專利名稱：一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種應(yīng)用逆流色譜法分離苦馬豆素的方法。
背景技術(shù)：
苦馬 豆素(Swainsonine, Sff)是一種大極性的卩引哚里西唳類生物堿,研究表明，苦馬豆素不但具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，還能夠刺激機(jī)體骨髓細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力(路浩，等.苦馬豆素抗腫瘤作用研究進(jìn)展，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(9):87-90)。所以近年來(lái)苦馬豆素作為一種嶄新的抗癌藥物得到了國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注，在國(guó)外，對(duì)苦馬豆素的研究已經(jīng)進(jìn)入治療腫瘤的臨床研究階段，而國(guó)內(nèi)對(duì)其抗腫瘤活性的研究尚處于起步階段。由于苦馬豆素所具有的特殊的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)的雙向作用，使其具有潛在的抗腫瘤藥用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，因此目前對(duì)苦馬豆素提取分離方法的研究也日趨活躍。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前用于苦馬豆素分離的方法主要為硅膠柱層析法。但柱層析方法分離時(shí)間長(zhǎng)，樣品有不可逆吸附，回收率低，分離效果差等不足。高速逆流色譜技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種基于液-液分配色譜的分離新技術(shù)。由于它沒(méi)有固體載體，所以避免了樣品中目標(biāo)化合物在固體載體上的不可逆吸附，樣品回收率高，同時(shí)還具有操作簡(jiǎn)便，分離量大，分離效率高以及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，便于工業(yè)化放大生產(chǎn)，已被廣泛用于生物、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、環(huán)境等各個(gè)領(lǐng)域中的分離與制備中。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苦馬豆素的不同提取純化方法進(jìn)行了有益的探索，中國(guó)專利200710017844.7 (—種從瘋草中提取苦馬豆素的新方法)公開(kāi)了一種從瘋草中提取分離苦馬豆素的方法，即用溶劑反復(fù)萃取后得到苦馬豆素粗品，然后用甲醇溶解揮干后升華得到苦馬豆素單體化合物。專利200710017542.X(連續(xù)柱層析法提純苦馬豆素的工藝)公開(kāi)了一種應(yīng)用連續(xù)柱層析法提取苦馬豆素的工藝。中國(guó)專利02114590.3(瘋草中苦馬豆素的提純工藝)公開(kāi)了一種瘋草中苦馬豆素的提純工藝，首先采用陽(yáng)離子交換法提取出大極性生物堿粗品，再用堿性氯仿抽提，抽提部分經(jīng)硅膠柱層析分離得到苦馬豆素粗品，最后分步升華獲得苦馬豆素純品。中國(guó)專利200610043120.5(綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝)公開(kāi)了一種綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝，即通過(guò)生物發(fā)酵工程培養(yǎng)，獲得含苦馬豆素較高的菌絲體和發(fā)酵液，采用超聲提取、溶劑萃取、薄層色譜、DlOl樹(shù)脂、硅膠柱層析及梯度升華等技術(shù)，從菌絲體和發(fā)酵液中分離提純得到苦馬豆素單體化合物?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中未見(jiàn)有應(yīng)用逆流色譜法分離苦馬豆素單體化合物的報(bào)道，因此本發(fā)明公開(kāi)一種應(yīng)用逆流色譜技術(shù)分離甘肅棘豆總生物堿提取物中苦馬豆素單體化合物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用逆流色譜技術(shù)分離高純度苦馬豆素的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
原料:甘肅棘豆總生物堿。所述的甘肅棘豆總生物堿，系參考專利從甘肅棘豆中提取總生物堿提取物的制備工藝(申請(qǐng)?zhí)?200910117752.5)獲得。分離設(shè)備:逆流色譜儀。所述的分離設(shè)備逆流色譜儀，根據(jù)所需目標(biāo)分離量的不同，可以選擇分析型、半制備型和制備型逆流色譜儀。逆流色譜法苦馬豆素單體的方法，以甲基叔丁基醚、正丁醇以及水混合后靜置分層，構(gòu)成逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系；將固定相以較大流速泵入逆流色譜儀分離柱中；待柱中充滿固定相后，開(kāi)機(jī)，使逆流色譜儀主機(jī)以設(shè)定轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)，然后以一定流速將流動(dòng)相泵入分離柱中；待兩相在分離柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥進(jìn)樣；自動(dòng)餾分收集器收集餾分；用薄板層析和高效液相色譜檢測(cè)，將含有苦馬豆素成分的餾分合并后回收溶齊U，重結(jié)晶得到苦馬豆素。一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法，其特征在于該方法步驟如下:A分離溶劑系統(tǒng)的選擇由甲基叔丁基醚、正丁醇以及水組成的溶劑體系混合，振搖后靜置分層，將上、下相分開(kāi)；B將兩相溶劑系統(tǒng)的一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相；首先將固定相充滿逆流色譜儀的分離柱，然后開(kāi)動(dòng)逆流色譜儀主機(jī)，達(dá)到設(shè)定轉(zhuǎn)速后，向其中泵入流動(dòng)相，待兩相在分離柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥將甘肅棘豆總生物堿注入，自動(dòng)餾分收集器接受懼分；C將收集的餾分通過(guò)薄板層析和高效液相色譜檢測(cè)，合并含有苦馬豆素的餾分，回收溶劑后重結(jié)晶，得到苦馬豆素。本發(fā)明分離得到的苦馬豆素為白色晶體，純度> 90%。在A步驟中，所用的溶劑體系是指以甲基叔丁基醚、正丁醇和水按照任意體積比混合。在A步驟中，所用溶劑體系的pH值為7-14。在B步驟中，可以以溶劑體系中的上相為固定相，下相為流動(dòng)相；也可以以溶劑體系中下相為固定相，上相為流動(dòng)相。在B步驟中，逆流色譜儀可以采用正轉(zhuǎn)模式，也可以采用反轉(zhuǎn)模式。在C步驟中，樣品檢測(cè)可以采用逆流色譜儀自帶檢測(cè)器，也可以使用高效液相色譜，薄板層析或其他檢測(cè)手段檢測(cè)。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為分離成本低，制備過(guò)程安全，并且分離過(guò)程能夠連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，苦馬豆素產(chǎn)品純度可以達(dá)到90%以上。與柱層析等方法比較，它不使用固態(tài)的載體，因此不存在固體載體造成的樣品不可逆吸附和損耗，分離效率高，整個(gè)分離工藝適合于工業(yè)化生產(chǎn)，能夠最大限度的利用原料，降低生產(chǎn)成本，是一種高效快捷的從甘肅棘豆總生物堿提取物中分離苦馬豆素的方法。


圖1為甘肅棘豆總生物堿提取物品高效液相色譜圖，從圖中可以看出，總生物堿提取物中除了含有苦馬豆素外還含有大量其他雜質(zhì)化合物。
圖2為逆流色譜分離苦馬豆素單體高效液相色譜圖，從圖中可以看出，分離得到的苦馬豆素產(chǎn)品純度能到90%以上。
具體實(shí)施例方式下面是本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明包括但不僅限于實(shí)施例。實(shí)施例1:高速逆流色譜法分離甘肅棘豆總生物堿提取物中的苦馬豆素單體。1.樣品:甘肅棘豆總生物堿，參考專利從甘肅棘豆中提取總生物堿提取物的制備工藝(申請(qǐng)?zhí)?200910117752.5)從甘肅棘豆中提取得到。2.儀器:TBE-300B逆流色譜儀，中國(guó)上海同田生物技術(shù)有限公司。3.制備方法:將甲基叔丁基醚:正丁醇:水按照1: 3: 4(v: V)的比例充分混合均勻，滴加氨水調(diào)整PH在9 10后放置在分液漏斗中靜置分層。將上、下相分別放出后超聲20min脫氣，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相。首先將固定相泵入逆流色譜儀螺旋管中，流速20mL/min，·待螺旋管完全充滿固定相后，開(kāi)啟逆流色譜儀主機(jī)，緩慢調(diào)整螺旋管轉(zhuǎn)速至900r/min,同時(shí)以lmL/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)螺旋管尾端流出流動(dòng)相，系統(tǒng)達(dá)到平衡，將400mg前述甘肅棘豆總生物堿樣品溶解在20mL上、下相的混合溶液中，通過(guò)進(jìn)樣閥注入螺旋管中，設(shè)置恒溫水浴為25°C，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，自動(dòng)餾分收集器接樣，4mL為一份，HPLC檢測(cè)，合并含有苦馬豆素的餾分，減壓濃縮合并得到苦馬豆素提取物。將苦馬豆素提取物用氯仿-甲醇重結(jié)晶得到白色晶體，經(jīng)過(guò)核磁共振、質(zhì)譜鑒定即為苦馬豆素，測(cè)定純度彡90%。實(shí)施例2:1.樣品:甘肅棘豆總生物堿，參考專利從甘肅棘豆中提取總生物堿提取物的制備工藝(申請(qǐng)?zhí)?200910117752.5)從甘肅棘豆中提取得到。2.儀器:DE HPCCC Spectrum逆流色譜儀,英國(guó)DE公司。3.制備方法:甲基叔丁基醚:正丁醇:水按照1: 3: 4(v: V)的比例充分混合均勻，向其中滴加氨水調(diào)整PH在9 10后放置在分液漏斗中靜置過(guò)夜。將上、下相分別放出后超聲20min脫氣，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相。首先將固定相泵入逆流色譜儀螺旋管中，流速6mL/min，待螺旋管完全充滿固定相后，開(kāi)啟逆流色譜儀主機(jī)，緩慢調(diào)整螺旋管轉(zhuǎn)速至1500r/min,同時(shí)以6mL/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡，將150mg前述甘肅棘豆總生物堿樣品溶解在6mL上、下相的混合溶液中，通過(guò)進(jìn)樣閥注入螺旋管中，設(shè)置儀器溫度為30V。自動(dòng)餾分收集器接樣，ImL為一份，經(jīng)HPLC檢測(cè)，合并含有苦馬豆素的餾分，減壓濃縮后得到苦馬豆素提取物，將苦馬豆素提取物用氯仿-甲醇重結(jié)晶得到白色晶體。經(jīng)過(guò)核磁共振、質(zhì)譜鑒定即為苦馬豆素，測(cè)定純度> 90%。
權(quán)利要求
1.一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法，其特征在于該方法步驟如下: A分離溶劑系統(tǒng)的選擇由甲基叔丁基醚、正丁醇以及水組成的溶劑體系混合，振搖后靜置分層，將上、下相分開(kāi)； B將兩相溶劑系統(tǒng)的一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相；首先將固定相充滿逆流色譜儀的分離柱，然后開(kāi)動(dòng)逆流色譜儀主機(jī)，達(dá)到設(shè)定轉(zhuǎn)速后，向其中泵入流動(dòng)相，待兩相在分離柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥將甘肅棘豆總生物堿注入，自動(dòng)餾分收集器接受餾分； C將收集的餾分通過(guò)薄板層析和高效液相色譜檢測(cè)，合并含有苦馬豆素的餾分，回收溶劑后重結(jié)晶，得到苦馬豆素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:A步驟中所用的溶劑體系是指以甲基叔丁基醚、正丁醇和水按照任意體積比混合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:A步驟中所用溶劑體系的pH值為7-14。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:B步驟中可以以溶劑體系中的上相為固定相，下相為流動(dòng)相；也可以以溶劑體系中下相為固定相，上相為流動(dòng)相。
5.如權(quán)利要 求1所述的方法，其特征在于:B步驟中逆流色譜儀可以采用正轉(zhuǎn)模式，也可以采用反轉(zhuǎn)模式。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:C步驟中樣品檢測(cè)可以采用逆流色譜儀自帶檢測(cè)器，也可以使用高效液相色譜，薄板層析或其他檢測(cè)手段檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種逆流色譜法分離苦馬豆素的方法。本發(fā)明以甲基叔丁基醚、正丁醇以及水混合后靜置分層，構(gòu)成逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系；將固定相以較大流速泵入逆流色譜儀分離柱中；待柱中充滿固定相后，開(kāi)機(jī)，使逆流色譜儀主機(jī)以設(shè)定轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)，然后以一定流速將流動(dòng)相泵入分離柱中；待兩相在分離柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥進(jìn)樣；自動(dòng)餾分收集器收集餾分；用薄板層析和高效液相色譜檢測(cè)，將含有苦馬豆素成分的餾分合并后回收溶劑，重結(jié)晶得到純度大于90％的苦馬豆素本方法簡(jiǎn)便快捷，分離效果好，制備量大，樣品損失小，分離成本低，產(chǎn)品純度高，整個(gè)分離方法適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D471/04GK103073544SQ20111032730
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者邸多隆, 黃新異, 陳小芬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所