專利名稱：瘋草中苦馬豆素的提純工藝的制作方法
一、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域，涉及天然產(chǎn)物提取、分離和鑒定方法，特別涉及一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝。
國內(nèi)對瘋草有毒成分的研究起步較晚。20世紀80年代初期，國內(nèi)學(xué)者主要進行了草地瘋草種類、種群地理分布的資源調(diào)查。80年代中期開始了瘋草有毒成分的分離研究，1989年曹光榮等首次從我國黃花棘豆中分離鑒定出苦馬豆素，并證明是其主要有毒成分。在隨后的十幾年間，主要是曹光榮課題組及其培養(yǎng)的博士、碩士研究生圍繞我國甘肅棘豆、黃花棘豆、莖直黃芪、寬苞棘豆變異黃芪等瘋草系統(tǒng)地開展了研究工作，相繼取得了一些突破性進展，主要有從多種瘋草類植物中分離并鑒定出苦馬豆素；多種瘋草類植物中苦馬豆素的定量分析；改進了苦馬豆素的提取工藝及其參數(shù)；此項研究成果，在1996年獲得農(nóng)業(yè)部科技進步三等獎。
國外分離提純苦馬豆素的主要技術(shù)工藝是先將植物樣品在有機溶劑中浸提，再將浸提物過陽離子交換柱和瓊脂糖凝膠柱，最后重結(jié)晶獲得苦馬豆素。其不足是提取率低，不能批量生產(chǎn)。國內(nèi)在苦馬豆素提純的主要技術(shù)工藝方面尚屬空缺。
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝，本提純工藝采用陽離子交換柱層析、硅膠柱層析，分段升華等技術(shù)，最后獲得苦馬豆素，這樣可使苦馬豆素的提取率增加，產(chǎn)品純度提高。增強市場的竟爭力，促進苦馬豆素作為抗腫瘤藥物及免疫增強劑等開發(fā)的產(chǎn)業(yè)化。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，瘋草中苦馬豆素的提純工藝，其特點是，根據(jù)苦馬豆素的基本理化特性，首先采用陽離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經(jīng)硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品。
本發(fā)明的具體提純工藝分以下五個階段完成第一步，浸膏提取階段用工業(yè)甲醇從瘋草類植物中提取出有機成分總浸膏。
第二步，粗生物堿提取階段采用陽離子交換法提取出粗生物堿。
第三步，苦馬豆素粗品提取階段采用溶劑抽提法提取出苦馬豆素粗品。
第四步，苦馬豆素提取階段采用硅膠柱層析提取出苦馬豆素。
第五步，苦馬豆素純化階段采用分步升華法提取出苦馬豆素純品。
本發(fā)明的提純工藝提取成本低，產(chǎn)品純度高，且苦馬豆素提取率明顯優(yōu)于國外技術(shù)。
本發(fā)明以我國西北草原上豐富的瘋草類植物—黃花棘豆、甘肅棘豆、小花棘豆、莖直黃芪、變異黃芪等為材料，根據(jù)苦馬豆素的基本理化特性，采用陽離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經(jīng)硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品。
1.苦馬豆素的提純原理苦馬豆素屬多羥基吲哚里西啶類生物堿，分子量小，極性大，易溶于水、甲醇、乙醇、堿性氯仿等，易吸潮，且具有升華特性。本技術(shù)工藝根據(jù)苦馬豆素的基本理化特性，首先采用陽離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經(jīng)硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品。2.苦馬豆素提純的工藝路線第一步植物樣品(瘋草草粉)中有機總成分提取。稱取一定量的瘋草草粉，用5-10倍量工業(yè)甲醇反復(fù)冷浸提取4-6次，每次冷浸7天，過濾，合并甲醇液，減壓回收甲醇得浸膏。
第二步生物堿粗品提取?；厥占状妓玫慕啵?0-50倍(重量/體積)量1N鹽酸反復(fù)多次溶解，過濾，直到最后一次酸水液生物堿檢查陰性為止。合并濾液，用濃氨水調(diào)pH4-5，通過氫型陽離子交換樹脂柱，先用無離子水洗脫到流出液為無色，再用1N氨水洗脫，收集堿性洗脫液，回收溶劑，抽干得生物堿粗品。
第三步苦馬豆素粗品提取。第二步得到的生物堿粗品，先用分析純甲醇溶解，過濾，殘渣棄取，甲醇液減壓回收溶劑，所得浸膏再用堿性氯仿抽提，合并氯仿液，最后回收氯仿得苦馬豆素粗品。
第四步苦馬豆素分離。采用硅膠柱層析，干法上樣，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脫，TLC檢測，合并苦馬豆素部分，減壓抽干，得淺黃色粉末樣苦馬豆素。
第五步苦馬豆素純化。第四步得到的淺黃色粉末樣苦馬豆素，采用分步升華法獲得苦馬豆素純品。
發(fā)明人給出了以下的實施例，但本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例1甘肅棘豆中苦馬豆素的提取第一步，浸膏提取階段甘肅棘豆干草粉5kg，用30升工業(yè)甲醇冷浸提取4次，每次冷浸7天，過濾，合并甲醇液，減壓回收甲醇得到總浸膏680g，出膏率為13.6％。
第二步，粗生物堿提取階段680g總浸膏用6800mL1N鹽酸反復(fù)多次研溶，過濾，直到最后一次酸水液改良碘化鉍鉀檢查呈陰性反應(yīng)為止，合并酸水液。所得酸水液用濃氨水調(diào)pH至4-5，通過氫型陽離子交換樹脂柱，先用上樣量的100倍量無離子水洗脫至無色，再用20倍量1N氨水洗脫，收集堿性流出液，減壓回收溶劑得62.56g生物堿粗品，出堿率為1.3％。
第三步，苦馬豆素粗品提取階段62.56g生物堿粗品先用分析純甲醇溶解，過濾，回收溶劑，浸膏再用堿性氯仿抽提，直到抽提液檢不出苦馬豆素為止，合并抽提液，減壓回收氯仿提取出苦馬豆素粗品4g，提取率為0.08％。
第四步，苦馬豆素提取階段4g苦馬豆素粗品與等量的柱層析用硅膠拌樣，干法上樣，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脫，每20mL收集1份，共收集300組份，TLC檢查合并同類，提取出苦馬豆素0.5g。
第五步苦馬豆素純化階段0.5g苦馬豆素于特制的升華管中抽真空拉干，置油浴，采用分步升華法得到苦馬豆素純品75mg，提取率為0.0015％。
實施例2黃花棘豆中苦馬豆素的提取第一步浸膏提取階段黃花棘豆干草粉11.5kg，用70升工業(yè)甲醇冷浸提取6次，每次冷浸7天，過濾，合并甲醇液，減壓回收甲醇得到總浸膏1600g，出膏率為13.9％。
第二步粗生物堿提取階段1600g總浸膏用16000mL1N鹽酸反復(fù)多次研溶，過濾，直到最后一次酸水液改良碘化鉍鉀檢查呈陰性反應(yīng)為止，合并酸水液。所得酸水液用濃氨水調(diào)pH至4-5，通過氫型陽離子交換樹脂柱，先用上樣量的100倍量無離子水洗脫至無色，再用20倍量1N氨水洗脫，收集堿性流出液，減壓回收溶劑得127g生物堿粗品，出堿率為1.1％。
第三步苦馬豆素粗品提取階段127g生物堿粗品先用分析純甲醇溶解，過濾，回收溶劑，浸膏再用堿性氯仿抽提，直到抽提液檢不出苦馬豆素為止，合并抽提液，減壓回收氯仿提取出苦馬豆素粗品5g，提取率為0.0043％。
第四步苦馬豆素提取階段g苦馬豆素粗品與等量的柱層析用硅膠拌樣，干法上樣，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脫，每30mL收集1份，共收集400組份，TLC檢查合并同類，提取出苦馬豆素0.58g。
第五步苦馬豆素純化階段0.58g苦馬豆素于特制的升華管中抽真空拉干，置油浴，采用分步升華法得到苦馬豆素純品105mg，提取率為0.0009％。
實施例3甘肅棘豆中苦馬豆素的提取第一步浸膏提取階段甘肅棘豆干草粉20kg，用100升工業(yè)甲醇冷浸提取4次，每次冷浸5天，過濾，合并甲醇液，減壓回收甲醇得到總浸膏2230g，出膏率為11.2％。
第二步粗生物堿提取階段2230g總浸膏用15000mL1N鹽酸反復(fù)多次研溶，過濾，直到最后一次酸水液改良碘化鉍鉀檢查呈陰性反應(yīng)為止，合并酸水液。所得酸水液用濃氨水調(diào)pH至4-5，通過氫型陽離子交換樹脂柱，先用上樣量的100倍量無離子水洗脫至無色，再用30倍量1N氨水洗脫，收集堿性流出液，減壓回收溶劑得219.1g生物堿粗品，出堿率為1.095％。
第三步苦馬豆素粗品提取階段219.1g生物堿粗品先用分析純甲醇溶解，過濾，回收溶劑，得浸膏155.4g，再用堿性氯仿抽提，直到抽提液檢不出苦馬豆素為止，合并抽提液，減壓回收氯仿提取出苦馬豆素粗品15g，提取率為0.075％。
第四步苦馬豆素提取階段15g苦馬豆素粗品與等量的柱層析用硅膠拌樣，干法上樣，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脫，每50mL收集1份，共收集350組份，TLC檢查合并同類，提取出苦馬豆素2.1g。
第五步苦馬豆素純化階段2.1g苦馬豆素于特制的升華管中抽真空拉干，置油浴，采用分步升華法得到苦馬豆素純品236mg，提取率為0.0012％。
實施例4變異黃芪中苦馬豆素的提取第一步浸膏提取階段變異黃芪干草粉2kg，用10升工業(yè)甲醇冷浸提取6次，每次冷浸7天，過濾，合并甲醇液，減壓回收甲醇得到總浸膏219g，出膏率為10.95％。
第二步粗生物堿提取階段219g總浸膏用2500mL1N鹽酸反復(fù)多次研溶，過濾，直到最后一次酸水液改良碘化鉍鉀檢查呈陰性反應(yīng)為止，合并酸水液。所得酸水液用濃氨水調(diào)pH至4-5，通過氫型陽離子交換樹脂柱，先用上樣量的100倍量無離子水洗脫至無色，再用30倍量1N氨水洗脫，收集堿性流出液，減壓回收溶劑得22.797g生物堿粗品，出堿率為1.14％。
第三步苦馬豆素粗品提取階段22.797g生物堿粗品先用分析純甲醇溶解，過濾，回收溶劑，浸膏再用堿性氯仿抽提，直到抽提液檢不出苦馬豆素為止，合并抽提液，減壓回收氯仿提取出苦馬豆素粗品2.6g，提取率為0.13％。
第四步苦馬豆素提取階段2.6g苦馬豆素粗品與等量的柱層析用硅膠拌樣，干法上樣，氯仿—甲醇—氨水—水(70∶26∶2∶2)洗脫，每10mL收集1份，共收集200組份，TLC檢查合并同類，提取出苦馬豆素0.3g。
第五步苦馬豆素純化階段將0.3g苦馬豆素置于特制的升華管中，抽真空拉干，采用分步升華法得到苦馬豆素純品35mg，提取率為0.0018％。
本發(fā)明所產(chǎn)生的效果是1.苦馬豆素提取率我國瘋草類植物有44種，分布面積超過400萬公頃，由于其生長的生態(tài)環(huán)境不同，使得不同種瘋草類植物所含的苦馬豆素量也有差異。采用本發(fā)明技術(shù)對以下瘋草中苦馬豆素進行了提取，提取結(jié)果見表1。
表1 我國主要瘋草類植物中苦馬豆素提取結(jié)果出膏率 出堿率苦馬豆素提取率植物名稱采樣部位(％) (％) (％)甘肅棘豆(青海) 地上全草 13.6 1.3 0.0015黃花棘豆(寧夏) 地上全草 13.9 1.1 0.0009毛瓣棘豆(西藏) 地上全草 8.95 0.78 0.0008寬苞棘豆(青海) 地上全草 9.95 0.7 0.0012地上全草12.6 0.95 0.007急彎棘豆(青海)冰川棘豆(西藏) 地上全草 8.96 0.85 0.0007莖直黃芪(西藏) 地上全草 10.2 1.0 0.0006變異黃芪(寧夏) 地上全草 10.95 1.14 0.00182.苦馬豆素技術(shù)指標表2列出了本發(fā)明提取的苦馬豆素的技術(shù)性能指標。
苦馬豆素白色針狀結(jié)晶，分子量為173，熔點144～145℃，純度≥98％。UV、IR、GC、MS、NMR光譜數(shù)據(jù)與苦馬豆素標準光譜數(shù)據(jù)完全吻合。
苦馬豆素UV光譜數(shù)據(jù)UVλmax289(log4.67)，249(log3.83)(參見圖2)。
苦馬豆素IR光譜數(shù)據(jù)IRmax(KBr)cm-13431，3370(-OH)，2946，2806(CH)，2806～2725(Bohlman band)，1074(C-O)等吸收峰(參見圖3)。
苦馬豆素GC光譜數(shù)據(jù)苦馬豆素分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，與單糖結(jié)構(gòu)相似，因此GC直接進樣不出峰，所以要進行GC分析必須首先制備成硅醚衍生物?？囫R豆素用100μl吡啶溶解，用100μl BSTFA室溫處理30min，形成TMS衍生物。在0.32mm×30m SE-30毛細管柱(具注入柱)進行氣相色譜。柱溫從120℃逐漸升高至300℃，5℃/min，13.77min出峰。
苦馬豆素MS光譜數(shù)據(jù)EIMSm/e173(M+)，155(M-H2O)，138(M-H2O-OH)，116，115，96，84，72，43(母核裂解碎片峰)(參見圖4)。
3.本發(fā)明的提純工藝提取成本低，產(chǎn)品純度高，且苦馬豆素提取率明顯優(yōu)于國外技術(shù)。
表2苦馬豆素的技術(shù)性能指標
權(quán)利要求
1.一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝，其特征在于，根據(jù)苦馬豆素的基本理化特性，首先采用陽離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經(jīng)硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘋草中苦馬豆素的提純工藝，其特征在于，其具體提純工藝按以下步驟進行第一步植物樣品(瘋草草粉)中有機總成分提取稱取一定量的瘋草草粉，用(5-10)倍量工業(yè)甲醇反復(fù)冷浸提取4次-6次，每次冷浸7天，過濾，合并甲醇液，減壓回收甲醇得浸膏；第二步生物堿粗品提取將回收甲醇所得的浸膏，用(10-50)倍(重量/體積)量1N鹽酸反復(fù)多次溶解，過濾，直到最后一次酸水液生物堿檢查陰性為止；合并濾液，用濃氨水調(diào)pH4-pH5，通過氫型陽離子交換樹脂柱，先用無離子水洗脫到流出液為無色，再用1N氨水洗脫，收集堿性洗脫液，回收溶劑，抽干得生物堿粗品；第三步苦馬豆素粗品提取將第二步得到的生物堿粗品，先用分析純甲醇溶解，過濾，殘渣棄取，甲醇液減壓回收溶劑，所得浸膏再用堿性氯仿抽提，合并氯仿液，最后回收氯仿得苦馬豆素粗品；第四步苦馬豆素分離采用硅膠柱層析，干法上樣，氯仿—甲醇—氨水—水梯度洗脫，TLC檢測，合并苦馬豆素部分，減壓抽干，得淺黃色粉末樣苦馬豆素；第五步苦馬豆素純化將第四步得到的淺黃色粉末樣苦馬豆素，采用分步升華法獲得苦馬豆素純品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝。瘋草是豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的總稱，是世界范圍內(nèi)危害草原畜牧業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展最嚴重的毒草。在我國瘋草有44種，主要分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏、陜西、四川等省區(qū)，分布面積超過400萬公頃。本發(fā)明以我國西北草原上豐富的瘋草類植物——黃花棘豆、甘肅棘豆、小花棘豆、莖直黃芪、變異黃芪等為材料，根據(jù)苦馬豆素的基本理化特性，采用陽離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經(jīng)硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品；本發(fā)明的提純工藝分五步完成，提取成本低，產(chǎn)品純度高，且苦馬豆素提取率明顯優(yōu)于國外技術(shù)。
文檔編號C07D311/58GK1396161SQ02114590
公開日2003年2月12日 申請日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日
發(fā)明者曹光榮, 童德文, 趙寶玉, 葛鵬斌 申請人:楊凌大農(nóng)生物技術(shù)有限公司