專利名稱：具有降低血清葡萄糖和降低血清脂質(zhì)活性的α－苯硫基羧酸和α－苯氧基羧酸的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-苯硫基羧酸和α-苯氧基羧酸的衍生物用于制備具有降低血清葡萄糖和/或降低血清脂質(zhì)活性的通式(I)藥物的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種全世界分布廣泛的疾病并且與嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥有關(guān)，其中包括微血管并發(fā)癥如糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性腎病，和大血管并發(fā)癥如動脈粥樣硬化、外周血管病、心肌梗塞和中風(fēng)。
表征糖尿病的胰島素抵抗還涉及綜合征X、多囊性卵巢綜合征、肥胖、高血壓、高脂血癥和高膽固醇血癥(J.Am Osteopath Assoc 2000Oct；100(10)621-34；JAMA 2002 Nov 27；288(20)2579-88)。
已知高脂血癥、高膽固醇血癥和高血壓在冠心病(CHD)發(fā)作方面起決定性作用。
蛋白糖基化的提高涉及上述糖尿病并發(fā)癥也是已知地(Diabetologia 2001 Feb；44(2)129-46)。
所述并發(fā)癥對個(gè)體的健康和安寧構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
糖尿病的不同臨床形式是已知的，最普遍的是2型和1型糖尿病。2型糖尿病的特征在于對胰島素作用的敏感性降低(胰島素抵抗)并且為了補(bǔ)償這種缺陷導(dǎo)致體內(nèi)胰島素水平增加及隨后葡萄糖水平增加。許多報(bào)道已證實(shí)除2型糖尿病本身外，胰島素抵抗還牽涉多種疾病如血脂異常、肥胖、動脈高血壓、脂肪肝和糖尿病本身的某些大血管和微血管表現(xiàn)。胰島素抵抗和肥胖、高血壓和血脂異常合稱為綜合征X。
為治療2型糖尿病，許多藥物如雙胍類和磺酰脲類藥物已上市一段時(shí)間。最著名的雙胍類藥物是二甲雙胍，但它的作用機(jī)制仍不清楚并且它存在副作用如胃腸功能紊亂和在腎臟、心臟、肝臟和肺功能不全等的情況下發(fā)生酸中毒的危險(xiǎn)?；酋ｋ孱愃幬锎龠M(jìn)β-細(xì)胞分泌胰島素，并且可能存在低血糖發(fā)作的副作用。此外，所有使用磺酰脲類藥物或二甲雙胍的單一療法長期使用均注定失敗(UKPDS研究)。
最近引進(jìn)市場的藥物是噻唑烷二酮類，即胰島素敏化的抗糖尿病藥劑如曲格列酮(J.Med.Chem.，1989，32，421-428)，吡格列酮(Arzneim，F(xiàn)orsch./Drug Res.，1990，40(1)，37-42)和羅格列酮(Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4，1181-1184)，它們能夠降低糖尿病性高血糖和胰島素水平。使用曲格列酮已確認(rèn)的并且擔(dān)心屬于此類的其他化合物也存在的副作用是肝臟毒性(其已經(jīng)導(dǎo)致曲格列酮從美國市場撤出)、LDL-膽固醇增加、體重增加和水腫。
這些化合物是對過氧化物酶體增殖物激活性受體γ(PPARγ)具有高親和性的合成配體(J.Biol.Chem.，1995，270，12953-12956)。
過氧化物酶體增殖物激活性受體(PPARs)是屬于核受體超家族的受體，其功能是控制涉及碳水化合物和脂質(zhì)代謝的基因的表達(dá)(J.Med.Chem.，2000，43，527-550)。PPARs的各種亞型已確認(rèn)PPARγ、PPARα和PPARβ(也稱為δ)。γ同種型(PPARγ)涉及調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和能量穩(wěn)態(tài)，而α同種型(PPARα)控制脂肪酸氧化，導(dǎo)致調(diào)節(jié)血漿中的脂質(zhì)水平。值得注意的是，在用PPARγ激動劑如羅格列酮治療的嚙齒動物中獲得的脂質(zhì)水平降低在人類受治療者中很難發(fā)現(xiàn)，而由貝特類引起的嚙齒動物脂質(zhì)水平降低則在人類中被證實(shí)。在旨在確定可能具有抗糖尿病作用的新分子的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究中，已證明在PPARγ受體活化和降低血清葡萄糖活性間存在對應(yīng)性(J.Med.，Chem.，1996，39，665-668；J.Med.Chem.，1998，41，5020-5036；5037-5054；5055-5069)。胰島素敏化作用似乎與激活的PPARγ受體調(diào)節(jié)的脂肪酸募集作用有關(guān)，據(jù)認(rèn)為這通過改善血糖水平并降低胰島素水平而導(dǎo)致組織的胰島素抵抗改善(Diabetes，1998，47，507-514)。
近年來具有混合特征的分子，即PPARγ和PPARα的配體已出現(xiàn)(KRP297，Diabetes，1998，47，1841-1847；DRF 2725，Diabetes，2001，50，suppl.2，A108；AZ 242，Diabetes，2001，50，suppl.2，A121-A122；WO01/16120)。在此情況下我們應(yīng)看看最近公開的Smithkline Beecham專利(2002年9月6日公開的WO 02/067912)，其提到一類被定義為“PPAR全-激動劑”的新化合物，即能夠激活所有三種PPAR同種型，從而使PPARγ激活的有害副作用最小化的激動劑。特別是，這類新的抗糖尿病藥劑，雖然維持PPARγ激活的典型特征，但被認(rèn)為導(dǎo)致體重增加較少和水腫較輕。這些化合物可能施加對糖尿病的良好控制，表現(xiàn)出具有降低血清葡萄糖和血清脂質(zhì)的作用，而較少噻唑烷二酮類中第一系列化合物典型的副作用，所述噻唑烷二酮類中的第一系列化合物僅為PPARγ受體的配體。專利WO01/16120和WO02/067912中要求保護(hù)的結(jié)構(gòu)具有共同特征，即它們具有貝特樣部分。
但并非科學(xué)界全都同意上面描述的內(nèi)容。事實(shí)上，近來對新一代化合物，無論是噻唑烷二酮衍生物還是其它化合物的研究(MC555，J.Biol.Chem.，1998，vol.273(49)，32679-32684；NC2100 Diabetes，2000，49，759-767，YM440，Metabolism，2000，49，411-417)，在基因反式激活試驗(yàn)、肌肉組織的體外葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)和PPARγ受體表達(dá)缺陷的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，已提出在PPARγ受體激活和這些化合物降低血清葡萄糖和血清脂質(zhì)的活性間可能無直接關(guān)系(Toxicology Letters，2001，120，9-19)。
通過這一點(diǎn)的證明，很多研究者選擇使用糖尿病動物(db/db小鼠，ob/ob小鼠)體內(nèi)篩選以識別不必是良好PPAR配體的可能的胰島素敏化劑。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，選擇了許多具有有希望的抗糖尿病活性的化合物，且它們?nèi)匀惶幱趧游锬Ｐ偷难芯窟^程中(DRF 2189，J.Med.Chem.，1998，41，1619-1630；JTT-501，J.Med.Chem.，1998，41，1927-1933)。
科學(xué)界現(xiàn)在似乎轉(zhuǎn)向?qū)ふ揖哂胁煌饔脵C(jī)制的新化合物，所述新化合物對胰島素敏感性和葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有相似或更好的作用，而無毒性作用(J.Med.Chem.，2001，44，2601-2611)且它們所具有的降低血清脂質(zhì)的活性要優(yōu)于目前使用的舊的和新的抗糖尿病藥劑。
高脂血癥是糖尿病的一個(gè)嚴(yán)重方面，與常常存在的高血壓一起構(gòu)成動脈粥樣硬化和心血管病的危險(xiǎn)因素，后者是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的首要原因。
降低血液中脂質(zhì)水平的需要常常使用貝特類藥物達(dá)到，其盡管在胰島素抵抗方面獲得陽性結(jié)果，但從未被證實(shí)作為降低血清葡萄糖的藥劑是成功的。
發(fā)明概述
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)下面描述的式(I)化合物作為降低血清葡萄糖和/或血清脂質(zhì)的藥劑是有效的，特別是能夠提高HDL-膽固醇水平。
式(I)化合物具有較低毒性且因此用于治療高血糖癥和/或高脂血癥并提高HDL-膽固醇水平。
優(yōu)選的應(yīng)用是預(yù)防和治療糖尿病，特別是2型糖尿病、糖尿病的微血管并發(fā)癥如糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性腎病、糖尿病的大血管并發(fā)癥如動脈粥樣硬化、外周血管病、心肌梗塞、中風(fēng)、綜合征X、多囊性卵巢綜合征、肥胖、高脂血癥、高膽固醇血癥、高血壓、各種形式的胰島素抵抗、脂肪肝、特別是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)和NASH(非酒精性脂肪肝炎(steatohepatitis))和冠心病(CHD)的一級和二級預(yù)防。
因此，本發(fā)明其中一個(gè)目的是式(I)化合物
(I)
其中
R是-H；可能被一個(gè)或多個(gè)鹵素基團(tuán)、硝基、羥基、烷基和烷氧基取代的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)的芳基或雜芳基，其中所述烷基和烷氧基可能被一個(gè)或多個(gè)鹵素基團(tuán)取代；
n是0-3；
p是0-1；
X是-OH、-O-C1-C4烷基；
R1和R2，其可以相同或不同，選自-H；C1-C5烷基，-COX；
Q選自NH、O、S、-NHC(O)O-、-NHC(O)NH-、-NHC(O)S-、-OC(O)NH-、-NHC(S)O-、-NHC(S)NH-、-C(O)NH-；
且Y是O、S；
及其藥學(xué)上可接受的鹽、外消旋混合物、各對映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體和互變異構(gòu)體用于制備預(yù)防和治療糖尿病，特別是2型糖尿病；糖尿病的微血管并發(fā)癥如糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性腎??；糖尿病的大血管并發(fā)癥如動脈粥樣硬化、外周血管病、心肌梗塞和中風(fēng)；綜合征X、多囊性卵巢綜合征、肥胖、高脂血癥、高膽固醇血癥、高血壓、和各種形式的胰島素抵抗；脂肪肝，特別是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)和NASH(非酒精性脂肪肝炎)；和用于冠心病(CHD)的一級和二級預(yù)防，以及用于增加HDL-膽固醇水平的藥物的用途。
本發(fā)明另一目的是含有一種或多種式(I)化合物作為活性成分以及至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物。
發(fā)明詳述
在式(I)化合物中，第一組優(yōu)選化合物由下述化合物組成，其中R是芳基，可能被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子、烷基、烷氧基或鹵代烷基優(yōu)選甲基、甲氧基或三氟甲基、硝基、單-或二-烷基胺取代。
在該第一組的范圍內(nèi)，優(yōu)選p是1，n是0、1或2，且Q是氧。
第二組優(yōu)選化合物由下述化合物組成，其中R是雜芳基，優(yōu)選含有氮作為雜原子，例如，吲哚和咔唑，經(jīng)由所有容許的位置與分子的其余部分結(jié)合；這些之中特別優(yōu)選1-吲哚基和1-咔唑基。
在該第二組的范圍內(nèi)，優(yōu)選p是1，n是0、1或2，且Q是氧。
特別優(yōu)選的是按照下面描述的一般方法及合成過程制備的下列化合物，它們只是舉例說明，而不是對本發(fā)明應(yīng)用性的限制
i.2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2195)；
ii.2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2518)；
iii.2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1929)；
iv.2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2534)；
v.2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2531)；
vi.2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2365)；
vii.2-[4-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2387)；
viii.2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1983)；
ix.2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2394)；
x.2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2167)；
xi.2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2011)；
xii.2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2505)；
xiii.2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2653)；
xiv.2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2652)；
xv.2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2618)；
xvi.2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2622)；
xvii.2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2651)；
xviii.2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2609)；
xix.2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2036)；
xx.2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2577)；
xxi.2-[4-[2-(1-(5-芐氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2562)；
xxii.2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2501)；
xxiii.2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸(ST2733)；
xxiv.2-[4-[2-(1-(5-芐氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2740)；
xxv.2-甲基-2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]丙酸(ST2753)。
特別優(yōu)選的是化合物ST2518和ST2195。
式(I)化合物是使用一般方法A-C描述的反應(yīng)制備的。
一般合成方法
下列簡圖舉例說明用于合成式(I)化合物的方法。
除非另有說明，各種符號的含義與通式(I)中給出的一致。方法A中描述的水解過程還可用于其它方法。
方法A
通式(I)化合物的制備是通過使通式II化合物與堿，優(yōu)選無機(jī)堿，優(yōu)選氫化鈉反應(yīng)，形成相應(yīng)的陰離子，然后其與含離去基團(tuán)，如氯、溴、碘、甲磺酰基、甲苯磺?；椭氐?在重氮基的情況下，代替無機(jī)堿使用二價(jià)乙酸銠二聚物作為催化劑)的通式III化合物，例如2-甲基-α-溴異丁酸酯在極性溶劑如乙腈、甲苯、或優(yōu)選二甲基甲酰胺中，在10-50℃，優(yōu)選25℃的溫度下反應(yīng)18-48小時(shí)進(jìn)行的。由此獲得的產(chǎn)物經(jīng)過堿或酸水解，使用例如NaOH或例如HCl/乙酸混合物，溫度為10-100℃，優(yōu)選25℃，時(shí)間為1-72小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)，得到相應(yīng)的酸IA。
方法B
通式(I)化合物的制備是從通式IV的化合物開始進(jìn)行的，其與通式V的醇在經(jīng)典Mitsunobu反應(yīng)條件下反應(yīng)，如Synthesis 1981，1-28所述，其中使用無水和質(zhì)子惰性溶劑如苯、甲苯、醚或優(yōu)選四氫呋喃，時(shí)間為30分鐘-72小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)，溫度為10-40℃，優(yōu)選25℃。
方法C
W＝O，NH，S
K＝-NCS，-NCO，-OC(O)Cl，-COOH
Q≠N，O，S
用該方法制備的化合物是從溶于質(zhì)子惰性溶劑，例如甲苯、醚、苯、優(yōu)選四氫呋喃中的VI開始獲得的，然后加入相關(guān)的異氰酸酯、異硫氰酸酯(thioisocyanate)或氯甲酸酯VII，可能在有催化或化學(xué)計(jì)量用量的無機(jī)或有機(jī)堿，優(yōu)選三乙胺存在的條件下進(jìn)行，并使其在10-40℃，優(yōu)選25℃下反應(yīng)6-72小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)。在K＝COOH的情況下，使用與底物的比例為1∶3當(dāng)量，優(yōu)選1∶1.5當(dāng)量的縮合劑如二乙基偶磷氰化物(diethylphosphorocyanidate)、EEDQ、DCC或CDI等，或通過?；刃纬傻倪^程，在有機(jī)溶劑如DMF、CH3CN、CHCl3、THF等中，在20-80℃，優(yōu)選25℃的溫度下，進(jìn)行縮合反應(yīng)18小時(shí)-3天，優(yōu)選24小時(shí)。
下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，然而并不排除其它
實(shí)施例1
2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2195)的制備
中間產(chǎn)物2-(3-羥基-苯硫基)異丁酸甲酯的制備
方法A(步驟1)
產(chǎn)物是0℃下，從3-巰基苯酚(2.00g，15.9mmol)在40mL無水CH3CN、NaH 80％(0.572g 19.1mmol)中開始制備的。5分鐘后，向混懸液中加入甲基-2-溴異丁酸酯(2.88g，15.9mmol)。室溫下，磁攪拌由此獲得的反應(yīng)混合物過夜。之后將混合物倒在H2O中并用乙酸乙酯萃取。在無水硫酸鈉上干燥有機(jī)相并蒸發(fā)至干。所得殘余物通過使用CHCl3/CH3OH 98/2作為洗脫劑的硅膠色譜純化。得到2.900g產(chǎn)物(產(chǎn)率81％)；Mp(熔點(diǎn))41.5-42.5℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH98/2，F(xiàn)r(前沿比)0.23；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.19(t，1H)，7.00(d，1H)，6.95(brt，1H)，6.81(dd，1H)，3.69(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O 50/50(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間13.82分；KF0.3％ H2O；E.A.符合C11H14O3S。
2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2195)的制備
方法B
產(chǎn)物是從將2-(3-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照上述制備的)(1.00g，4.42mmol)和4-氯苯乙醇(0.692g，4.42mmol)溶于15mL無水THF中，分小部分向其中加入DIAD(1.16g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)開始制備的，保持溫度低于30℃。室溫下磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 9/1作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到1.146g油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率71％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 9/1，F(xiàn)r＝0.28；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.25(m，6H)，7.00(m，1H)，6.90(d，1H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.08(t，2H)，1.55(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS3(5μm)4.6×250mm，T30℃，流動相CH3CN/H2O 80/20(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間19.34分；KF1.7％H2O；E.A.符合C19H21ClO3S。
實(shí)施例2
2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2518)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2195(按照實(shí)施例1所述制備的)(0.150g，0.41mmol)于9mL甲醇中的溶液，并向其中加入4mL NaOH 1N開始制備的。室溫下，磁攪拌由此獲得的溶液48小時(shí)。之后，用水稀釋溶液，用HCl 1N酸化并用AcOEt萃取水相。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相并過濾，真空蒸去溶劑。得到0.128g產(chǎn)物(產(chǎn)率88％)；Mp105-106℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 9.4/0.6，F(xiàn)r0.42；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.45(m，5H)，7.10(m，2H)，6.80(dd，1H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱子Symmetry-C18(5μm)4.6×250mm，T30℃，流動相CH3CN/乙酸銨10mM 35/65(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.80mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間4.66分；E.A.符合C18H19ClO3S。
實(shí)施例3
2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1929)的制備
中間產(chǎn)物2-(4-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(ST 1923)的制備
標(biāo)題產(chǎn)物是按照方法A(步驟1)中描述的過程，將4-巰基苯酚(0.500g，4.0mmol)溶于10mL無水CH3CN中，并向其中加入NaH80％(0.144g，4.8mmol)開始制備的。將混合物冷卻至0℃，5分鐘后加入甲基-α-溴異丁酸酯(0.724g，4.0mmol)。室溫下，磁攪拌反應(yīng)2天。之后，將混合物倒入H2O中并用乙酸乙酯萃??；用HCl 1N酸化水相并再次用乙酸乙酯萃取。將收集合并的有機(jī)相在Na2SO4上干燥、過濾并蒸發(fā)。通過使用CHCl3作為洗脫劑的硅膠色譜純化所得殘余物。得到0.760g產(chǎn)物(產(chǎn)率84％)；Mp110-112℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3，F(xiàn)r0.11；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.30(d，2H)，6.73(d，2H)，5.57(brm，1H)，3.70(s，3H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Symmetry-C18，(5μm)4.6×250mm，T30℃，流動相CH3CN/H2O 50/50(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間10.14分；E.A.(元素分析)符合C11H14O3S。
2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1929)的制備
標(biāo)題產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，將2-(4-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照上面所述制備的)(0.800g，3.54mmol)和4-氯苯乙醇(0.554g，3.54mmol)溶于20mL無水THF中開始制備的。分小部分逐漸加入DEAD(0.801g，4.6mmol)和三苯膦(1.205g，4.6mmol)，維持溫度低于30℃。室溫下，磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/乙酸乙酯9/1作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到0.416g油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率32％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/乙酸乙酯9/1，F(xiàn)r0.32；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.40-7.19(m，6H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.08(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Symmetry-C18，(5μm)4.6×250mm，T30℃，流動相CH3CN/H2O70/30(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間31.40分；KF0.4％H2O；E.A.符合C19H21ClO3S。
實(shí)施例4
2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2534)的制備
標(biāo)題產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，從2-(3-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例1所述制備的)(0.280g，1.24mmol)和DIAD(0.325g，1.61mmol)溶于3mL無水THF中并在0℃下滴加到2，4-二氯苯乙醇(0.260g，1.36mmol)和三苯膦(0.422g，1.61mmol)溶于4mL無水THF的溶液中開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 9.6/0.4作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到0.327g油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率66％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 9/1，F(xiàn)r0.34；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.40(d，1H)，7.20(m，3H)，7.00(m，2H)，6.90(dd，1H)，4.15(t，2H)，3.65(s，3H)，3.20(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O 90/10(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.8mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間12.40分；KF0.2％H2O；E.A.符合C19H20Cl2O3S。
實(shí)施例5
2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2531)的制備
標(biāo)題產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，自2-(4-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例3所述制備的)(0.280g，1.24mmol)和DIAD(0.325g，1.61mmol)溶于3mL無水THF中并在0℃下滴加到2，4-二氯苯乙醇(0.260g，1.36mmol)和三苯膦(0.422g，1.61mmol)溶于4mL無水THF的溶液中開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 9.6/0.4作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到0.346g產(chǎn)物(產(chǎn)率70％)；Mp73-74℃；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 9/1，F(xiàn)r0.26；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.35(m，3H)，7.22(m，2H)，6.83(d，2H)，4.18(t，2H)，3.65(s，3H)，3.20(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O 85/15(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間12.58分；KF0.4％H2O；E.A.符合C19H20Cl2O3S。
實(shí)施例6
2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2365)的制備
標(biāo)題產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，自2-(3-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例1所述制備的)(0.609g，2.7mmol)、9H-咔唑-9-乙醇(0.570g，2.7mmol)、DIAD(0.708g，3.5mmol)和三苯膦(0.917g，3.5mmol)分小部分逐漸加入到14mL無水THF中，并維持溫度低于30℃開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)18小時(shí)。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 9/1作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到0.510g產(chǎn)物(產(chǎn)率45％)；Mp101-103℃；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt8/2，F(xiàn)r0.38；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.15(m，2H)，7.08(t，1H)，7.00(d，1H)，6.90(s，1H)，6.80(m，1H)，4.75(t，2H)，4.35(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Symmetry-C18，(5μm)4.6×150mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O65/35(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.80mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間11.45分；E.A.符合C25H25NO3S。
實(shí)施例7
2-[4-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2387)的制備
產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，自2-(4-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例3所述制備的)(0.609g，2.7mmol)、9H-咔唑-9-乙醇(0.570g，2.7mmol)、DIAD(0.708g，3.5mmol)和三苯膦(0.917g，3.5mmol)分小部分逐漸加入到14mL無水THF中，并維持溫度低于30℃開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)18小時(shí)。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 9/1作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到0.702g產(chǎn)物(產(chǎn)率62％)；Mp72-74℃；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 8/2，F(xiàn)r0.30；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.15(m，4H)，6.75(d，2H)，4.75(t，2H)，4.35(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Symmetry-C18，(5μm)4.6×150mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O 70/30(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.80mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間11.60分；E.A.符合C25H25NO3S。
實(shí)施例8
2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1983)的制備
中間產(chǎn)物1-(2-羥乙基)吲哚的制備
在J.Med.Chem.，1998，41/10，1619-1639中報(bào)道的中間產(chǎn)物是按照其中描述的過程制備的，區(qū)別在于反應(yīng)持續(xù)時(shí)間(等于30小時(shí)代替30分鐘)，自吲哚(5.0g，42.7mmol)、KOH(3.6g，64.1mmol)和溴乙醇(6.4g，51.3mmol)溶于50ml無水DMSO中的溶液開始，溫度為25-30℃，得到5g油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率73％)。
2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1983)的制備
產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程自2-(4-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例3所述制備的)(0.671g，2.97mmol)、1-(2-羥乙基)吲哚(0.478g，2.97mmol)、DEAD(0.672g，3.86mmol)和三苯膦(1.011g，3.86mmol)分小部分逐漸加入到15mL無水THF中，并維持溫度低于30℃開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)48小時(shí)。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/乙酸乙酯8/2作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物?？偣驳玫?.500g還不純的產(chǎn)物，將其溶于乙酸乙酯中并用NaOH 1N溶液洗滌。干燥有機(jī)相并蒸發(fā)得到0.230g殘余物，其通過硅膠色譜、用CHCl3洗脫而被再次純化。得到0.184g油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率17％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/乙酸乙酯8/2，F(xiàn)r0.29；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.62(d，1H)，7.40-7.10(m，6H)，6.78(d，2H)，6.50(d，1H)，4.50(m，2H)，4.24(m，2H)，3.61(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Symmetry-C18，(3.5μm)4.6×75mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O60/40(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.90mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間，10.70分；KF1.7％H2O；E.A.符合C21H23NO3S。
實(shí)施例9
2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2394)的制備
標(biāo)題產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，自甲基2-(3-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例1所述制備的)(1.00g，4.42mmol)和1-(2-羥乙基)吲哚(按照實(shí)施例8所述制備的)(0.711g，4.42mmol)溶于20mL無水THF中，并向其中分小部分逐漸加入DIAD(1.16g，5.75mmol)和三苯膦(1.500g，5.75mmol)，維持溫度低于30℃而開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 8/2作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到0.581g油狀產(chǎn)物(產(chǎn)率35％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 9/1，F(xiàn)r0.22；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.62(d，1H)，7.42(d，1H)，7.30-6.80(m，7H)，6.52(d，1H)，4.55(m，2H)，4.30(m，2H)，3.61(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Supelco-C18(5μm)4.6×150mm，T30℃，流動相CH3CN/H2O70/30(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.90mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間6.36分；E.A.符合C21H23NO3S。
實(shí)施例10
2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2167)的制備
產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程(區(qū)別在于用DIAD代替DEAD)從2-(3-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例1所述制備的)(1.110g，4.9mmol)、2-(2-萘基)乙醇(0.842g，4.9mmol)、DIAD(1.290g，6.37mmol)和三苯膦(1.670g，6.37mmol)溶于20mL無水THF中開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 7/3作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。通過將該產(chǎn)物溶于乙酸乙酯中并用Na2CO3溶液洗滌有機(jī)相而進(jìn)一步純化它。在硫酸鈉上干燥有機(jī)相并真空蒸去溶劑。得到1.14g產(chǎn)物(產(chǎn)率61.2％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 9/1，F(xiàn)r0.20；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.80(m，3H)，7.75(s，1H)，7.45(m，3H)，7.25(t，1H)，7.05(m，2H)，6.90(d，1H)，4.25(t，2H)，3.65(s，3H)，3.30(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O 80/20(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.9mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間18.91分；KF1.0％H2O；E.A.符合C23H24O3S。
實(shí)施例11
2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2011)的制備
產(chǎn)物是按照方法B中描述的過程，從2-(4-羥基苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例3所述制備的)(1.000g，4.42mmol)、2-(2-萘基)乙醇(0.760g、4.42mmol)、DEAD(1.000g、5.75mmol)和三苯膦(1.500g、5.75mmol)分小部分逐漸加入到30mL無水THF中，并維持溫度低于30℃開始制備的。室溫下，磁攪拌反應(yīng)過夜。之后，蒸去溶劑并通過使用己烷/AcOEt 9/1作為洗脫劑的硅膠色譜純化殘余物。得到1.262g產(chǎn)物(產(chǎn)率75％)；Mp56-57℃；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 9/1，F(xiàn)r0.23；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.85-7.70(m，4H)，7.45-7.28(m，5H)，6.83(d，2H)，4.27(t，2H)，3.65(s，3H)，3.26(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS-3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/H2O 80/20(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間23.51分；KF0.16％H2O；E.A.符合C23H24O3S。
實(shí)施例12
2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2505)的制備方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST1929(按照實(shí)施例3所述制備的)(0.572g，1.57mmol)于36mL甲醇中的溶液，并向其中加入15.7mL NaOH 1N開始制備的。回流溫度下，磁攪拌所得溶液過夜。之后，用HCl 1N酸化該溶液并用AcOEt萃取水相。將有機(jī)相在無水Na2SO4上干燥并過濾，真空蒸去溶劑。產(chǎn)物是通過硅膠柱色譜，使用己烷/AcOEt 7∶3洗脫而被純化的。得到0.448g產(chǎn)物(產(chǎn)率81.5％)；Mp87-88℃；TLC硅膠；洗脫劑己烷/AcOEt 6/4，F(xiàn)r0.3；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.40(d，2H)，7.25(d，2H)，7.20(d，2H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Symmetry-C18(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/乙酸銨10mM 45/55(v/v)，pH按現(xiàn)狀；流速0.70mL/分，205nm UV檢測器；保留時(shí)間4.73分；E.A.符合C18H19ClO3S。
實(shí)施例13
2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2653)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2534(按照實(shí)施例4所述制備的)(0.700g，1.75mmol)于11mL CH3OH中的溶液，向其中加入21mL NaOH 1N開始制備的。40℃下，磁攪拌所得溶液2天。之后，真空蒸去CH3OH并用HCl 1N酸化水相，用AcOEt萃取。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相，過濾并真空蒸去溶劑。得到0.486g產(chǎn)物(產(chǎn)率72％)；Mp86-88℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 9.6/0.4，F(xiàn)r0.18；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.40(s，1H)，7.20(m，3H)，7.05(m，2H)，6.90(d，1H)，4.15(t，2H)，3.05(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30(v/v)，pH約3(H3PO4)，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間16.78分；E.A.符合C18H18Cl2O3S。
實(shí)施例14
2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2652)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2531(按照實(shí)施例5所述制備的)(0.130g，0.32mmol)于3mL四氫呋喃中的溶液，向其中加入3mL LiOH水溶液(0.040g，1.67mmol)開始制備的。室溫下，磁攪拌所得混懸液過夜。之后，真空蒸去四氫呋喃，用HCl 1N酸化水相并用AcOEt萃取。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相，過濾并真空蒸去溶劑。用硅膠色譜柱純化所得殘余物，其中用CHCl3/CH3OH 9.6/0.4洗脫。得到0.044g產(chǎn)物(產(chǎn)率36％)；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 9.6/0.4，F(xiàn)r0.20；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.40(m，3H)，7.20(m，2H)，6.80(d，2H)，4.15(t，2H)，3.15(t，2H)，1.45(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 65/35(v/v)，pH約3(H3PO4)，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間27.20分；E.A.符合C18H18Cl2O3S。
實(shí)施例15
2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2618)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2365(按照實(shí)施例6所述制備的)(0.120g，0.286mmol)于3mL四氫呋喃中的溶液，向其中加入1mL LiOH水溶液(0.014g，0.5mmol)開始制備的。室溫下，磁攪拌由此獲得的混懸液過夜。之后，真空蒸去四氫呋喃，用HCl 1N酸化水相并在無水Na2SO4上萃取，過濾，真空蒸去溶劑。得到0.042g產(chǎn)物(產(chǎn)率36％)；TLC硅膠；洗脫劑CHCl3/CH3OH 9.6/0.4，F(xiàn)r0.24；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.05(d，2H)，7.50(m，4H)，7.10-7.00(m，5H)，6.80(d，1H)，4.70(t，2H)，4.30(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30(v/v)，pH按現(xiàn)狀；流速1mL/分，205nm UV檢測器；保留時(shí)間11.92分；E.A.符合C24H23NO3S。
實(shí)施例16
2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2622)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST1983(按照實(shí)施例8所述制備的)(1g，2.71mmol)于15mL CH3OH中的溶液，向其中加入30mL NaOH 1N開始制備的。40℃下，磁攪拌所得溶液48小時(shí)。之后，真空蒸去CH3OH，用HCl 1N酸化水相并用AcOEt萃取。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相，過濾并真空蒸去溶劑。用硅膠色譜柱純化所得殘余物，其中用CHCl3/CH3OH 9.6/0.4洗脫。得到0.679g產(chǎn)物(產(chǎn)率70％)；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH9.6/0.4，F(xiàn)r0.27；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.60(d，1H)，7.40(d，3H)，7.20(m，3H)，6.80(d，2H)，6.50(d，1H)，4.50(t，2H)，4.25(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisili ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30(v/v)，pH按現(xiàn)狀；流速1mL/分，205nm UV檢測器；保留時(shí)間8.30分；E.A.符合C20H21NO3S。
實(shí)施例17
2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2651)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2394(按照實(shí)施例9所述制備的)(0.140g，0.38mmol)于3mL四氫呋喃中的溶液，向其中加入2mL LiOH水溶液(0.040g，1.67mmol)開始制備的。室溫下，磁攪拌所得混懸液過夜。之后，真空蒸去四氫呋喃，用HCl 1N酸化水相并用AcOEt萃取。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相，過濾并真空蒸去溶劑。用硅膠色譜柱純化所得殘余物，其中用CHCl3/CH3OH 9.6/0.4洗脫。得到0.086g產(chǎn)物(產(chǎn)率63％)；TLC硅膠；洗脫劑CHCl3/CH3OH 9.6/0.4，F(xiàn)r0.19；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.60(d，1H)，7.40(d，1H)，7.20-7.00(m，6H)，6.80(d，1H)，6.50(d，1H)，4.50(t，2H)，4.20(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫；流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 65/35(v/v)，pH按現(xiàn)狀；流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間8.77分；E.A.符合C20H21NO3S。
實(shí)施例18
2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2609)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2167(按照實(shí)施例10所述制備的)(0.270g，0.71mmol)于18mL CH3OH中的溶液，向其中加入15mL NaOH 2N開始制備的?；亓鳒囟认拢艛嚢杷萌芤?8小時(shí)。之后，冷卻反應(yīng)混合物，用HCl1N酸化并用AcOEt萃取。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相，過濾并真空蒸去溶劑。使用硅膠色譜柱純化所得殘余物，其中用己烷/AcOEt 7/3洗脫。得到0.030g產(chǎn)物(產(chǎn)率14％)；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 6/4，F(xiàn)r0.24；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.80(m，3H)，7.70(s，1H)，7.40(m，3H)，7.20(m，1H)，7.10(s，2H)，6.90(d，1H)，4.20(t，2H)，3.20(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間11.77分；E.A.符合C22H22O3S。
實(shí)施例19
2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2036)的制備
方法A(步驟2)
產(chǎn)物是從ST2011(按照實(shí)施例11所述制備的)(0.498g；1.29mmol)于30mL CH3OH中的溶液，向其中加入12.9mL di NaOH 1N開始制備的?；亓鳒囟认拢艛嚢杷萌芤哼^夜。之后，冷卻反應(yīng)混合物，用HCl 1N酸化并用AcOEt萃取。在無水Na2SO4上干燥有機(jī)相、過濾并真空蒸去溶劑。得到0.450g產(chǎn)物(產(chǎn)率95％)；Mp103-104℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 9.8/0.2，F(xiàn)r0.13；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.80(m，3H)，7.70(s，1H)，7.40(m，5H)，6.80(d，2H)，4.20(t，2H)，3.20(t，2H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，T室溫，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 75/25(v/v)，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間13.10分；E.A.符合C22H22O3S。
實(shí)施例20
2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2577)的制備
方法B
向ST1923(按照實(shí)施例3所述制備的)(0.2g，0.88mmol)的無水THF(6mL)溶液中分小部分加入2-(5-甲氧基-吲哚-1-基)-乙醇(按照實(shí)施例8所述，自5-甲氧基吲哚和2-溴-乙醇開始制備的)(0.185g，0.97mmol)、DIAD(0.230g，1.14mmol)和三苯膦(0.299g，1.14mmol)。室溫下，磁攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后真空除去溶劑并將殘余物溶于AcOEt中，用NaOH 1N洗滌。在Na2SO4上干燥有機(jī)相、過濾并蒸發(fā)。通過使用己烷/AcOEt 87/13作為洗脫劑的硅膠色譜純化所得殘余物，得到0.180g終產(chǎn)物(產(chǎn)率51％)。TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 7/3，F(xiàn)r0.39；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.30(m，3H)，7.15(d，1H)，7.10(d，1H)，6.90(dd，1H)，6.78(d，2H)，6.40(d，1H)，4.50(t，2H)，4.25(t，2H)，3.85(s，3H)，3.65(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流動相CH3CN/H2O 85/15v/v，pH按現(xiàn)狀，流速0.75mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間7.80分；A.E.符合C22H25NO4S預(yù)期值。
實(shí)施例21
2-[4-[2-(1-(5-芐氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2562)的制備
方法B
向ST1923(按照實(shí)施例3所述制備的)(0.2g，0.88mmol)的無水THF(6mL)溶液中分小部分加入2-(5-芐氧基-吲哚-1-基)乙醇(按照實(shí)施例8所述，自5-芐氧基吲哚和2-溴-乙醇開始制備的)(0.26g，0.97mmol)、DIAD(0.230g，1.14mmol)和三苯膦(0.299g，1.14mmol)。室溫下，磁攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后真空除去溶劑，并將殘余物溶于AcOEt中，用NaOH 1N洗滌。在Na2SO4上干燥有機(jī)層，過濾并真空蒸發(fā)。通過使用己烷/AcOEt 85/15作為洗脫劑的硅膠色譜純化所得殘余物，得到0.240g終產(chǎn)物(產(chǎn)率57％)。MP87-88℃；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 7/3，F(xiàn)r0.41；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.45-7.2(m，10H)，7.00(dd，1H)，6.80(d，2H)，6.40(d，1H)，5.10(s，2H)，4.50(t，2H)，4.25(t，2H)，3.60(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流動相CH3CN/H2O90/10v/v，pH按現(xiàn)狀，流速0.80mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間8.21分；A.E.符合C28H29NO4S預(yù)期值。
實(shí)施例22
2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2501)的制備
方法B
向2-(3-羥基-苯硫基)異丁酸甲酯(按照實(shí)施例1所述制備的)(1.02g，4.5mmol)的無水THF(23mL)溶液中分小部分加入5-硝基糠醇(0.986g，4.5mmol)、DIAD(1.18g，5.85mmol)和三苯膦(1.53g，5.85mmol)。室溫下磁攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后真空除去溶劑并將殘余物溶于AcOEt中，用NaOH 1N洗滌。在Na2SO4上干燥有機(jī)層，過濾并真空除去。通過使用己烷/AcOEt 9.4/0.6作為洗脫劑的硅膠色譜純化所得殘余物，得到0.380g終產(chǎn)物(產(chǎn)率20％)。MP81-82℃；TLC硅膠，洗脫劑己烷/AcOEt 7/3，F(xiàn)r 0.45；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.22(d，2H)，7.80(d，2H)，7.22(m，2H)，7.10-7.00(m，3H)，6.80(d，1H)，6.60(d，1H)，5.10(s，2H)，370(s，3H)，1.50(s，6H)；HPLC柱Symmetry C18(5μm)4.6×250mm，R.T.，流動相CH3CN/H2O 85/15v/v，pH按現(xiàn)狀，流速0.85mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間6.24分；A.E.符合C22H21NO6S預(yù)期值。
實(shí)施例23
2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸(ST2733)的制備
方法A(步驟2)
向ST2577(按照實(shí)施例20所述制備的)(0.2g，0.50mmol)的CH3OH(3.2mL)溶液中加入NaOH 1N溶液(6mL)。40℃下，磁攪拌反應(yīng)混合物過夜，然后真空除去有機(jī)相，用AcOEt萃取水相。分離水相并用HCl 1N酸化，然后再次用AcOEt萃取。用水洗滌該第二有機(jī)萃取物，在Na2SO4上干燥，過濾并真空蒸發(fā)，得到0.138g終產(chǎn)物(產(chǎn)率72％)。MP100-102℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 8/2，F(xiàn)r0.62；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.40(d，2H)，7.25(s，1H)，7.10(d，2H)，6.90(d，1H)，6.78(d，2H)，6.40(d，1H)，4.50(t，2H)，4.20(t，2H)，3.80(s，3H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30，pH按現(xiàn)狀，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間7.32分，A.E.符合C21H23NO4S預(yù)期值。
實(shí)施例24
2-[4-[2-(1-(5-芐氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2740)的制備
方法A(步驟2)
向ST2562(按照實(shí)施例21所述制備的)(0.430g，0.90mmol)的CH3OH(10mL)溶液中加入NaOH 1N溶液(15mL)。40℃下磁攪拌反應(yīng)混合物48小時(shí)，然后真空除去有機(jī)相并用AcOEt萃取含水殘余物。分離水相并用HCl 1N酸化，然后再次用AcOEt萃取。用水洗滌該第二有機(jī)萃取物，在Na2SO4上干燥并真空蒸發(fā)，得到0.310g終產(chǎn)物(產(chǎn)率74％)。MP160-162℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 9/1，F(xiàn)r.0.57；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.40-7.15(m，10H)，7.20(s，2H)，7.00(d，1H)，6.90(d，2H)，6.40(s，1H)，5.15(s，2H)，4.50(t，2H)，4.20(t，2H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS 3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30，pH按現(xiàn)狀，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間11.60分；A.E.符合C27H27NO4S預(yù)期值。
實(shí)施例25
2-甲基-2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]丙酸(ST2753)的制備
方法A(步驟2)
向ST2501(按照實(shí)施例22所述制備的)(0.4g，0.93mmol)的CH3OH(10mL)溶液中加入NaOH 1N溶液(25mL)。40℃下磁攪拌反應(yīng)混合物4天，然后真空除去有機(jī)相并用AcOEt萃取含水殘余物。分離水相并用HCl 1N酸化，然后再次用AcOEt萃取。用水洗滌該第二有機(jī)萃取物，在Na2SO4上干燥并真空蒸發(fā)。通過硅膠色譜純化殘余物，其中用CHCl3/CH3OH 9.4/0.6洗脫，得到0.215g終產(chǎn)物(產(chǎn)率56％)。MP137-138℃；TLC硅膠，洗脫劑CHCl3/CH3OH 9/1，F(xiàn)r 0.53；1H NMR(300MHz，DMSO)δ8.30(d，2H)，8.00(d，2H)，7.40(m，2H)，7.10(d，3H)，6.80(s，1H)，4.20(s，2H)，1.40(s，6H)；HPLC柱Inertisil ODS3(5μm)4.6×250mm，R.T.，流動相CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30，pH按現(xiàn)狀，流速1mL/分，205nm UV檢測器，保留時(shí)間11.38分；A.E.符合C21H19NO6S預(yù)期值。
實(shí)施例26
db/db小鼠中的抗糖尿病和降低血清脂質(zhì)的活性
實(shí)驗(yàn)動物的突變使得可能開發(fā)出呈現(xiàn)伴有肥胖、高脂血癥和胰島素抵抗的非胰島素依賴型糖尿病的模型，并且該模型能使我們測試新的抗糖尿病化合物的效力(Reed和Scribner，Diabetes，obesity andmetabolism 175-86，1999)。
廣泛使用的遺傳性糖尿病小鼠模型是C57BL/KsJ db/db小鼠。
此模型的遺傳基礎(chǔ)是苗條蛋白受體基因缺陷(db/db小鼠)，導(dǎo)致苗條蛋白抗性和引起飲食過多、肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗，隨后產(chǎn)生胰島素分泌不足和高血糖癥狀(Kodama等，Diabetologia37739-744，1994；Zhang等，Nature 372425-432，1994；Chen等，Cell 84491-495，1996)。
由于高血糖伴有肥胖和胰島素抵抗，db/db小鼠具有類似人類2型糖尿病的特征，可用于測定胰島素敏化化合物。
實(shí)驗(yàn)所用C57BL/KsJ db/db小鼠由Jackson Lab(經(jīng)由Ch.River)提供。在標(biāo)準(zhǔn)條件(22±2℃，55±15％濕度；換氣15-20/小時(shí)；12小時(shí)光-暗循環(huán)，光照從上午7.00到下午7.00)下，給予標(biāo)準(zhǔn)4RF21飲食(Mucedola)，適應(yīng)環(huán)境10天后，在吸收后狀態(tài)下(從上午8.30到下午4.30禁食)，借助于Jelco 22G導(dǎo)管(Johnson and Johnson)從尾靜脈取血樣。監(jiān)測葡萄糖、胰島素、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸和尿素的血漿水平以確保處理組中小鼠的良好匹配分布。
處理開始時(shí)，檢查小鼠體重，進(jìn)行監(jiān)測水和食物消耗的準(zhǔn)備。
使用本發(fā)明的化合物每天兩次(8.30a.m.和6.30p.m.)口服處理小鼠25天(實(shí)驗(yàn)I)或12天(實(shí)驗(yàn)II)，使用羅格列酮、苯扎貝特和非諾貝特(實(shí)驗(yàn)I)或?qū)嵤├?中的化合物(實(shí)驗(yàn)II)作為參照化合物。
以10ml/kg載體(含0.5％吐溫80去離子水溶液的1％CMC)中含25mg/kg本發(fā)明實(shí)施例1化合物ST2195的相當(dāng)劑量給予所述化合物。具體而言，以5mg/kg的劑量給予羅格列酮(Lohray等，J.Med Chem41，1619-1630，1998)，苯扎貝特為24.8mg/kg和非諾貝特為24.7mg/kg。
在實(shí)驗(yàn)過程中，監(jiān)測血清葡萄糖水平、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)結(jié)果、多種脂質(zhì)狀態(tài)參數(shù)和體重增加。
本發(fā)明化合物證實(shí)能夠降低進(jìn)食(表1)、吸收后(表2、2a、5和5a)以及禁食狀況(表3和3a)的血清葡萄糖水平。
它們還證實(shí)能夠改善葡萄糖耐量(表4和4a)并減少果糖胺，其是蛋白糖基化的一個(gè)指標(biāo)(表5)，如上所述，蛋白糖基化在糖尿病的微-和大-血管并發(fā)癥的發(fā)生中起重要作用。
本發(fā)明的化合物還顯示出良好的降低血清甘油三酯水平的能力，與羅格列酮和非諾貝特類似(表6和6a)。
此外，與羅格列酮不同，本發(fā)明的化合物可增加HDL-膽固醇水平(表6和6a)并且其所致的體重增加比由羅格列酮引起的要低，且與貝特類誘導(dǎo)的接近(表7和7a)。
HDL-膽固醇值的增加構(gòu)成PPARα激動作用和動脈粥樣硬化危險(xiǎn)降低的指示。事實(shí)上，PPARα激動作用增加組織中的脂肪酸氧化，減少胞內(nèi)甘油三酯的積聚，而胞內(nèi)甘油三酯會促進(jìn)胰島素抵抗(Virkamki等，Diabetes 50，2337-2343，2001；Mensink等，Diabetes 50，2545-2554，2001；Kelley和Goodpaster，Diabetes Care 24，933-941，2001)。
表1(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理12天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。在最后一次處理后大約15小時(shí)，采集進(jìn)食狀態(tài)下的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)▲表示與對照相比P＜0.001。
表2(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理12天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。
采集吸收后狀態(tài)(從9a.m.-5p.m.禁食)和最后一次處理后8小時(shí)的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)□和▲分別表示與對照相比P＜0.05和P＜0.001。
表2a(實(shí)驗(yàn)II)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物和實(shí)施例2的化合物(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)，處理9天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。
采集吸收后狀態(tài)(從9a.m.-5p.m.禁食)和最后一次處理后8小時(shí)的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)△和▲分別表示與對照相比P＜0.01和P＜0.001。
表3(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理18天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。
采集禁食18小時(shí)和最后一次處理后6小時(shí)的樣品。
平均值+S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)■和△分別表示與對照相比P＜0.02和P＜0.01。
表3a(實(shí)驗(yàn)II)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物和實(shí)施例2的化合物(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)，處理11天后，小鼠血液中的葡萄糖水平。
采集禁食18小時(shí)和最后一次處理后5小時(shí)的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)▲表示與對照相比P＜0.001。
表4(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理18天后，小鼠血液中OGTT葡萄糖的曲線下面積(AUC)。
禁食18小時(shí)和最后一次處理后5小時(shí)的小鼠OGTT(葡萄糖3g/kg)。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)△和▲分別表示與對照相比P＜0.01和P＜0.001。
表4a(實(shí)驗(yàn)II)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1和實(shí)施例2的化合物(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)，處理11天后，小鼠血液中OGTT葡萄糖的曲線下面積(AUC)。
禁食18小時(shí)和最后一次處理后5小時(shí)的小鼠OGTT(葡萄糖3g/kg)。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)▲表示與對照相比P＜0.001。
表5(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理25天后，小鼠的血漿葡萄糖和果糖胺的水平。
采集吸收后狀態(tài)(從9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次處理后7.5小時(shí)的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)■、△和σ分別表示與對照相比P＜0.02、P＜0.01和P＜0.001。
表5a(實(shí)驗(yàn)II)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1和實(shí)施例2的化合物(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)，處理12天后，小鼠的血漿葡萄糖水平。
采集吸收后狀態(tài)(從9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次處理后7.5小時(shí)的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)▲表示與對照相比P＜0.001。
表6(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理25天后，小鼠的血漿甘油三酯和HDL-膽固醇的水平。
采集吸收后狀態(tài)(從9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次處理后7.5小時(shí)的樣品。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)□、△和σ分別表示與對照相比P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001。
表6a(實(shí)驗(yàn)II)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1和實(shí)施例2的化合物(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)，處理12天后，小鼠的血漿甘油三酯和HDL-膽固醇水平。
采集吸收后狀態(tài)(從9a.m.-4.30p.m.禁食)和最后一次處理后7.5小時(shí)的樣品。
平均值+S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)△和▲分別表示與對照相比P＜0.01和P＜0.001。
表7(實(shí)驗(yàn)I)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1的化合物、貝特類(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)和羅格列酮(5mg/kg)，處理25天后，小鼠最初和最終的體重。
吸收后狀態(tài)(從9a.m.-4.30p.m.禁食)的測量值。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)△和σ分別表示與對照相比P＜0.01和P＜0.001。
表7a(實(shí)驗(yàn)II)
每天兩次口服給予db/db小鼠實(shí)施例1和實(shí)施例2的化合物(劑量相當(dāng)于25mg/kg實(shí)施例1的化合物)，處理12天后，小鼠最初和最終的體重。
吸收后狀態(tài)(從9a.m.-4.30p.m.禁食)的測量值。
平均值±S.E.和與對照相比的變化(％)
每組動物數(shù)6只。
Student’s t檢驗(yàn)□表示與對照相比P＜0.05。
實(shí)施例27
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以評價(jià)PPARα配體的激動劑活性
在該實(shí)施例中，證實(shí)本發(fā)明的化合物也具有PPARα激動劑活性。
PPARα激動劑的鑒定是通過基于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的體外篩選進(jìn)行的。
真核細(xì)胞的反式激活測定法可定量評價(jià)假設(shè)配體幫助轉(zhuǎn)錄因子與其特有的在啟動子內(nèi)的反應(yīng)元件相互作用的能力[Sladek R.等，Nuclear ReceptorsA Practical Approach，Oxford Presspp.63-68(1999)]。
因?yàn)檫^氧化物酶體增殖物激活性受體α(PPARα)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，因此它與9-順式-視黃酸受體(RXR)的二聚是必需的。所形成的二聚物能夠結(jié)合位于靶基因啟動子中的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)，僅在因兩個(gè)受體中至少一個(gè)的配體存在而被激活時(shí)[BergerJ.和Moller D.E.，Annu.Rev.Med.53，409-35(2002)]。
反式激活測定法因此要求在預(yù)選細(xì)胞系中同時(shí)存在下列
a)足量PPARα；
b)足量9順式-視黃酸受體(RXR)；
c)包含受位于病毒異源啟動子上游的PPRE控制的報(bào)道基因的嵌合質(zhì)粒。在我們的實(shí)例中，報(bào)道基因是氯霉素-乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)。
每當(dāng)PPARα和RXR的內(nèi)源水平不足時(shí)，可通過含所涉及受體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染而從外部補(bǔ)充[Kersten S.和Wahli W.NuclearReceptorsA Practical Approach，Oxford Press 74-76頁(1999)]。
質(zhì)粒pCH110包含β-半乳糖苷酶基因且與受體基因CAT一起共-轉(zhuǎn)染，為轉(zhuǎn)染效率和結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化提供內(nèi)部對照。
然而，使用該轉(zhuǎn)染和報(bào)道基因系統(tǒng)，不能完全消除由所用細(xì)胞系組成型表達(dá)的內(nèi)源受體導(dǎo)致的干擾。
因此使用選擇性方法，其能使我們避開可能的內(nèi)源受體導(dǎo)致的干擾問題。
在該模型中，使用反式激活測定法，其中表達(dá)載體mPPARαLBD/Ga14DBD容許轉(zhuǎn)染細(xì)胞合成嵌合蛋白，其中PPARα的配體結(jié)合域(LBD)與酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域(DBD)融合[Luckow B.等，Nucleic Acids Res.15，5490(1987)]。同時(shí)，質(zhì)粒(pG5CAT)被轉(zhuǎn)染，其包含5個(gè)拷貝的GAL4高親和性結(jié)合位點(diǎn)(也稱作UAS，上游激活序列)，在與CAT報(bào)道基因融合的病毒啟動子Elb的上游[Moya-Camarena S.Y.等，J.Lipid Res.40(8)，1426-33(1999)]。該模型消除了由可能的內(nèi)源受體所致的干擾。
這是由于Elb的激活和CAT的產(chǎn)生將僅僅由于GAL4DBD與其特有的反應(yīng)元件(UAS)的相互作用而發(fā)生。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子GAL4不在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此報(bào)道基因的反式激活僅當(dāng)由于配體與PPARα的LBD相互作用，嵌合蛋白PPARα/GAL4識別質(zhì)粒pG5CAT上的UAS序列時(shí)才能發(fā)生。連同表達(dá)載體和報(bào)道載體，還用質(zhì)粒pCH110轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其提供轉(zhuǎn)染效率和結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照。
實(shí)驗(yàn)過程
使用猴腎成纖維細(xì)胞系(COS-7)[Elbrecht A.等，J.Biol.Chem.274(12)，7913-22(1999)]。用報(bào)道載體、編碼融合蛋白Ga14DBD/PPARαLBD的表達(dá)質(zhì)粒和對照載體pCH110共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。使細(xì)胞與濃度逐漸增加的研究化合物接觸并評價(jià)CAT活性。使用未處理過的細(xì)胞作為對照。
細(xì)胞培養(yǎng)
按照通常的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)猴腎成纖維細(xì)胞(COS-7)，37℃，5％v/v二氧化碳?xì)夥?，使?.7g/l碳酸氫鈉、4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1mM丙酮酸鈉和10％v/v胎牛血清修飾的DMEM(Dulbecco′s修飾的Eagle′s培養(yǎng)基)作為生長培養(yǎng)基，在有鏈霉素100μg/ml和青霉素100U/ml(終濃度)存在的條件下。
COS-7細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
使用由能夠復(fù)合DNA并把它轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的脂類的限定混合物組成的轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6(Roche)將細(xì)胞共-轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之前24小時(shí)，以1.2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞平板接種在12-孔平板中并在37℃、5％v/v CO2氣氛下維持。轉(zhuǎn)染之前2小時(shí)，更換沒有血清的培養(yǎng)基，然后按照供應(yīng)商建議的說明用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6處理細(xì)胞。簡單地說，在沒有血清的培養(yǎng)基存在的條件下，將含有0.8μg表達(dá)載體、1.6μg報(bào)道載體、0.8μg對照載體和9μl FuGENE6試劑/孔的轉(zhuǎn)染混合物直接加入到細(xì)胞中。5小時(shí)后，在有或沒有3種不同濃度(2、20和100μM)待測分子存在的條件下，用1ml含血清和抗生素的完全培養(yǎng)基更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。Wy-14，643(2μM)，一種已知的PPARα配體，用作陽性參照化合物。
細(xì)胞蛋白提取物的制備和CAT活性的測定
在37℃、5％v/v CO2氣氛中培養(yǎng)48小時(shí)后，用1ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌該細(xì)胞2次并從孔中通過機(jī)械方法取出移入TEN緩沖液(三[羥甲基]氨基甲烷10mM pH8，乙二胺-四乙酸1mM pH8、氯化鈉0.1M)中。1000rpm離心3分鐘后，將細(xì)胞重懸于65μl溶胞緩沖液(Tris-HCl0.25M，pH8)中，然后經(jīng)過3次快速的凍-融循環(huán)進(jìn)行溶胞。4℃、15,000rpm離心15分鐘除去不溶性細(xì)胞物質(zhì)(碎片)，回收上清液并用于CAT和β-半乳糖苷酶活性測定。
將細(xì)胞提取物在-80℃貯存，直到在75μl終體積中加入甘油(終濃度10％v/v)和β-巰基乙醇(終濃度5mM)后進(jìn)行測定。
評價(jià)CAT活性的測定法是通過運(yùn)用Sleigh描述的方法[Sleigh M.J.Annal Biochem.，156(1)，251-6(1986)]的變體進(jìn)行的。簡單地說，將20μl蛋白細(xì)胞提取物(預(yù)熱至65℃達(dá)10分鐘，從而使內(nèi)部脫乙酰酶活性滅活)加入到含10μl正丁?；?輔酶A(3.5mg/ml)，5μl[14C]-氯霉素(0.25μCi)和65μl蒸餾H2O的溶液中。37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，用200μl二甲苯/2，6，10，14-四甲基-十五烷(1∶2v/v)的溶液阻斷反應(yīng)。
劇烈攪拌并以最大速度離心5分鐘后，將150μl上清液加入到5ml閃爍液中，在β-計(jì)數(shù)器(閃爍器)下分析，確定酶促反應(yīng)形成的[14C]丁?；?氯霉素含量。
測定β-半乳糖苷酶活性的試驗(yàn)
作為相對于轉(zhuǎn)染效率CAT活性標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照，使用由共-轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCH110中相應(yīng)基因編碼的β-半乳糖苷酶活性。
β-半乳糖苷酶活性是按照Sambrook描述的方法[Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press編(1989)]的變體測量的。簡單地說，將20μl蛋白提取物加入到750μl含1體積的2mg/ml ONPG(O-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)和3體積的“Z緩沖液”(10mM氯化鉀、1mM氯化鎂、50mMβ-巰基乙醇的磷酸鹽緩沖液)的反應(yīng)緩沖液中。37℃下進(jìn)行反應(yīng)并在典型的黃色外觀清晰可見時(shí)，通過加入200μl碳酸鈉1M溶液中斷反應(yīng)。室溫培養(yǎng)樣品10分鐘，然后通過在分光光度計(jì)下測量420nm波長處的吸光度(A420)而分析。
下列公式用于CAT測定結(jié)果相對于β-半乳糖苷酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化
CAT樣品計(jì)數(shù)/分鐘(cpm)-空白計(jì)數(shù)/分鐘(cpm)
β-半乳糖苷酶單位*
β-半乳糖苷酶單位*＝A420×稀釋倍數(shù)/培養(yǎng)時(shí)間(分鐘)
表8舉例給出實(shí)施例1、2、4、10、13和18中化合物的PPARα激動劑活性。
表8
mPPARαLBD/Ga14DBD在COS-7細(xì)胞中介導(dǎo)的反式激活測定。結(jié)果以報(bào)道基因CAT的激活百分比表示，通常把在有參照化合物(WY-14，643 2μM)存在的條件下測量的值假定為100％。
實(shí)施例28
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以評價(jià)PPARγ配體的激動劑活性
在該實(shí)施例中，證實(shí)本發(fā)明的多種化合物也具有PPARγ激動劑活性。
PPARγ激動劑的鑒定是通過真核細(xì)胞中的特異性反式激活測定法進(jìn)行的。
因?yàn)檫^氧化物酶體增殖物激活性受體γ(PPARγ)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，因此它與9-順式-視黃酸受體(RXR)的二聚是必需的。所形成的二聚物能夠結(jié)合位于靶基因啟動子中的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)，僅在因兩個(gè)受體中至少一個(gè)的配體存在而被激活時(shí)[Berger J.和Moller D.E.，Annu.Rev.Med.53，409-35(2002)]。
對PPARγ特異性的反式激活測定法因此要求在預(yù)選細(xì)胞系中同時(shí)存在下列
a)足量PPARγ；
b)足量9順式-視黃酸受體(RXR)；
c)包含受位于病毒異源啟動子上游的PPRE控制的報(bào)道基因的嵌合質(zhì)粒。在我們的實(shí)例中，報(bào)道基因是氯霉素-乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)。
在所用反式激活測定法中，用表達(dá)載體pSG5 Stop-mPPARg1轉(zhuǎn)染預(yù)選細(xì)胞，其容許轉(zhuǎn)染細(xì)胞合成PPARγ受體。同時(shí)，轉(zhuǎn)染報(bào)道質(zhì)粒(pBLCAT2-PPRE)，其包含由?；?CoA氧化酶的基因啟動子分離的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)，在與報(bào)道基因CAT融合的病毒胸苷激酶(TK)的異源啟動子的上游。因?yàn)镽XR受體的內(nèi)源細(xì)胞水平足夠高，無需轉(zhuǎn)染RXR特異性表達(dá)載體。編碼CAT的基因的表達(dá)受TK啟動子的控制，其不合任何PPRE。因此，CAT水平的任何增加將是由于基因轉(zhuǎn)錄的增加，其依賴于PPARγ與RXR的二聚和與過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件形成的異二聚物鍵。連同表達(dá)載體和報(bào)道載體，還用質(zhì)粒pCH110轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其提供轉(zhuǎn)染效率和結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照。
實(shí)驗(yàn)過程
使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH-3T3)[Hogan J.C.等，BiochemBiophys Res Commun.287(2)，484-92(2001)]。用報(bào)道質(zhì)粒、編碼PPARγ受體的表達(dá)質(zhì)粒和對照載體pCH110轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。使細(xì)胞與濃度逐漸增加的試驗(yàn)化合物接觸并評價(jià)CAT活性。使用未處理過的細(xì)胞作為對照。
細(xì)胞培養(yǎng)
按照通常的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)，37℃，5％v/v二氧化碳?xì)夥?，使?.7g/l碳酸氫鈉、4mM L-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖、1mM丙酮酸鈉和10％v/v小牛血清修飾的DMEM(Dulbeceo′s修飾的Eagle′s培養(yǎng)基)作為生長培養(yǎng)基，在有鏈霉素100μg/ml和青霉素100U/ml(終濃度)存在的條件下。
NIH-3T3細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
使用已在先前實(shí)施例中描述過的轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6(Roche)對細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之前24小時(shí)，以8.0×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞平板接種在12-孔平板中并在37℃、5％v/v CO2氣氛下維持。轉(zhuǎn)染之前2小時(shí)，更換沒有血清的培養(yǎng)基，然后按照先前實(shí)施例所述用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6處理細(xì)胞。5小時(shí)后，在有或沒有3種不同濃度(2、20和100μM)待測分子存在的條件下，用1ml含血清和抗生素的完全培養(yǎng)基更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。羅格列酮，一種已知的PPARγ配體，用作陽性參照化合物。
細(xì)胞蛋白提取物的制備和CAT活性的測定
完全按先前實(shí)施例所述制備細(xì)胞蛋白提取物并進(jìn)行CAT活性測定。
測定β-半乳糖苷酶活性的試驗(yàn)
作為CAT活性相對于轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對照，使用由共-轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCH110中相應(yīng)基因編碼的β-半乳糖苷酶活性。
完全按照先前實(shí)施例所述測量β-半乳糖苷酶活性。
為了使CAT測定結(jié)果相對于β-半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化，使用先前實(shí)施例中描述的公式。
表9舉例給出多種化合物的PPARγ激動劑活性。
表9
PPARγ在NIH-3T3細(xì)胞中介導(dǎo)的反式激活測定。
結(jié)果以報(bào)道基因CAT的激活百分比表示，通常把有參照化合物(羅格列酮，2μM)存在條件下的測量值假定為100％。
在表1-7a中給出的所得結(jié)果表明本發(fā)明的化合物是用于治療糖尿病和高脂血癥、用于增加HDL-膽固醇水平、和用于預(yù)防和治療與糖尿病和胰島素抵抗有關(guān)的并發(fā)癥、用于CHD的一級和二級預(yù)防的有效藥劑，且可用于脂肪肝的治療。
本發(fā)明的目的是藥物組合物，它含有作為其活性成分的至少一種式(I)化合物，單獨(dú)或與一種或多種式(I)化合物聯(lián)合，或者所述一種或多種式(I)化合物與用于治療本發(fā)明所述疾病的其它活性成分，例如具有降低血清葡萄糖和血清脂質(zhì)活性的其他產(chǎn)品聯(lián)合；為分開的劑量形式或適于聯(lián)合療法的形式。本發(fā)明活性成分將是與藥劑學(xué)常規(guī)使用的適宜載體和/或賦形劑(如最新版的“Remington’sPharmaceutical Sciences Handbook”中所述的那些)的混合物。本發(fā)明組合物含治療有效量的活性成分。劑量由本部門專家例如臨床醫(yī)生或初級保健護(hù)理醫(yī)生根據(jù)待治療的疾病類型和患者的狀況確定，或伴隨服用其他活性成分。例如可給予0.01-400mg/天，優(yōu)選0.1-200mg/天的劑量。
藥物組合物的實(shí)施例是允許口服或非腸道—靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮給藥的那些。適用于此目的的適宜藥物組合物是片劑、硬膠囊或軟膠囊、粉劑、溶液、混懸液、糖漿劑和用于當(dāng)場配成液體藥劑的固體形式。非腸道給藥的組合物是，例如，所有的肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下可注射形式，或其形式為溶液、混懸液或乳液。還可提及脂質(zhì)體制劑。其它形式是用于控釋活性成分或用于口服給藥的片劑，用適宜涂層包衣的片劑、微囊化粉劑、環(huán)糊精復(fù)合物，和長效制劑，例如，皮下長效制劑，如長效注射劑或植入制劑。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、外消旋混合物、各對映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體和互變異構(gòu)體用于制備預(yù)防和治療高脂血癥和高血糖癥的藥物的用途
其中
R是-H；可能被一個(gè)或多個(gè)鹵素基團(tuán)、硝基、羥基、烷基和烷氧基取代的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)的芳基或雜芳基，其中所述烷基和烷氧基可能被一個(gè)或多個(gè)鹵素基團(tuán)取代；
n是0-3；
p是0-1；
X是-OH、-O-C1-C4烷基；
R1和R2，其可以相同或不同，選自-H；C1-C5烷基，-COX；
Q選自NH、O、S、-NHC(O)O-、-NHC(O)NH-、-NHC(O)S-、-OC(O)NH-、-NHC(S)O-、-NHC(S)NH-、-C(O)NH-；
且Y是O、S。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中R是可能被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子、烷基、烷氧基或鹵代烷基優(yōu)選甲基、甲氧基或三氟甲基、硝基、單-或二-烷基胺取代的芳基，優(yōu)選p是1，n是0、1或2，且Q是氧。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中R是雜芳基，優(yōu)選含有氮作為雜原子，例如，吲哚和咔唑，經(jīng)由所有容許的位置與分子的其余部分結(jié)合；特別優(yōu)選的是1-吲哚基和1-咔唑基，且優(yōu)選p是1，n是0、1或2，且Q是氧。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述化合物選自
i.2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2195)；
ii.2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2518)；
iii.2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1929)；
iv.2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2534)；
v.2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2531)；
vi.2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2365)；
vii.2-[4-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]異丁酸甲酯(ST2387)；
viii.2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST1983)；
ix.2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2394)；
x.2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2167)；
xi.2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2011)；
xii.2-[4-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2505)；
xiii.2-[3-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2653)；
xiv.2-[4-(2-(2，4-二氯苯基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2652)；
xv.2-[3-(2-(咔唑-9-基)乙氧基)苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2618)；
xvi.2-[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2622)；
xvii.2-[3-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2651)；
xviii.2-[3-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2609)；
xix.2-[4-[2-(2-萘基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基-丙酸(ST2036)；
xx.2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2577)；
xxi.2-[4-[2-(1-(5-芐氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2562)；
xxii.2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2501)；
xxiii.2-[4-[2-(1-(5-甲氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]異丁酸(ST2733)；
xxiv.2-[4-[2-(1-(5-芐氧基)吲哚基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2740)；
xxv.2-甲基-2-[3-[5-(4-硝基苯基)糠氧基]苯硫基]丙酸(ST2753)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述化合物是2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]異丁酸甲酯(ST2195)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述化合物是2-[3-[2-(4-氯苯基)乙氧基]苯硫基]-2-甲基丙酸(ST2518)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于預(yù)防和治療糖尿病，特別是2型糖尿??；糖尿病的微血管并發(fā)癥，如糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性腎病；糖尿病的大血管并發(fā)癥，如動脈粥樣硬化、外周血管病、心肌梗塞和中風(fēng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于預(yù)防和治療綜合征X、多囊性卵巢綜合征、肥胖和各種形式的胰島素抵抗。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于預(yù)防和治療脂肪肝、特別是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)和NASH(非酒精性脂肪肝炎)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于預(yù)防和治療高脂血癥、高膽固醇血癥、高血壓，用于冠心病(CHD)的一級和二級預(yù)防，并用于提高HDL-膽固醇水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物是片劑、軟膠囊或硬膠囊、粉劑、溶液、混懸液、糖漿劑、用于臨時(shí)配成液體制劑的固體形式、乳液、脂質(zhì)體制劑、活性成分的控釋形式、用適宜涂層包衣的包衣片劑、微囊化的粉劑、環(huán)糊精復(fù)合物、長效制劑形式，例如，皮下長效制劑形式，如長效注射劑或植入制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物可口服或非腸道給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中式(I)化合物以0.01-400mg的劑量存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中式(I)化合物以0.1-200mg的劑量存在。
15.含有作為其活性成分的至少一種式(I)化合物以及混合一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或成分的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了式(I)的α－苯硫基羧酸和α－苯氧基羧酸的衍生物的用途其中的取代基具有正文中描述的含義，用于制備預(yù)防和治療糖尿病，特別是2型糖尿病，其并發(fā)癥，各種形式的胰島素抵抗和高脂血癥的藥物。
文檔編號C07C327/00GK1728992SQ200380106699
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者F·基安尼斯, E·塔索尼, M·O·緹恩緹, P·派索托, N·德爾沃莫, A·F·斯阿羅尼, T·布魯尼緹, F·M·米拉佐 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司