專利名稱：作為磷酸酶抑制劑的嘧啶并三嗪的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺化合物，其用于抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，特別是PTP1B。
本發(fā)明具體涉及下式的化合物 其中R1和R2單獨(dú)地選自氫，或R1和R2一起形成一個(gè)鍵，-CH2-，-O-，-NH-或-N-R3，R3為低級(jí)烷基或-CH2-Ar，和Ar選自未取代的苯基；未取代的萘基；由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，低級(jí)烷基-環(huán)烷基，低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基，鹵素，氰基或三氟甲基單-或二-取代的苯基；和由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，低級(jí)烷基-環(huán)烷基，低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基或鹵素單-或二-取代的萘基；或其藥用鹽。
蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化過程中的關(guān)鍵酶。這些酶的抑制能夠在多信號(hào)傳遞途徑的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，其中酪氨酸磷酸化脫磷酸化發(fā)揮作用。PTP1B是一種具體的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，其通常用作該類酶的原型。
PTPase抑制劑認(rèn)為是一種潛在的用于治療糖尿病的治療藥。參見例如，Moeller等，3(5)527-40，Current Opinion in Drug Discovery andDevelopment，2000；或Zhang，Zhong-Yin，5416-23，Current Opinion inChemical Biology，2001。
已發(fā)現(xiàn)下式的化合物 及其藥用鹽，其中R1和R2如下所定義，抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，特別是PTP1B，因此應(yīng)能夠用于降低哺乳動(dòng)物血糖濃度。
本發(fā)明中使用的術(shù)語″低級(jí)烷基″，單獨(dú)或組合，表示含有最多六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基，乙基，n-丙基，異丙基，n-丁基，仲-丁基，異丁基，叔-丁基，n-戊基，n-己基等。低級(jí)烷基可以是未取代的，或被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自環(huán)烷基，硝基，芳氧基，芳基，羥基，鹵素，氰基，低級(jí)烷氧基，低級(jí)烷?；图?jí)烷硫基，低級(jí)烷基亞磺?；?，低級(jí)烷基磺?；腿〈陌被〈?。取代的低級(jí)烷基的例子包括2-羥基乙基，3-氧丁基，氰基甲基和2-硝基丙基。
術(shù)語″環(huán)烷基″指未取代的或取代的3-至7-元碳環(huán)。用于本發(fā)明的取代基是羥基，鹵素，氰基，低級(jí)烷氧基，低級(jí)烷?；图?jí)烷基，芳?；?，低級(jí)烷硫基，低級(jí)烷基亞磺酰基，低級(jí)烷基磺?；蓟?，雜芳基和取代的氨基。
術(shù)語″低級(jí)烷氧基″指含有最多六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，例如甲氧基，乙氧基，n-丙氧基，異丙氧基，n-丁氧基，叔-丁氧基等。
術(shù)語″低級(jí)烷硫基″指通過二價(jià)硫原子結(jié)合的低級(jí)烷基，例如甲基巰基或異丙基巰基。
術(shù)語″芳基″指單-或二環(huán)芳基，例如苯基或萘基，其是未取代的或通過常規(guī)取代基取代。優(yōu)選的取代基是低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基低級(jí)烷基，羥基，羥基烷氧基，鹵素，低級(jí)烷硫基，低級(jí)烷基亞磺?；图?jí)烷基磺?；?，氰基，硝基，全氟代烷基，烷?；?alkanyoyl)，芳?；?，芳基炔基，低級(jí)炔基和低級(jí)烷?；被Ｌ貏e優(yōu)選的取代基是低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基，鹵素，氰基和全氟代低級(jí)烷基。用于本發(fā)明的芳基的例子是苯基，p-甲苯基，p-甲氧基苯基，p-氯苯基，m-羥基苯基，m-甲硫基苯基，2-甲基-5-硝基苯基，2，6-二氯苯基，l-萘基等。
術(shù)語″低級(jí)烷基-芳基″指前面定義的低級(jí)烷基，其中一個(gè)或多個(gè)氫原子被前面定義的芳基取代。任何常規(guī)低級(jí)烷基-芳基均可用于本發(fā)明，例如芐基等。
術(shù)語″低級(jí)烷氧基-芳基″指前面定義低級(jí)烷氧基，其中一個(gè)或多個(gè)氫原子被前面定義的芳基取代。任何常規(guī)低級(jí)烷氧基-芳基均可以用于本發(fā)明，例如芐氧基。
術(shù)語″低級(jí)烷氧基羰基″指結(jié)合有羰基的低級(jí)烷氧基。烷氧基羰基的例子有乙氧基羰基等。
術(shù)語“藥用鹽”指保留通式I化合物的生物有效性和性質(zhì)的常規(guī)酸加成鹽或堿加成鹽，其由適當(dāng)?shù)姆嵌拘杂袡C(jī)或無機(jī)酸，或者有機(jī)或無機(jī)堿形成。酸加成鹽的例子包括來源于無機(jī)酸例如鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸和硝酸的那些鹽，以及來源于有機(jī)酸例如p-甲苯磺酸，水楊酸，甲磺酸，草酸，琥珀酸，檸檬酸，蘋果酸，乳酸，富馬酸等。堿加成鹽的例子包括來源于銨、鉀、鈉和季銨的氫氧化物，例如氫氧化四甲基銨的那些鹽。藥物化合物(即藥物)化學(xué)修飾成鹽是藥學(xué)工作者的常規(guī)技術(shù)，以便獲得該化合物改進(jìn)的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，吸濕性，流動(dòng)性和溶解性。參見例如，H.Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(6th Ed.1995)pp.196和1456-1457。
本發(fā)明包括式I的化合物 及其藥用鹽。按照本發(fā)明，R1和R2單獨(dú)地選自氫，或R1和R2一起形成一個(gè)鍵，-CH2-，-O-，-NH-或-N-R3，
R3為低級(jí)烷基或-CH2-Ar，和Ar選自未取代的苯基；未取代的萘基；由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，低級(jí)烷基-環(huán)烷基，低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基，鹵素，氰基或三氟甲基單-或二-取代的苯基；和由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，低級(jí)烷基-環(huán)烷基，低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基或鹵素單-或二-取代的萘基。
在式I的化合物中，優(yōu)選的化合物是式II的化合物 其中Ar選自未取代的苯基；未取代的萘基；由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，低級(jí)烷基-環(huán)烷基，低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基，鹵素，氰基或三氟甲基單-或二-取代的苯基；和由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，低級(jí)烷基-環(huán)烷基，低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基或鹵素單-或二-取代的萘基。
在式II化合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是未取代的苯基或未取代的萘基。
在式II化合物的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，芳基，環(huán)烷基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基，鹵素，氰基或三氟甲基單取代的苯基。
在式II化合物的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，鹵素，氰基或三氟甲基單取代的苯基。
在式II化合物的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，鹵素，或氰基二取代的苯基。
在式II化合物的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，低級(jí)烷基-芳基，低級(jí)烷氧基-芳基或鹵素單取代的萘基。
在式II化合物的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，或鹵素單取代的萘基。
在式II化合物的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar是由低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，或鹵素二取代的萘基。
本發(fā)明的化合物能夠以立體異構(gòu)體形式存在，特別是對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體形式存在，所有這些均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物選自下列化合物1. 3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；2. 3-二乙基氨基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3. 3-吡咯烷-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；4. 3-哌啶-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；5. 3-嗎啉-4-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；6. 3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；7. 3-(4-芐基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；8. 3-(4-萘-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；9. 3-(4-萘-1-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；10. 3-(4-聯(lián)苯基-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；11. 3-[4-(2-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；12. 3-[4-(3-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；13. 3-[4-(4-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；14. 3-[4-(3-甲氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；15. 3-[4-(3-氟-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；16. 3-[4-(3-三氟甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；
17. 3-[4-(4-三氟甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；18. 3-[4-(3-溴-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；19. 3-[4-(3-氰基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；20. 3-[4-(2，4-二甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；21. 3-[4-(4-乙基-2-甲基-萘-1-基甲基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；和22. 3-[4-(4-芐氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物選自下列化合物3-二乙基氨基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-芐基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-萘-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-萘-1-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-聯(lián)苯基-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-[4-(2，4-二甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-[4-(4-乙基-2-甲基-萘-1-基甲基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；和3-[4-(4-芐氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺。
進(jìn)一步優(yōu)選式I化合物的制備方法，包括將式3的化合物
在式R4NHR5化合物的存在下反應(yīng)，其中R4為-CH2CH2R1，R5為-CH2CH2R2，R1和R2如前面所定義。
還優(yōu)選式I化合物用作治療活性物質(zhì)。
進(jìn)一步優(yōu)選用于制備預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物的式I化合物。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選方面是含有式I化合物和治療惰性載體的藥物組合物。
本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是按照上述方法制備的式I化合物。
進(jìn)一步優(yōu)選的是治療和/或預(yù)防與血糖水平有關(guān)的疾病的方法，該方法包括施用有效量的式I化合物。特別優(yōu)選的是治療糖尿病的方法。
本發(fā)明的化合物在體外抑制PTP1B，并已顯示可在體內(nèi)降低血糖水平。因此，本發(fā)明的化合物可用于治療糖尿病。
本發(fā)明的化合物可以口服、直腸、或非腸道給藥，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)或經(jīng)皮給藥；或者舌下給藥或作為opthalmalogical制劑。給藥劑型的例子有用于口服給藥的膠囊、片劑、混懸液或溶液，栓劑、注射液、滴眼液、藥膏劑或噴霧溶液。
靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、口服或吸入給藥是優(yōu)選的給藥方式。本發(fā)明化合物施用有效的劑量根據(jù)特定活性成分的性質(zhì)、患者的年齡和要求、以及給藥方式而改變。劑量可以通過任何常規(guī)方法確定，例如限制劑量的臨床試驗(yàn)。通常，劑量優(yōu)選每天約0.1到100mg/kg體重，特別優(yōu)選的劑量為每天1-25mg/kg。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有藥物有效量的本發(fā)明化合物和藥用載體的藥物組合物。該組合物可以通過任何常規(guī)方法配制。片劑或顆粒劑可以含有一系列粘合劑、填充劑、載體或稀釋劑。液體組合物可以為，例如無菌水-混溶溶液形式。膠囊除了含有活性成分之外，還可以含有填充劑或增稠劑。另外，還可以存在改善口味的添加劑，通常用作防腐、穩(wěn)定、保濕和乳化的物質(zhì)，以及改變滲透壓的鹽、緩沖液和其它添加劑。
上述載體材料和稀釋劑可以含有任何常規(guī)藥用有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)，例如水、明膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、阿拉伯膠、聚亞烷基二醇等。
口服單元?jiǎng)┬?，例如片劑和膠囊，優(yōu)選含有25mg至1000mg本發(fā)明的化合物。本發(fā)明的化合物可以通過任何常規(guī)方法合成。下面反應(yīng)路線1-3描述了一種具體方法。
反應(yīng)路線1 中間體氯甲基化合物3從商業(yè)可獲得的反應(yīng)路線1中所示的2，4-二氨基-2-巰基嘧啶半硫酸鹽(hemisulfate)1制備。對(duì)1進(jìn)行S-甲基化(例如用氫氧化鈉和碘甲烷)，然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下(例如，在約50℃下用硝酸鈉和乙酸)進(jìn)行亞硝?；?，得到中間體芳基亞硝?；苌?。在室溫下，在適當(dāng)?shù)娜軇├缍谆柞０分?，用肼取?中的硫甲基，然后在酸性條件(例如HCl)和加熱(例如，約85℃)下，與商業(yè)可獲得的氯甲基乙醛二乙縮醛縮合，得到氯甲基衍生物3。
反應(yīng)路線2 然后將氯甲基衍生物3在適當(dāng)溶劑例如乙醇中和加熱(例如，約80-100℃)條件下與各種已知胺反應(yīng)，得到反應(yīng)路線2中所示的相應(yīng)氨基甲基衍生物4。對(duì)于反應(yīng)路線2中的胺R4NHR5，R4為-CH2CH2R1，R5為-CH2CH2R2，R1和R2如前面所定義。
反應(yīng)路線3 哌嗪衍生物5(例如，其中R4和R5一起形成-CH2CH2NHCH2CH2-部分的衍生物4)從反應(yīng)路線2中所示的氯甲基衍生物3和哌嗪制備。衍生物5與多種已知鹵代烷(例如，R3Br或R3I，其中R3如上文所定義)的烷基化在適當(dāng)?shù)娜軇├缍谆柞０分?，并?yīng)用適當(dāng)?shù)膲A例如碳酸鉀，在室溫下進(jìn)行，得到反應(yīng)路線3中所示的二烷基化哌嗪衍生物6。
實(shí)施例實(shí)施例16-甲硫基-5-亞硝基-嘧啶-2，4-二胺
步驟1向攪拌下的105g KOH在1L水中的溶液中加入2，4-二氨基-6-巰基嘧啶半硫酸鹽1(70.0g)，然后加入碘甲烷(91mL)。將得到的混合液劇烈攪拌4h，然后過濾出固體沉淀，用水洗滌，空氣干燥過夜，得到54.0g6-甲硫基-嘧啶-2，4-二胺，其為棕褐色固體。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)6.20(s，2H)，5.90(s，2H)，5.55(s，1H)，2.30(s，3H)。
步驟2向攪拌下的6-甲硫基-嘧啶-2，4-二胺(50.0g；321mmol)在水(1000mL)中的懸浮液中，加入500mL 2N乙酸。將混合液加熱到50℃，然后迅速加入NaNO2溶液(24.0g；353mmol在200mL H2O中)。50℃下保持1hr后，將深藍(lán)色/紫色混合液冷卻到室溫，然后過濾。將該深藍(lán)/紫色固體用水洗滌幾次，最后用乙醚洗滌。將該固體空氣干燥，得到51.0g 6-甲硫基-5-亞硝基-嘧啶-2，4-二胺2，其為藍(lán)/紫色固體。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.70(s，1H)，8.10(s，1H)，7.95(m，2H)，2.43(s，3H)。
實(shí)施例26-肼基-5-亞硝基-嘧啶-2，4-二胺 在室溫下，將肼水合物(55％溶液，14.5mL)快速加入6-甲硫基-5-亞硝基-嘧啶-2，4-二胺2(12.0g；64.9mmol)在DMF的懸浮液中。將該混合液攪拌過夜，然后過濾該亮粉色混合液，固體用DMF然后用乙醚洗滌幾次，空氣干燥，得到9.53g 6-肼基-5-亞硝基-嘧啶-2，4-二胺，其為亮粉色固體。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)8.00(s，1H)，7.40(s，1H)，7.05(m，2H)，5.35(m，2H)。
實(shí)施例33-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 將濃HCl(14mL)加入攪拌中的冰冷卻的DMF(350mL)，然后加入7.14g 6-肼基-5-亞硝基-嘧啶-2，4-二胺。5min后，用2分鐘的時(shí)間加入氯乙醛二乙縮醛(15.4mL)。撤去冰浴，使混合物回溫到室溫。1小時(shí)后，將混合物升溫至85℃1.5小時(shí)，然后在2.5小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。過濾混合物以除去少量的棕色不溶物，用濃NH4OH溶液使濾液呈堿性，然后用等量的水稀釋。將混合物置于一邊1小時(shí)，然后過濾以收集橙色/棕色固體，其進(jìn)一步在真空下通過P2O5干燥，得到3.50g 3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)8.25(s，2H)，7.95(s，1H)，7.30(bs，1H)，5.02(s，2H).
實(shí)施例43-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺
將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(2.00g；9.5mmol)和哌嗪(2.50g；29mmol)在無水乙醇中的混合物在密封的管子里加熱至100℃4小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并蒸發(fā)。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到1.44g黃色3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺5，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.55(s，1H)，9.40(s，1H)，8.80(s，2H)，8.45(s，1H)，4.15(s，2H)，3.10(m，4H)，2.80(m，4H).
實(shí)施例53-二乙基氨基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(200mg；0.95mmol)和二乙胺(2.00mL)在無水乙醇(2.0mL)中的混合物在密封的管子里加熱至100℃5小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到65mg黃色3-二乙基氨基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺4，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.10(bs，1H)，8.90(bs，1H)，8.15(bs，2H)，4.80(s，2H)，3.25(q，4H)，1.30(t，6H).
實(shí)施例63-吡咯烷-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺
將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(70mg；0.33mmol)和1.0mL吡咯烷的混合物在密封的管子里加熱至80℃7小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到50mg黃色3-吡咯烷-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.15(bs，1H)，8.88(bs，1H)，8.20(bs，2H)，3.67(s，2H)，3.20(bm，2H)，1.85-2.10(m，4H).
實(shí)施例73-哌啶-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(70mg；0.33mmol)和1.0mL哌啶的混合物在密封的管子里加熱至80℃7小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到111mg黃色3-哌啶-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.18(bs，1H)，8.95(bs，1H)，8.30(bs，2H)，4.80(s，2H)，3.50(bm，2H)，3.10(bm，2H)，1.35-1.90(m，6H).
實(shí)施例83-嗎啉-4-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(200mg；0.95mmol)和2.0mL嗎啉的混合物在密封的管子里加熱至80℃7小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到261mg黃色3-嗎啉-4-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.25(bs，1H)，9.00(bs，1H)，8.30(bs，2H)，4.80(s，2H)，3.85(m，4H)，3.30(m，4H).
實(shí)施例93-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(200mg；0.95mmol)和N-甲基哌嗪(2.00mL)的混合物在密封的管子里加熱至80℃7小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到178mg黃色3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(D2O，ppm)4.45(s，2H)，3.10-3.60(m，8H)，2.90(s，3H).
實(shí)施例103-(4-芐基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 將3-氯甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺3(48mg；0.23mmol)和N-芐基哌嗪(0.12mL)在乙醇(0.1mL)中的混合物在密封的管子里加熱至90℃2小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。通過反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化粗產(chǎn)物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到26mg黃色3-(4-芐基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)7.50(m，5H)，4.34(s，2H)，4.25(s，2H)，2.90-3.40(m，8H).
實(shí)施例113-(4-萘-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(30mg；0.05mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入2-溴甲基萘(17mg；0.075mmol)，然后加入碳酸鉀(28mg；0.20mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到19mg黃色3-(4-萘-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.37(bs，1H)，9.23(bs，1H)，8.20(bs，1H)，7.98(m，5H)，7.57(m，3H)，4.45(bs，2H)，4.15(bs，2H)，2.60-3.35(m，8H).
實(shí)施例123-(4-萘-1-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(70mg；0.12mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入1-氯甲基萘(0.023mL；0.18mmol)，然后加入碳酸鉀(65mg；0.470mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到35mg黃色3-(4-萘-1-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.36(bs，1H)，9.23(bs，1H)，8.53(bs，1H)，8.32(m，1H)，8.23(bs，1H)，8.00(m，2H)，7.60(m，4H)，4.68(bs，2H)，4.23(bs，2H)，2.80-3.40(m，8H).
實(shí)施例133-(4-聯(lián)苯基-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺
向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(30mg；0.05mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入4-氯甲基聯(lián)苯基(15mg；0.08mmol)，然后加入碳酸鉀(28mg；0.20mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至30％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到20mg黃色3-(4-聯(lián)苯基-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)9.60(s，1H)，9.43(s，1H)，8.83(bs，1H)，8.53(bs，1H)，7.35-7.82(m，9H)，4.33(s，2H)，4.15(s，2H)，2.70-3.40(m，8H).
實(shí)施例143-[4-(2-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入o-氯芐基氯化物(0.015mL；0.12mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到17mg黃色3-[4-(2-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(DMSO-d6，ppm)7.40-7.70(m，4H)，4.44(s，2H)，4.36(s，2H)，2.80-3.40(m，8H).
實(shí)施例153-[4-(3-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入m-氯芐基氯化物(0.015mL；0.12mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到9mg黃色3-[4-(3-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.40-7.58(m，4H)，4.32(s，4H)，2.80-3.40(m，8H).
實(shí)施例163-[4-(4-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺
向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入p-氯芐基氯化物(29mg；0.18mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到21mg黃色3-[4-(4-氯-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)8.20(m，4H)，4.30(s，4H)，2.88-3.40(m，8H).
實(shí)施例173-[4-(3-甲氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入m-甲氧基芐基氯化物(19mg；0.12mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到30mg黃色3-[4-(3-甲氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.40(m，1H)，7.06(m，3H)，4.30(s，2H)，4.23(s，2H)，3.81(s，3H)，2.80-3.40(m，8H).
實(shí)施例183-[4-(3-氟-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入m-氟芐基氯化物(0.0143mL；0.12mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到11mg黃色3-[4-(3-氟-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.18-7.60(m，4H)，4.33(s，2H)，4.27(s，2H)，2.83-3.38(m，8H).
實(shí)施例193-[4-(3-三氟甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入m-三氟甲基芐基溴化物(0.021mL；0.14mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到13mg黃色3-[4-(3-三氟甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.63-7.92(m，4H)，4.38(s，2H)，4.32(s，2H)，2.85-3.38(m，8H).
實(shí)施例203-[4-(4-三氟甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入p-三氟甲基芐基溴化物(0.021mL；0.14mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到22mg黃色3-[4-(4-三氟甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.77(m，4H)，4.37(s，2H)，4.33(s，2H)，2.90-3.38(m，8H).
實(shí)施例213-[4-(3-溴-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺
向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入m-溴芐基溴化物(34mg；0.14mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到15mg黃色3-[4-(3-溴-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.38-7.80(m，4H)，4.30(s，4H)，2.85-3.38(m，8H).
實(shí)施例223-[4-(3-氰基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入m-氰基芐基溴化物(23mg；0.18mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到12mg黃色3-[4-(3-氰基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)7.60-7.92(m，4H)，4.37(s，2H)，4.27(s，2H)，2.95-3.35(m，8H).
實(shí)施例23
3-[4-(2，4-二甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入2，4-二甲基芐基氯化物(0.020mL；0.13mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到10mg黃色3-[4-(2，4-二甲基-芐基)-哌嗪-l-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(dmso-d6，ppm)9.40(bs，1H)，8.17(bs，2H)，7.00-7.40(m，3H)，4.28(bs，2H)，4.10(bs，2H)，2.95-3.35(m，8H)，2.34(s，3H)，2.28(s，3H).
實(shí)施例243-[4-(4-乙基-2-甲基-萘-1-基甲基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入1-氯甲基-2-甲基-萘(34mg；0.18mmol)，然后加入碳酸鉀(55mg；0.40mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到23mg黃色3-[4-(4-乙基-2-甲基-萘-1-基甲基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(MeOH-d4，ppm)8.07(m，1H)，7.92(m，2H)，7.40-7.50(m，3H)，4.90(s，2H)，4.37(s，2H)，2.70(s，3H)，2.80-3.45(m，8H).
實(shí)施例253-[4-(4-芐氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺 向攪拌下的3-哌嗪-1-基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺TFA鹽5(50mg；0.08mmol；實(shí)施例4中制備)在無水DMF(1.0mL)的溶液中加入1-氯甲基-2-甲基-萘(27mg；0.12mmol)，然后加入碳酸鉀(58mg；0.42mmol)。在室溫下將混合液攪拌24h，然后置于CH3CN/H2O/0.1％TFA中。經(jīng)反相HPLC(Rainin C18，0％CH3CN至50％CH3CN梯度，CH3CN/H2O，0.1％TFA)純化混合物，在真空下除去CH3CN后凍干含有產(chǎn)物的亮黃色級(jí)分，得到23mg黃色3-[4-(4-芐氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺，其為三氟乙酸鹽。
1H NMR(dmso-d6，ppm)9.63(s，1H)，9.50(s，1H)，8.91(bs，1H)，8.77(bs，1H)，7.40(m，7H)，7.05(m，2H)，5.12(s，2H)，4.25(s，2H)，4.17(s，2H)，2.60-3.40(m，8H).
實(shí)施例26 PTP1B的體外抑制用常規(guī)分子生物學(xué)方法從人cDNA文庫克隆人PTP1B(1-321)。該cDNA序列與報(bào)道的人PTP1B序列(登記號(hào)M33689)相同。按照Barford D.等J.Mol Biol(1994)239，726-730的描述從大腸桿菌(E.coli)表達(dá)和純化該蛋白質(zhì)。
PTPase檢測(cè)PTPase活性的測(cè)定用下述兩種方法之一進(jìn)行第一種方法用于測(cè)定PTP1B抑制活性，使用以胰島素受體酪氨酸自磷酸化位點(diǎn)(TRDI(pY)E)的氨基酸序列為基礎(chǔ)的磷酸化的酪氨酸肽作為底物。反應(yīng)條件如下在含有37.5mM Mes緩沖液pH6.2，140mM NaCl，0.05％BSA和300nM DTT的緩沖液中將PTP1B(0.5-2nM)與化合物孵育15min。加入50μM底物起始反應(yīng)。在室溫下(22-25℃)保持20min后，加入KOH終止反應(yīng)，按照以前的報(bào)道(Harder等1994 Biochem J.298；395)，利用孔雀綠(Malachite Green)檢測(cè)游離磷酸的量。
第二種方法用于通過PTPase板測(cè)定一般PTPase抑制活性。每種酶使用的底物(6，8-二氟-4-甲基umbelliferyl磷酸(DiFMUP；來源于MolecularProbes)在Km。緩沖條件與上述孔雀綠檢測(cè)法中的相同，除了用37.5mM二乙基戊二酸pH6.2代替MES。用KOH終止反應(yīng)。在這種方法中，脫磷酸化的產(chǎn)品發(fā)出熒光，記錄熒光(激發(fā)360mM/發(fā)射460nM)。
對(duì)于動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，使用相同的緩沖條件，除了用酶起始反應(yīng)，反應(yīng)10分鐘后終止。
按照上述體外分析試驗(yàn)，本發(fā)明化合物對(duì)PTP1B的IC50低于500μM，優(yōu)選低于100。
如上述體外分析試驗(yàn)所測(cè)定，實(shí)施例4-25的所有化合物的PTP1B IC50均低于30μM。
實(shí)施例27化合物在小鼠模型中對(duì)血糖水平的影響為了測(cè)定抗血糖效果，在已確立的II型糖尿病和肥胖嚙齒動(dòng)物體內(nèi)模型中測(cè)試化合物。
肥胖ob/ob小鼠使用雄性或雌性ob/ob(C57BL6/J)小鼠(Diabetologia 14，141-148(1978))(Jackson Labs)40-50g評(píng)價(jià)化合物對(duì)于降糖以及降低甘油三酸酯的效果。將小鼠根據(jù)血糖水平以及體重分成10-12只動(dòng)物的組。用嚙齒動(dòng)物常規(guī)食物和水無限制地喂養(yǎng)小鼠。用填喂法每天給小鼠喂化合物(懸浮于1％Na-CMC)，連續(xù)5天。第一天給藥前，剪下小鼠部分尾巴，從尾靜脈采血，記錄初始血糖。第五天處理后2小時(shí)，用同樣的方法再次測(cè)量血糖。然后麻醉動(dòng)物，放血處死。采集血液和組織用于分析。如果化合物處理鼠的血糖相對(duì)于載體處理鼠的血糖表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p≤0.05)降低，則認(rèn)為該化合物具有活性。
飲食誘導(dǎo)的肥胖C57BL6/J小鼠(DIO小鼠)將小鼠用高脂肪飲食喂養(yǎng)4-6個(gè)月，可以產(chǎn)生II型糖尿病小鼠。(Diabetes 371163-67 Sept 1988)。將雄性C57B16/J小鼠(3-4周齡)用高脂肪飲食喂養(yǎng)4-6周。此時(shí)，這些小鼠表現(xiàn)高血糖和高胰島素，體重40-50g。將DIO小鼠(n＝6)稱重，口服給藥處理之前禁食2小時(shí)。填喂法給藥之前，按照上述方法從小鼠尾靜脈得出初始(零時(shí)刻)血糖值。
用化合物處理小鼠每天1次，連續(xù)5天。載體小鼠不給化合物。在第5天給藥前(0時(shí)刻)以及給藥后2小時(shí)和4小時(shí)，測(cè)量血糖。給藥后4小時(shí)，測(cè)量胰島素和甘油三酸酯。
如果化合物在動(dòng)物中的效果相對(duì)于載體處理動(dòng)物表現(xiàn)糖、胰島素和甘油三酸酯統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p＜0.05)降低，則認(rèn)為該化合物具有活性。
按照實(shí)施例27的方法，用實(shí)施例5，10和13的化合物進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，它們顯示血糖水平至少降低15％。
權(quán)利要求
1.下式的化合物 其中R1和R2單獨(dú)地選自氫，或R1和R2一起形成一個(gè)鍵，-CH2-，-O-，-NH-或-N-R3，R3為低級(jí)烷基或-CH2-Ar，和Ar選自未取代的苯基；未取代的萘基；由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、芳基、環(huán)烷基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)烷氧基-芳基、低級(jí)烷基-環(huán)烷基、低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基、鹵素、氰基或三氟甲基單-或二-取代的苯基；和由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、芳基、環(huán)烷基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)烷氧基-芳基、低級(jí)烷基-環(huán)烷基、低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基或鹵素單-或二-取代的萘基；或其藥用鹽。
2.按照權(quán)利要求1的化合物，其為具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物 其中Ar選自未取代的苯基；未取代的萘基；由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、芳基、環(huán)烷基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)烷氧基-芳基、低級(jí)烷基-環(huán)烷基、低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基、鹵素、氰基或三氟甲基單-或二-取代的苯基；和由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、芳基、環(huán)烷基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)烷氧基-芳基、低級(jí)烷基-環(huán)烷基、低級(jí)烷氧基-環(huán)烷基或鹵素單-或二-取代的萘基；或式II化合物的藥用鹽。
3.按照權(quán)利要求1或2的化合物，其中Ar是未取代的苯基或未取代的萘基。
4.按照權(quán)利要求1或2的化合物，其中Ar是由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、芳基、環(huán)烷基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)烷氧基-芳基、鹵素、氰基或三氟甲基單取代的苯基。
5.按照權(quán)利要求1至4之一的化合物，其中Ar是由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵素、氰基或三氟甲基單取代的苯基。
6.按照權(quán)利要求1至5之一的化合物，其中Ar是由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、鹵素或氰基二取代的苯基。
7.按照權(quán)利要求1至6之一的化合物，其中Ar是由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基-芳基、低級(jí)烷氧基-芳基或鹵素單取代的萘基。
8.按照權(quán)利要求1至7之一的化合物，其中Ar是由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或鹵素單取代的萘基。
9.按照權(quán)利要求1至8之一的化合物，其中Ar是由低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或鹵素二取代的萘基。
10.按照權(quán)利要求1至9之一的化合物，其選自3-二乙基氨基甲基-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-芐基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-萘-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-萘-1-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-(4-聯(lián)苯基-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基)-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-[4-(2，4-二甲基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；3-[4-(4-乙基-2-甲基-萘-1-基甲基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺；和3-[4-(4-芐氧基-芐基)-哌嗪-1-基甲基]-嘧啶并[5，4-e][1，2，4]三嗪-5，7-二胺。
11.按照權(quán)利要求1至10之一的化合物的制備方法，包括將式3的化合物 在式R4NHR5化合物的存在下反應(yīng)，其中R4為-CH2CH2R1，R5為-CH2CH2R2，R1和R2如權(quán)利要求1所定義。
12.按照權(quán)利要求1至10之一的化合物，其用作治療活性物質(zhì)。
13.按照權(quán)利要求1至10之一的化合物，其用于制備預(yù)防和/或治療糖尿病的藥物。
14.一種含有按照權(quán)利要求1至10之一的化合物和治療惰性載體的藥物組合物。
15.按照權(quán)利要求11的方法制備的權(quán)利要求1至10之一的化合物。
16.治療和/或預(yù)防與血糖水平有關(guān)的疾病的方法，該方法包括施用有效量的按照權(quán)利要求1至10之一的化合物。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中所述疾病是糖尿病。
18.前面描述的本發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及所示通式的化合物，其中R
文檔編號(hào)C07D487/04GK1610683SQ02826422
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者K·R·格廷, L·Q·塞蒂 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司