原為例，描述一個(gè)優(yōu)先的實(shí)施方案。
實(shí)施例1輪狀病毒外殼蛋白抗原植物表達(dá)載體PBI121/VP7構(gòu)建如圖1所示，輪狀病毒(血清型G1)總RNA被從腹瀉患兒的糞便中分離出來作為模版，根據(jù)已知的輪狀病毒RNA核酸序列合成特定的引物，具體堿基序列見序列表中Seq.ID.No.1-2，并通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得了輪狀病毒外殼蛋白VP7基因。在3’端引物中引入了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列SEKDEL，具體堿基序列見序列表中Seq.ID.No.3，以上述擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物為模板，上游引物不變，再次擴(kuò)增。將此PCR產(chǎn)物回收，純化，直接克隆到PUC-T載體，經(jīng)酶切鑒定選擇反向插入的克隆，命名為PUC/VP7，通過進(jìn)一步的序列分析，確定輪狀病毒外殼蛋白基因VP7閱讀框正確、完整，并已和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列SEKDEL融合。
用限制性內(nèi)功酶XbaI和SacI雙酶切將輪狀病毒蛋白基因VP7切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質(zhì)粒pBI121原GUS基因位點(diǎn)上(XbaI和SacI雙酶切)便構(gòu)建成雙元表達(dá)載體PBI121/VP7。
質(zhì)粒pBI121購(gòu)自美國(guó)Clonetech公司，它的XbaI和SacI限制性酶切位點(diǎn)分別位于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和GUS基因起始密碼之間以及GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質(zhì)粒pBI121是因?yàn)橛肵baI和SacI雙酶切可將GUS基因刪除，而隨后可插入另一個(gè)蛋白基因。新基因?qū)⒛軌蛟谥参锛?xì)胞內(nèi)表達(dá)。質(zhì)粒pBI121還含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移II基因(NPT II)，它編碼的酶可為植物細(xì)胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細(xì)胞和組織篩選出來。NPT II基因有自己的啟動(dòng)子和多聚腺酸信號(hào)序列，它們?cè)醋噪僦瑝A(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
質(zhì)粒PBI121/VP7含有1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供給植物細(xì)胞卡那霉素抗性；2)輪狀病毒外殼蛋白抗原基因VP7及操縱基因的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；3)T-DNA左右邊界序列，它可將NPT II基因和輪狀病毒外殼蛋白抗原基因VP7轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)并整合到植物染色體中。PBI121/VP7的結(jié)構(gòu)如圖4所示。
實(shí)施例2.將表達(dá)載體PBI121/VP7導(dǎo)入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)含有輪狀病毒外殼蛋白抗原基因VP7的質(zhì)粒PBI121/VP7被通過電穿孔的方式轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，該菌株來自美國(guó)Clonetech公司。菌株LBA4404現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用是因?yàn)樗且桓脑旌蟮霓r(nóng)桿菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已經(jīng)被刪除。Vir基因可反式調(diào)節(jié)T-DNA自質(zhì)粒PBI121/VP7向植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
將OD值為0.6～0.8的農(nóng)桿菌液20ml離心后，去離子水洗兩次，重懸于1ml 10％甘油；以40μl菌液加入2μl(約50ng)重組質(zhì)粒PBI121/VP7，充分混勻；參數(shù)設(shè)置電穿孔杯為0.1cm，電容25μF，電阻200Ω，電場(chǎng)強(qiáng)度18kv/cm。經(jīng)電擊后加入LB 0.8ml和1M葡萄糖20μl混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，28℃225轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3hr；取100μl鋪于含鏈霉素125mg/ml、卡那霉素50mg/ml的LB平板上，28℃培養(yǎng)36h，含有PBI121/VP7重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落開始產(chǎn)生。
用堿裂解法從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶酶切可檢測(cè)PBI121/VP7質(zhì)粒DAN是否存在。
實(shí)施例3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化植物的遺傳轉(zhuǎn)化首先是植物組織器官與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，在培養(yǎng)約2天后，將植物外植體移置相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基中。植物外植體可以是原生質(zhì)體、愈傷組織或其它器官組織，因植物而異。我們選用子葉或莖段轉(zhuǎn)化方法。
馬鈴薯無菌苗[品種為臺(tái)灣紅(Taiwanhong)，西南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心提供]。生長(zhǎng)在23℃光照培養(yǎng)箱中，輔之以中等光照強(qiáng)度下，每隔3個(gè)星期剪取頂端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)2星期的馬鈴薯莖段最適于轉(zhuǎn)化。西紅柿(重慶市農(nóng)作物研究所提供)則以7-10日齡的子葉或下胚軸無菌外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
含有表達(dá)載體PBI121/VP7的農(nóng)桿菌LBA4404接種在50ml YEP培養(yǎng)基(含50mg/ml卡那霉素和125mg/ml鏈霉素)中28℃培養(yǎng)2天，5000g離心5分鐘收集菌體，用25ml液體MS培養(yǎng)液(含抗生素)洗滌一次，再用MS重新懸浮至OD600nm＝0.5-0.8。將有傷口的葉片浸入稀釋后的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中3-5分鐘，用無菌濾紙吸干葉片上多余的菌液，然后將葉片移置不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上23-25℃共培養(yǎng)2天。將外置體移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有100-200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧芐青霉素，以后每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基。當(dāng)葉片傷口處愈傷有幼芽形成并長(zhǎng)至足夠大時(shí)，將幼芽切下(通常在轉(zhuǎn)化后45天或更長(zhǎng))轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。當(dāng)根出現(xiàn)后，將再生植株移置無菌條件下生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移到土壤中，給予適宜的溫度、光照和營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。
實(shí)施例4.抽提陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株植物的總DNA按照CTAB法(McCouch，1988)，取100mg新鮮植物的葉片、莖、塊莖或果實(shí)，液氮冷凍后研成粉末狀，加入兩倍體積60℃預(yù)熱的勻漿緩沖液(CTAB 2％V/W，NaCl 1.4mol/L，EDTA0.02mol/L，Tris-HCl 0.1mol/L)輕輕顛倒混勻，60℃保溫45分鐘。加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加等體積的氯仿/異戊醇，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加2/3體積預(yù)冷的異丙醇，混勻。-20℃放置2-3小時(shí)或過夜。11,000rpm離心10分鐘。棄上清，沉淀干燥，加適量的TE溶解沉淀。加1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.2)和2-3倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20℃過夜。11,000rpm離心10min，棄上清。自然晾干沉淀，加適量TE溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)上測(cè)定OD260、OD280及其比值，并進(jìn)行DNA的定量。然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 上述抽提的總DNA稀釋10倍后取1ul作為PCR模板，按前面擴(kuò)增vp7的條件進(jìn)行擴(kuò)增，取5μlPCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。待DNA條帶遷移到合適位置，終止電泳并在紫外燈下照相紀(jì)錄結(jié)果。
實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的RNA分析利用地高辛標(biāo)記的包膜中蛋白基因探針，對(duì)PBI121/VP7表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的卡那霉素抗性馬鈴薯植株RAN進(jìn)行了雜交分析。
轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的葉片總RNA被提取，方法見參考文獻(xiàn)(27)。取2g材料放入研缽中，倒入液氮，研成粉未。收進(jìn)50ml離心管中，加入10ml(5ml/g)65℃預(yù)熱的抽提buffer，振蕩30s。65℃水浴，振蕩2-3min。加入等體積氯仿，振蕩10min。18℃，12000g離心5min。(重復(fù)一次)加入1/4體積的LiCl(10M)，4℃過夜。4℃，10000g離心20min。500μl 0.5％SDS溶解沉淀。加入等體積氯仿，再次抽提一次。加入2倍體積無水乙醇，-20℃，2h。10000g，4℃，離心20min；吹干沉淀10min。DEPC處理水溶解沉淀(或用70％乙醇懸浮，-70℃保存)。沉淀溶于DEPC處理過的無RNA酶水中，RNA濃度可用紫外分光光度通過測(cè)定130nm的吸光值進(jìn)行估算定量，置-20℃保存?zhèn)溆?。，假?mg/ml的RNA吸光值是25單位。
取10μg RNA樣品，約5μl，與2倍體積RNA樣品緩沖(10ml去離子甲酰胺，3.5ml 37％甲醛，2ml 5XMOPS)混合后，65℃加熱5分鐘，冷卻后，加入3μl RNA加樣緩沖液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚藍(lán))，然后經(jīng)過1％的RNA瓊脂糖凝膠電泳。核酸通過毛吸管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Roche公司產(chǎn)品Cat.NO.1417240)上，所用的緩沖液為20×SSC，pH7.2(3M NaCl，300mM醋酸鈉，pH7.0)，轉(zhuǎn)移時(shí)間為16小時(shí)。核酸通過紫外線照射后被交連在尼龍膜上，將膜置于預(yù)雜交液中[50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt試劑，0.1％SDS]，68℃預(yù)雜交3小時(shí)，然后更新的雜交液[50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt試劑，0.1％SDS0.02％SDS，1％的封閉劑(Roche公司試劑盒提供)，5ml雜交液中加入變性的地高辛標(biāo)記的DNA探針60ng進(jìn)行雜交，探針是來自質(zhì)粒PBI121/VP7的XbaI和SacI的酶切片段，包括了輪狀病毒vp7基因的全部編碼序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列SEKDEL。在雜交液中68℃雜交24小時(shí)后，取出雜交膜，于200ml 2×SSC，0.1％SDS緩沖液中室溫下洗膜2次，然后于100ml0.1×SSC，0.1％SDS緩沖液中68℃洗膜2次。顯色反應(yīng)基本依據(jù)試劑盒中提供的方法(Roche公司試劑盒)，尼龍膜先于洗脫緩沖液
中平衡5分鐘，然后用50ml 1×封閉緩沖液封閉30分鐘，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛的抗體至濃度為75mU/ml，室溫下反應(yīng)30分鐘，用洗脫緩沖液2次，每次15分鐘。將膜移置20ml顯色緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)中平衡5分鐘，更換新的底物緩沖液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml顯色緩沖液)，遮光條件下顯色16小時(shí)，待所期望的條帶出現(xiàn)后，用水終止反應(yīng)。
攜帶有質(zhì)粒PBI121/VP7的轉(zhuǎn)基因植株和陰性對(duì)照植物的RNA雜交。不同轉(zhuǎn)基因植株的RNA雜交信號(hào)變異很大，這可能是由于基因的插入位點(diǎn)和基因的拷貝數(shù)不同引起的。和標(biāo)準(zhǔn)RNA分子量相比，轉(zhuǎn)錄的RNA約有1kb長(zhǎng)，與預(yù)先估計(jì)的相一致。陰性對(duì)照植物的RNA沒有觀察到雜交信號(hào)。
實(shí)施例6.不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株輪狀病毒外殼蛋白含量的測(cè)定取不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片0.1g，各加入1.5ml去離子水，在4℃下用玻璃勻漿器磨碎。勻漿液16000g 4℃離心5分鐘，利用Bradford法(蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司)，取部分上清液測(cè)定可溶性蛋白含量，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。以MA104細(xì)胞培養(yǎng)的人源輪狀病毒總蛋白為陽(yáng)性對(duì)照(VP7蛋白含量為總病毒蛋白含量的30％)。陽(yáng)性對(duì)照被稀釋成不同蛋白水平(即VP7蛋白含量為0.01-5.0ng)，在顏色反應(yīng)后，讀取492nm光吸收值，制備一條標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。如圖4中所示，通過比較發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照植物中(柱1)沒有發(fā)現(xiàn)含有輪狀病毒VP7蛋白，而在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中則可以檢測(cè)到不同含量的輪狀病毒VP7蛋白，含量約為植物可溶性蛋白2-380ng/mg(柱2至柱21)。不同轉(zhuǎn)基因馬鈴薯之間差異比較大這可能是由于基因插入的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)不同引起的。
實(shí)施例7.轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織器官輪狀病毒VP7蛋白含量的測(cè)定取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片、莖和塊組織各0.2g，處理和測(cè)定方法同上。表2中列出了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不同組織器官中輪狀病毒VP7蛋白的含量。
馬鈴薯葉子中的輪狀病毒VP7蛋白表達(dá)量最高約為可溶性蛋白的0.014％，為380ng/g鮮重。馬鈴薯塊莖中的輪狀病毒VP7蛋白含量略高，為可溶性蛋白的0.013％，約為420ng/g鮮重，這就為加工和利用馬鈴薯塊提供了極大的方便。
表2馬鈴薯葉子、莖和塊莖中的包膜中蛋白含量器官Ng/bm可溶性蛋白(＝％) ng/g鮮重葉子140(0.014％)380塊莖130(0.013％)420實(shí)施例8.Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中輪狀病毒VP7蛋白選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株，取其試管薯塊莖進(jìn)行可溶性蛋白提取。同時(shí)以具體操作為取新鮮馬鈴薯塊莖，用解剖刀切成小薄片放入研缽，加入液氮冷凍后，迅速用研缽磨成粉末。按200μl/100mg的比例加入提取緩沖液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巰基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)，待樣品充分溶解后，于4℃、13000rpm離心20min取上清備用。用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
取50μl轉(zhuǎn)基因植物蛋白抽提液加入等體積的樣品緩沖液(20％蔗糖，0.05％溴酚蘭，0.125％mol/L Tris·HCl pH6.8，4％SDS，14mmol/L巰基乙醇)，沸水煮5min，冰水浴2min使冷卻。離心棄沉淀后樣品用于電泳分析。取樣品30-40μl上樣12％SDS-PAGE凝膠，同時(shí)上樣蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，75V電泳30min后，150V電泳2-3h待溴酚蘭帶遷移到凝膠末端結(jié)束電泳。用Bio-Rad半干電泳轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)處理的PVDF膜上(蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移緩沖液為25mmol/L Tris·HCl pH8.3，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇)，恒流30mA，電轉(zhuǎn)2Hr或過夜。麗春紅染色后標(biāo)上標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以便后面檢測(cè)靶蛋白的大小。然后用水輕輕洗去染料。將膜置于4℃封閉過夜。次日按試劑盒說明書進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)和發(fā)光實(shí)驗(yàn)，最后于暗盒中對(duì)X-片曝光10秒，并進(jìn)行后續(xù)處理。
雜交反應(yīng)結(jié)果如圖6。它表明了來自轉(zhuǎn)基因馬鈴薯組織的蛋白與輪狀病毒特異性抗體發(fā)生了特異性抗原抗體反應(yīng)，從而證實(shí)了輪狀病毒VP7蛋白存在于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯組織中。其分子量大小約38KD，與預(yù)期的VP7蛋白的大小一致。而陰性對(duì)照植物塊莖則未觀察到任何雜交反應(yīng)信號(hào)，說明雜交反應(yīng)特異、結(jié)果可信。
實(shí)施例9西紅柿的轉(zhuǎn)化方案西紅柿種子(中蔬5號(hào)，重慶市農(nóng)作物研究所提供)在20％的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒20分鐘，然后用無菌的超純水，仔細(xì)漂洗3次或更多次。大約50粒消毒過的種子，各自播種在含有1/2 MS0培養(yǎng)基的一個(gè)濕盒中。農(nóng)桿菌侵染生長(zhǎng)7-10天后子葉或下胚軸無菌外植體，該外植體不需預(yù)培養(yǎng)，而是在切下后立即浸入農(nóng)桿菌菌液中5-10分鐘，取出后用濾紙吸干多余的菌液，后移置共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS1(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光條件下共培養(yǎng)2天。然后將外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基MS2(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素)誘導(dǎo)愈傷組織形成和幼苗分化(28)。在4到6周內(nèi)，出現(xiàn)最初的發(fā)芽。當(dāng)這些芽苗長(zhǎng)到至少2厘米時(shí)，便從外植體上切下來，并確保至少包含有一個(gè)莖節(jié)，放入含有西紅柿根選擇性培養(yǎng)基中。新生根在約2星期內(nèi)開始出現(xiàn)。然后轉(zhuǎn)移到滅菌土壤中，給予適宜的條件培養(yǎng)生長(zhǎng)。
實(shí)施例10.PCR檢測(cè)輪狀病毒VP7基因在西紅柿中的整合情況西紅柿基因組DNA的提取方法基本同前實(shí)施例4馬鈴薯基因組DNA的提取(29)。取100mg新鮮葉片或塊莖，液氮冷凍后研成粉末狀，加入兩倍體積60℃預(yù)熱的勻漿緩沖液(CTAB 2％V/W，NaCl 1.4mol/L，EDTA 0.02mol/L，Tris-HCl 0.1mol/L)輕輕顛倒混勻，60℃保溫45分鐘。加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加等體積的氯仿/異戊醇，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加2/3體積預(yù)冷的異丙醇，混勻。-20℃放置2-3小時(shí)或過夜。11,000rpm離心10分鐘。棄上清，沉淀干燥，加適量的TE溶解沉淀。加1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.2)和2-3倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20℃過夜。11,000rpm離心10min，棄上清。自然晾干沉淀，加適量TE溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)上測(cè)定OD130、OD280及其比值，并進(jìn)行DNA的定量。然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 取上述西紅柿基因組DNA 1μg約1μl作為模版，加入針對(duì)輪狀病毒VP7基因序列的特異性引物各1μl，10×PCR緩沖液3μl，dNTP(各2.5mM)3μl，Taq酶0.5μl約2.5U，加水至總體積50ul。94℃5分鐘熱變性，然后94℃45秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72℃10分鐘結(jié)束反應(yīng)，取5ul擴(kuò)增樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。陰性對(duì)照植物中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的條帶，而在轉(zhuǎn)基因西紅柿植物中則可擴(kuò)增出1個(gè)約1000bp的特異性條帶，該結(jié)果表明輪狀病毒VP7蛋白基因已整合進(jìn)入西紅柿基因組DNA中。
實(shí)施例11.轉(zhuǎn)基因西紅柿的RNA分析轉(zhuǎn)基因西紅柿葉片和未成熟果實(shí)中RNA的提取方法如同實(shí)施例5。RNA樣品被倍比稀釋后，通過點(diǎn)雜交轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Roche公司產(chǎn)品Cat.NO.1209299)，紫外光照射3分鐘進(jìn)行交連，風(fēng)干。雜交與顯色反應(yīng)如同實(shí)施例5。
輪狀病毒VP7基因在轉(zhuǎn)基因植物聽表達(dá)量可以通過RNA印跡反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。分別從轉(zhuǎn)基因西紅柿葉子、綠色果實(shí)和非轉(zhuǎn)基因西紅柿植株葉片中提取的總RNA，通過點(diǎn)雜交裝置被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用地高辛標(biāo)記的輪狀病毒VP7蛋白編碼序列DNA探針進(jìn)行雜交。圖7是轉(zhuǎn)基因西紅柿葉子和果實(shí)中總RNA與探針雜交的結(jié)果，從雜交信號(hào)的強(qiáng)度比較來看。葉子中輪狀病毒VP7蛋白mRNA含量是果實(shí)中的2-3倍。而非轉(zhuǎn)基因西紅柿的葉子總RNA在高濃度下有較弱的雜交信號(hào)產(chǎn)生，但與轉(zhuǎn)基因西紅柿葉子相比可以認(rèn)為是非特異性的。由于在雜交中同時(shí)加入了已知含量的PBI121/VP7質(zhì)粒DNA(含輪狀病毒VP7蛋白編碼序列)作為陽(yáng)性對(duì)照，相互比較發(fā)現(xiàn)，VP7蛋白基因在轉(zhuǎn)基因西紅柿葉子和被忠實(shí)轉(zhuǎn)錄并積累到較高水平，約占植物mRNA的0.01％，屬豐富mRNA。在成熟果實(shí)中RNA的含量很低，不能通過RNA印跡分析。
實(shí)施例12.葉子和果實(shí)中輪狀病毒VP7蛋白含量的測(cè)定VP7蛋白含量的測(cè)定方法同前實(shí)施例6，用研缽將植物組織磨碎，在磨碎過程中加入液氮，植物組織粉末中加入10倍體積滅菌無離子水進(jìn)行稀釋。植物勻漿液16000g 4℃離心5分鐘，依據(jù)Bradford試劑盒(Bio-Rad)提供的方法，取部分上清液測(cè)定可溶性蛋白含量，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。以MA104細(xì)胞培養(yǎng)的人源輪狀病毒總蛋白為陽(yáng)性對(duì)照(VP7蛋白含量為總病毒蛋白含量的30％)。陽(yáng)性對(duì)照被稀釋成不同蛋白水平(即VP7蛋白含量為0.01-5.0ng)，在顏色反應(yīng)后，讀取492nm光吸收值，制備一條標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。
表3中列出了轉(zhuǎn)基因西紅柿葉子和果實(shí)中包膜中蛋白的含量。取在溫室中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因西紅柿的綠葉和紅色果實(shí)進(jìn)行可溶性蛋白和輪狀病毒VP7蛋白含量的測(cè)定，就象上述所描述的那樣。非轉(zhuǎn)基因植物葉子和果實(shí)中檢測(cè)不到輪狀病毒VP7蛋白。
表3西紅柿葉子和果實(shí)中的包膜中蛋白含量器官ng/mg可溶性蛋白 ng/g鮮重葉子36(0.0036％)162果實(shí)(紅)48(0.0048％)102西紅柿葉子的包膜中蛋白含量略高于馬鈴薯葉片，表達(dá)量為可溶性蛋白的0.0036％。在成熟果實(shí)中包膜中蛋白的含量約占可溶性蛋白的0.0048％，或?yàn)?02ng/g鮮重。因?yàn)楣麑?shí)的密度比較高，西紅柿果實(shí)中的包膜中蛋白表達(dá)量集中了西紅柿植株包膜中蛋白的大部分，一個(gè)重100克的西紅柿果實(shí)含有大約10ug包膜中蛋白重組抗原。
實(shí)施例13.轉(zhuǎn)基因植物在小鼠中引發(fā)的免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)小鼠直接口服以轉(zhuǎn)輪狀病毒VP7基因馬鈴薯塊莖。對(duì)照組小鼠則直接口服未轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯塊莖。給每一只實(shí)驗(yàn)小鼠所服用的抗原的劑量相當(dāng)，例如所含VP7蛋白量為42或者84微克。在給藥前一天，所有小鼠除水外停止一切進(jìn)食并分籠飼養(yǎng)。在免疫的第0、7、14、42天，直接稱取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖(1g或2g/每份)，用解剖刀切成薄片，涂上免疫佐劑(CT或CTB)，用長(zhǎng)約6-8cm的注射針頭將馬鈴薯片串起來，置小鼠籠上。待小鼠吃完馬鈴薯片或24h后給飼料。在免疫前0、7、14、21、35、42、67天收集血液、尿液、唾液和糞便，作適當(dāng)處理后-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 用ELISA方法檢測(cè)結(jié)果表明，各試驗(yàn)組的動(dòng)物免疫了馬鈴薯后，均檢測(cè)到體液和粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中，血清中只檢測(cè)到IgG抗體，IgG抗體滴度從免疫后開始隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在免疫后第42天達(dá)到最高滴度，而在第67天略有下降，表明轉(zhuǎn)VP7基因馬鈴薯疫苗可以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。試驗(yàn)組小鼠的唾液、糞便和尿液中均檢測(cè)到IgA，未檢測(cè)到IgG抗體，而轉(zhuǎn)空載體馬鈴薯免疫小鼠粘膜相關(guān)組織分泌液中(對(duì)照組)均未檢測(cè)到任何HVP7特異性IgA和IgG抗體?？贵w滴度從免疫后開始隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在免疫后第42天達(dá)到最高滴度，而在第67天基本維持。鑒于抗體在免疫后第42天達(dá)到最高峰，我們選取免疫前和免疫后第42天這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)了唾液、尿液和糞便中的特異性抗體濃度。結(jié)果表明，在免疫后第42天可以檢測(cè)到抗VP7特異性IgA抗體，而在免疫前檢測(cè)不到抗VP7特異性IgA抗體。糞便中的抗VP7特異性IgA抗體滴度最高，唾液次之，尿液中最低，幾乎檢測(cè)不到，表明轉(zhuǎn)VP7基因馬鈴薯疫苗可以誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答。
為了檢測(cè)抗體的中和病毒能力，我們進(jìn)行了體外病毒中和試驗(yàn)。在進(jìn)行RV接種MA104細(xì)胞的同時(shí)，加入不同稀釋度的IgA或IgG抗體共同培養(yǎng)。以綠色熒光標(biāo)記抗HRV抗體檢測(cè)細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞，當(dāng)樣品孔發(fā)光細(xì)胞數(shù)比陽(yáng)性對(duì)照發(fā)光細(xì)胞數(shù)減少了60％，表明該孔加入的抗體有中和病毒的效力。結(jié)果表明，當(dāng)稀釋倍數(shù)低于40-60倍時(shí)，加了IgA的樣品孔發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)均低于陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)60％以上，且隨著IgA稀釋倍數(shù)的增加，發(fā)光細(xì)胞數(shù)也相應(yīng)增加，表明當(dāng)IgA稀釋倍數(shù)低于40-60時(shí)，IgA抗體起到了中和病毒的作用，從而抑制了RV感染細(xì)胞。同樣，加入了IgG抗體的樣品孔細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)，但僅有稀釋倍數(shù)低于2-4倍時(shí)，IgG才具有中和病毒的效力，當(dāng)高于2-8倍時(shí)，熒光染色的細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照孔沒有差別，因而判定為IgG基本無中和效力。
上述結(jié)果表明，VP7轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以在體誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答和局部免疫應(yīng)答，局部免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的特異性抗體主要為分泌型IgA，在中和病毒方面IgA發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，這與以往的研究一致。因此，VP7轉(zhuǎn)基因植物疫苗是HRV感染的預(yù)防性疫苗的候選形式。
本發(fā)明的進(jìn)一步描述只是一些特別的優(yōu)先實(shí)施方案，是按照專利申請(qǐng)要求和為了解釋和說明本專利的內(nèi)容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，可在此基礎(chǔ)上，做進(jìn)一步的改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)人源輪狀病毒抗原或其片段或其融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原蛋白在自然狀態(tài)下具有免疫原性。
2.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原是粘膜性抗原。
3.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原是病毒外殼抗原。
4.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原是人源A組輪狀病毒的外殼抗原VP7。
5.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原融合蛋白是人源A組輪狀病毒的外殼抗原VP7與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列SEKDEL的融合蛋白。
6.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原是具有Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列的基因所編碼的VP7抗原。
7.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的抗原是具有Seq.ID.No.5所示的氨基酸序列的VP7抗原。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的植物是至少有一部分可食用的植物。
9.如權(quán)利要求8中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所說的植物是西紅柿、馬鈴薯、萵苣、胡蘿卜、黃瓜或其它可食用的植物。
10.一種轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)，特征在其于由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞衍生而來的。
11.一種轉(zhuǎn)基因植物的葉子，特征在其于由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞衍生而來的。
12.一種轉(zhuǎn)基因植物的莖，特征在其于由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞衍生而來的。
13.一種轉(zhuǎn)基因植物的根，特征在其于由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞衍生而來的。
14.一種轉(zhuǎn)基因植物的種子，特征在其于由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞衍生而來的。
15.轉(zhuǎn)基因植物材料或其加工提取物在制備用于預(yù)防嬰幼兒腹瀉方面的食物疫苗或藥物制劑中的用途，其特征在于使用安全有效量的如權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)基因植物材料或其加工提取物。
16.如權(quán)利要求15中所述的用途，其中所說的轉(zhuǎn)基因植物材料作為食物疫苗可直接食用。
17.如權(quán)利要求15中所述的用途，其中所說的轉(zhuǎn)基因植物材料或其加工提取物與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或賦形劑一起構(gòu)成藥物制劑。
18.如權(quán)利要求15中所述的用途，其中所說的藥物制劑加工成膠囊、沖劑或其它制劑。
19.如權(quán)利要求15中所述的用途，其中所說的食物疫苗或藥物制劑經(jīng)口服或腸道給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)人源輪狀病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，并進(jìn)而通過直接食用或腸道給藥方式利用這些含有人源輪狀病毒外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動(dòng)物對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1661009SQ20041002193
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者吳玉章, 李晉濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍免疫學(xué)研究所