新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑及其制備方法與應(yīng)用，該免疫佐劑是由CpG和PEG對(duì)二硫化鉬納米片層進(jìn)行修飾得到的產(chǎn)物，制備方法包括將二硫化鉬納米片層進(jìn)行超聲處理；然后與CpG和PEG混合，在搖床中溫控孵育；離心去除游離的CpG和PEG而得到。本發(fā)明納米免疫佐劑粒徑小、尺寸均一、比表面積大，具有較強(qiáng)的近紅外區(qū)光熱轉(zhuǎn)換能力，聯(lián)合紅外激光照射可以很大程度上提高免疫激活相關(guān)細(xì)胞因子的分泌水平。此外，本發(fā)明所述的納米免疫佐劑具有較低的細(xì)胞毒性。本發(fā)明具有原料成本低，制備工藝簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于新型納米免疫佐劑的制備領(lǐng)域，涉及一種片層二硫化鉬基納米免疫佐劑及其制備方法與用途，尤其涉及一種CpG修飾的具有較高光熱轉(zhuǎn)換效率的片層二硫化鉬納米免疫佐劑及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫療法作為一種新的治療策略，已發(fā)展成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種腫瘤治療手段，由于其基于機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)和清除功能，通過(guò)激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能殺傷腫瘤細(xì)胞，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，由于大部分重組疫苗免疫原性較差，難以誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答效果，必須添加免疫佐劑來(lái)輔助疫苗發(fā)揮作用。
[0003]鋁鹽是目前FDA批準(zhǔn)的唯一人用無(wú)機(jī)鹽免疫佐劑，廣泛應(yīng)用于乙肝疫苗和甲肝疫苗等商品化疫苗中。但是由于自身的一系列缺點(diǎn)，鋁免疫佐劑目前的研究水平已經(jīng)不能滿足疫苗飛速發(fā)展的需要，因此，新型免疫免疫佐劑的開(kāi)發(fā)就顯得尤為重要。
[0004]相比微米級(jí)顆粒，納米粒子作為疫苗免疫佐劑具有自身的一些優(yōu)勢(shì)，納米粒子具有比表面積大、表面活性中心多、反應(yīng)活性高、吸附和催化能力強(qiáng)，有助于提高免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子分泌水平，而下調(diào)免疫抑制相關(guān)的細(xì)胞因子分泌水平;可作為疫苗輸送載體，提尚抗原被巨■細(xì)胞攝取的能力等。
[0005]納米片層二硫化鉬屬于過(guò)渡金屬二硫化物，其片層結(jié)構(gòu)具有比表面積大的特點(diǎn)，對(duì)抗原或免疫佐劑具有較強(qiáng)的吸附效果，可以介導(dǎo)抗原或免疫佐劑被巨噬細(xì)胞識(shí)別和攝取，而且在近紅外區(qū)有明顯的光熱轉(zhuǎn)換能力，可以促進(jìn)抗原或免疫佐劑在體內(nèi)的釋放，提高疫苗的效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一種新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑具有的特點(diǎn)比表面積大，對(duì)抗原或免疫佐劑具有較強(qiáng)的吸附效果，而且在近紅外區(qū)有明顯的光熱轉(zhuǎn)換能力，可以促進(jìn)抗原或免疫佐劑在體內(nèi)的釋放。
[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，是由CpG(即未甲基化寡聚核苷酸)和PEG(即聚乙二醇)對(duì)二硫化鉬納米片層進(jìn)行修飾得到的產(chǎn)物，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為100-300:1;所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為10-30:1ο
[0008]所述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑粒徑為50-200nm。
[0009]其中，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比可為100:1,200:1,300:1,優(yōu)選為300:1；所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比可為10:1,20:1,30:1,優(yōu)選為30:1。
[0010]作為優(yōu)選，所述PEG的分子量為2000-10000，進(jìn)一步優(yōu)選為5000。
[0011]作為優(yōu)選，所述二硫化鉬納米片層為1-10層。
[0012]優(yōu)選地，所述二硫化鉬納米片層結(jié)構(gòu)通過(guò)使用剝離劑將二硫化鉬液相剝離獲得。優(yōu)選地，所述剝離劑選自正丁基鋰和/或氯化鋰。
[0013]本發(fā)明采用CpG和PEG對(duì)二硫化鉬納米片層進(jìn)行修飾，能夠提升二硫化鉬納米片層在溶液中的穩(wěn)定性，得到分散性和穩(wěn)定性均較好的二硫化鉬片層結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明片層二硫化鉬基納米免疫佐劑提供加入PEG大大提高了材料的穩(wěn)定性、分散性和生物相容性。且該新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑粒徑小、尺寸均一，比表面積大。
[0014]本發(fā)明的目的之二在于提供上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備方法，包括將大尺寸二硫化鉬納米片層結(jié)構(gòu)在冰浴條件下經(jīng)超聲破碎制備尺寸較小的納米片層結(jié)構(gòu)，將超聲后的二硫化鉬片層結(jié)構(gòu)和CpG(即未甲基化寡聚核苷酸)和PEG(即聚乙二醇)在溶液中混合，搖床中溫控孵育后離心去除游離的CpG和PEG，得到粒徑小、尺寸均一、比表面積大的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑。
[0015]具體地，上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備方法，包括以下步驟:
[0016]在冰浴條件下將二硫化鉬納米片層進(jìn)行超聲處理;然后與CpG和PEG混合，在搖床中溫控孵育;離心去除游離的CpG和PEG，即得所述片層二硫化鉬基納米免疫佐劑。
[0017]作為優(yōu)選，所述超聲功率為50-900W，進(jìn)一步優(yōu)選為150-300w，例如150w，200w，300w；
[0018]作為優(yōu)選，所述超聲處理時(shí)間為10分鐘-10小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選30分鐘-1小時(shí)，例如30分鐘、I小時(shí)；
[0019]作為優(yōu)選，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為100-300:1，例如100:1，200:1,300:1,進(jìn)一步優(yōu)選為300:1 ；
[0020]作為優(yōu)選，所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為10-30:1，例如10:1，20:1，30:1，進(jìn)一步優(yōu)選30:1 ；
[0021]作為優(yōu)選，所述PEG的分子量為2000-10000，進(jìn)一步優(yōu)選為5000;
[0022]作為優(yōu)選，所述搖床轉(zhuǎn)速為50-500rpm/min，進(jìn)一步優(yōu)選50-150rpm/min ；更優(yōu)選100rpm/min；
[0023]作為優(yōu)選，所述孵育溫度控制為4_37°C，優(yōu)選為20_25°C ；
[0024]作為優(yōu)選，所述搖床孵育時(shí)間為lh_24h，優(yōu)選10_14h。
[0025]作為優(yōu)選，離心速率為5000-20000rpm/min,優(yōu)選 16000rpm/min。
[0026]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述二硫化鉬納米片層為1-10層的納米片。
[0027]優(yōu)選地，所述二硫化鉬納米片層結(jié)構(gòu)通過(guò)使用剝離劑將二硫化鉬液相剝離獲得。
[0028]更具體地，上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備方法，包括以下步驟:
[0029]在冰浴條件下將液相剝離的1-10層的二硫化鉬納米片層進(jìn)行超聲處理30分鐘-1小時(shí)，所述超聲功率為150-300?;然后與CpG和PEG混合，在搖床中20-25°C溫控孵育1h-14h;離心去除游離的CpG和PEG，即得所述片層二硫化鉬基納米免疫佐劑；
[0030]其中，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為100-300:1，所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為10-30:1。
[0031]本發(fā)明對(duì)于二硫化鉬納米片的制備方法不做具體限定，任何能夠制備得到呈負(fù)電位的二硫化鉬納米片的方法均可用于本發(fā)明。
[0032]作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述二硫化鉬納米片層的制備方法包括以下步驟:
[0033](I)保護(hù)性氣氛下，向二硫化鉬粉末中加入剝離劑分散液，進(jìn)行液相剝離反應(yīng)；
[0034](2)反應(yīng)完畢，向反應(yīng)液中加入溶劑，分層取沉淀；
[0035](3)將步驟(2)所得沉淀分散在一定溶劑中，超聲，離心，取上清液進(jìn)行透析，得到二硫化鉬納米片層水溶液。
[0036]上述二硫化鉬納米片層結(jié)構(gòu)的制備方法，其中:
[0037]優(yōu)選地，所述保護(hù)性氣氛為非氧化氣氛，優(yōu)選氮?dú)鈿夥?、氦氣氣氛、氖氣氣氛或氬氣氣氛中的任意I種或至少2種的組合。
[0038]優(yōu)選地，所述剝離劑選自正丁基鋰和/或氯化鋰。
[0039]所述二硫化鉬和剝離劑的摩爾比優(yōu)選為1:2-10，例如1:2.2、1:2.5、1:2.8、1:3.4、1:3.9、1:4.6、1:5.7、1:6.2、1.7、1:7.6等，進(jìn)一步優(yōu)選為3:8。
[0040]優(yōu)選地，所述剝離劑分散液的分散溶劑選自正己烷、環(huán)己烷、苯等飽和烴溶液中的一種或幾種的混合液;所述混合液例如正己烷和苯的混合液，環(huán)己烷和正己烷的混合液，正己烷、環(huán)己烷和苯的混合液等。
[0041 ] 優(yōu)選地，所述液相剝離反應(yīng)的溫度為4-37 0C，例如22 °C、25 °C、27°C等，優(yōu)選室溫；反應(yīng)時(shí)間1-14411，例如811、1511、3311、7511、9511、12511、14211等，優(yōu)選4811。
[0042]優(yōu)選地，步驟(2)所述溶劑與步驟(I)所述剝離劑分散液互溶。
[0043]優(yōu)選地，步驟(3)所述溶劑選自去離子水、甲醇、乙醇、異丙醇等中的一種或幾種的混合液;所述混合液例如甲醇和乙醇的混合液，乙醇和異丙醇的混合液，水和異丙醇的混合液，甲醇、乙醇和水的混合液等;優(yōu)選去離子水。
[0044]優(yōu)選地，步驟(3)所述透析的分子截留量為14kDa;透析時(shí)間I48h。
[0045]本發(fā)明的目的之三是提供上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑用于制備免疫佐劑的應(yīng)用或用于制備疫苗的應(yīng)用;優(yōu)選地，用于制備具有提高抗原的免疫原性、增強(qiáng)免疫應(yīng)答功能的免疫佐劑的應(yīng)用或用于制備提高抗原的免疫原性、增強(qiáng)免疫應(yīng)答功能的疫苗的應(yīng)用。
[0046]本發(fā)明所述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑即可單獨(dú)用作免疫佐劑，也可與本領(lǐng)域可用的載體或輔料復(fù)配用作免疫佐劑;還可以與本領(lǐng)域可用的疫苗或其他免疫佐劑聯(lián)用。
[0047]本發(fā)明還包括含有上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的疫苗。
[0048]本發(fā)明所述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑對(duì)于提高抗原的免疫原性，增強(qiáng)免疫應(yīng)答具有顯著效果。
[0049]本發(fā)明所述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑聯(lián)合紅外激光照射可顯著提高免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子分泌水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果。
[0050]檢測(cè)上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑功能效果的方法包括:
[0051](I)檢測(cè)不同濃度的上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑經(jīng)激光照射后的光熱轉(zhuǎn)換效率；
[0052](2)對(duì)上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)；
[0053](3)檢測(cè)單獨(dú)上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑及聯(lián)合紅外光照射后上述新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑免疫激活相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平。
[0054]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0055](I)本發(fā)明提供的新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑粒徑小、尺寸均一，比表面積大，負(fù)載佐劑且生物相容性好，對(duì)抗原或免疫佐劑具有較強(qiáng)的吸附效果，可更好地被巨噬細(xì)胞識(shí)別、攝取和釋放，且具有較強(qiáng)的近紅外區(qū)光熱轉(zhuǎn)換能力，聯(lián)合紅外激光照射可顯著提高免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子(TNF-a、IL_12等)的分泌水平，促進(jìn)抗原或免疫佐劑在體內(nèi)的釋放，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果。
[0056](2)本發(fā)明所述的納米免疫佐劑具有較低的細(xì)胞毒性。
[0057](3)本發(fā)明提供的新型片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備方法工藝簡(jiǎn)單易操作，原料成本低，重復(fù)性好，性能穩(wěn)定，設(shè)備要求低；制備得到的復(fù)合材料的雜質(zhì)含量少，產(chǎn)量高。
【附圖說(shuō)明】
[0058]圖1為實(shí)施例1制備得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的透射電鏡(TEM)圖；
[0059]圖2為實(shí)施例1得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的光熱轉(zhuǎn)換測(cè)試結(jié)果；
[0060]圖3為實(shí)施例1得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0061]圖4為實(shí)施例1得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑聯(lián)合紅外激光照射后對(duì)免疫刺激因子分泌水平的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0062]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)買得到的常規(guī)產(chǎn)品。以下實(shí)施例所述PEG的分子量為5000。
[0063]實(shí)施例1
[0064]A.二硫化鉬納米片層的制備
[0065](I)稱取500mg二硫化鉬粉末(99% )置于1mL干燥的圓底燒瓶中，通入氮?dú)?，加?mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基鋰，室溫下反應(yīng)48h;
[0066](2)反應(yīng)結(jié)束后，加入己烷，稀釋反應(yīng)溶液，離心1min;用己烷分散下層沉淀，反復(fù)離心2次；
[0067](3)取下層沉淀分散在水溶液中，超聲至無(wú)氣泡產(chǎn)生;離心lOmin，去掉下層，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片層10以下的二硫化鉬納米片水溶液。
[0068]B.粒徑小，尺寸均一的二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備
[0069](I)將A步驟制備的二硫化鉬納米片層在冰浴條件下超聲操作，超聲功率200W，超聲時(shí)間30分鐘；
[0070](2)將超聲制備的粒徑小、尺寸均一的納米片層與CpG和PEG混合，其中所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為300:1，所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1;在搖床(轉(zhuǎn)速100rpm/min)中25°C溫控孵育；
[0071 ] (3) 16000rpm/min離心去除游離的CpG以及PEG，得到粒徑分布尺寸為50_200nm的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑。
[0072]C.二硫化鉬基納米免疫佐劑的光熱轉(zhuǎn)換效率(升溫曲線)評(píng)價(jià)
[0073]將上述步驟B制得的不同濃度的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑(Oug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，300ug/ml和400ug/ml)500ul置于小皿中，采用808nm紅外激光進(jìn)行照射，能量密度2w/cm2，每隔30秒進(jìn)行測(cè)溫，連續(xù)檢測(cè)10分鐘。
[0074]D.二硫化鉬基納米免疫佐劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
[0075](I)配制10yL RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)懸液在96孔板中(每孔1.5 X 14個(gè)細(xì)胞)，并使其貼壁。
[0076](2)向96孔板中加入上述步驟B制得的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，使其終濃度梯度為5、10、20、30、40、50yg/mL。
[0077](3)將96孔板在培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。
[0078](4)在每孔加入體積為1yL的CCK-8(Cell Counting KU，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒)溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)中孵育2小時(shí)。
[0079](5)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。
[0080](6)計(jì)算細(xì)胞增殖活力。
[0081]E.檢測(cè)二硫化鉬基納米免疫佐劑聯(lián)合紅外激光照射后免疫激活相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平
[0082]步驟:將RAW 264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)以I X 16個(gè)細(xì)胞/孔種入6孔板中，每孔加2mL DMEM(即Dulbecco Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入上述步驟B制得的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，二硫化鉬基納米免疫佐劑的終濃度為12.5yg/mL。于37 °C、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。收集得到的細(xì)胞上清，離心去除雜質(zhì)。所得到的細(xì)胞上清采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)試劑盒(Life科技公司)進(jìn)行檢測(cè)。
[0083]實(shí)施例2
[0084]A.二硫化鉬納米片層的制備
[0085](I)稱取500mg二硫化鉬粉末(99% )置于1mL干燥的圓底燒瓶中，通入氮?dú)?，加?mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基鋰，室溫下反應(yīng)48h;
[0086](2)反應(yīng)結(jié)束后，加入己烷，稀釋反應(yīng)溶液，離心1min;用己烷分散下層沉淀，反復(fù)離心2次；
[0087](3)取下層沉淀分散在水溶液中，超聲至無(wú)氣泡產(chǎn)生;離心lOmin，去掉下層，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片層10以下的二硫化鉬納米片水溶液。
[0088]B.粒徑小，尺寸均一的二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備
[0089](I)將A步驟制備的二硫化鉬納米片層在冰浴條件下超聲操作，超聲功率200W，超聲時(shí)間I小時(shí)；
[0090](2)將超聲制備的粒徑小、尺寸均一的納米片層與CpG和PEG混合，其中所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為300:1，所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1;在搖床(轉(zhuǎn)速100rpm/min)中25°C溫控孵育；
[0091](3)16000rpm/min離心去除游離的CpG以及PEG，得到片層二硫化鉬基納米免疫佐劑。粒徑分布尺寸為50-200nm。
[0092]C.二硫化鉬基納米免疫佐劑的光熱轉(zhuǎn)換效率(升溫曲線)評(píng)價(jià)
[0093]將上述步驟B制得的不同濃度的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑(0ug/ml，50ug/ml，lOOug/ml，200ug/ml，300ug/ml和400ug/ml)500ul置于小皿中，采用808nm紅外激光進(jìn)行照射，能量密度2w/cm2，每隔30秒進(jìn)行測(cè)溫，連續(xù)檢測(cè)10分鐘。
[0094]D.二硫化鉬基納米免疫佐劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
[0095](I)配制10yL細(xì)胞懸液RAW 264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)在96孔板中(每孔1.5 X 14個(gè)細(xì)胞)，并使其貼壁。
[0096](2)向96孔板中加入上述步驟B制得的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，使其終濃度梯度為5、10、20、30、40、50yg/mL。
[0097](3)將96孔板在培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。
[0098](4)在每孔加入體積為1yL的CCK-8(Cell Counting KU，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒)溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)中孵育2小時(shí)。
[0099](5)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。
[0100](6)計(jì)算細(xì)胞增殖活力。
[0101]E.檢測(cè)二硫化鉬基納米免疫佐劑聯(lián)合紅外激光照射后免疫激活相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平
[0102]步驟:將RAW 264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)以I X 16個(gè)細(xì)胞/孔種入6孔板中，每孔加2mL DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入上述步驟B制得的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，二硫化鉬基納米免疫佐劑的終濃度為12.5μg/mL。于37 °C、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。收集得到的細(xì)胞上清，離心去除雜質(zhì)。所得到的細(xì)胞上清采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)試劑盒(Life科技公司)進(jìn)行檢測(cè)。
[0103]實(shí)施例3
[0104]A.二硫化鉬納米片層的制備
[0?05] (I)稱取500mg二硫化鉬粉末(99% )置于1mL干燥的圓底燒瓶中，通入氮?dú)?，加?mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基鋰，室溫下反應(yīng)48h;
[0106](2)反應(yīng)結(jié)束后，加入己烷，稀釋反應(yīng)溶液，離心lOmin;用己烷分散下層沉淀，反復(fù)離心2次；
[0107](3)取下層沉淀分散在水溶液中，超聲至無(wú)氣泡產(chǎn)生;離心lOmin，去掉下層，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片層10以下的二硫化鉬納米片水溶液。
[0108]B.粒徑小，尺寸均一的二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備
[0109](I)將A步驟制備的二硫化鉬納米片層在冰浴條件下超聲操作，超聲功率150W，超聲時(shí)間I小時(shí)；
[0110](2)將超聲制備的粒徑小、尺寸均一的納米片層與CpG和PEG混合，其中所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為300:1，所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1;在搖床(轉(zhuǎn)速100rpm/min)中25°C溫控孵育；
[O111 ] (3)16000rpm/min離心去除游離的CpG以及PEG，得到片層二硫化鉬基納米免疫佐劑。粒徑分布尺寸為50-200nm。
[0112]C.二硫化鉬基納米免疫佐劑的光熱轉(zhuǎn)換效率(升溫曲線)評(píng)價(jià)
[0113]方法同實(shí)施例1。
[0114]D.二硫化鉬基納米免疫佐劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
[0115]方法同實(shí)施例1。
[0116]E.檢測(cè)二硫化鉬基納米免疫佐劑聯(lián)合紅外激光照射后免疫激活相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平
[0117]方法同實(shí)施例1。
[0118]實(shí)施例4
[0119]A.二硫化鉬納米片層的制備
[0120](I)稱取500mg二硫化鉬粉末(99% )置于1mL干燥的圓底燒瓶中，通入氮?dú)?，加?mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基鋰，室溫下反應(yīng)48h;
[0121](2)反應(yīng)結(jié)束后，加入己烷，稀釋反應(yīng)溶液，離心lOmin;用己烷分散下層沉淀，反復(fù)離心2次；
[0122](3)取下層沉淀分散在水溶液中，超聲至無(wú)氣泡產(chǎn)生;離心lOmin，去掉下層，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片層10以下的二硫化鉬納米片水溶液。
[0123]B.粒徑小，尺寸均一的二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備
[0124](I)將A步驟制備的二硫化鉬納米片層在冰浴條件下超聲操作，超聲功率150W，超聲時(shí)間I小時(shí)；
[0125](2)將超聲制備的粒徑小、尺寸均一的納米片層與CpG和PEG混合，其中所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為100:1，所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1;在搖床(轉(zhuǎn)速100rpm/min)中25°C溫控孵育；
[ΟΙ26] (3)16000rpm/min離心去除游離的CpG以及PEG，得到片層二硫化鉬基納米免疫佐劑。粒徑分布尺寸為50-200nm。
[0127]C.二硫化鉬基納米免疫佐劑的光熱轉(zhuǎn)換效率(升溫曲線)評(píng)價(jià)
[0128]方法同實(shí)施例1。
[0129]D.二硫化鉬基納米免疫佐劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
[0130]方法同實(shí)施例1。
[0131]E.檢測(cè)二硫化鉬基納米免疫佐劑聯(lián)合紅外激光照射后免疫激活相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平
[0132]方法同實(shí)施例1。
[0133]對(duì)比例I
[0134]MOS2-PEG，其制備方法包括:將實(shí)施例1步驟A相同的方法制備的二硫化鉬納米片層在冰浴條件下超聲操作，超聲功率200W，超聲時(shí)間30分鐘;然后與PEG混合，其中所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1;在搖床(轉(zhuǎn)速100rpm/min)中25°C溫控孵育；16000rpm/min離心去除游離的PEG，即得。
[0135]結(jié)構(gòu)表征:
[0136]圖1為實(shí)施例1制備得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的TEM圖。圖1中二硫化鉬片層結(jié)構(gòu)清晰，邊緣明顯，粒徑大小在50-100nm，尺寸均一，分散性很好。
[0137]性能測(cè)試:
[0138](I)圖2為實(shí)施例1得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的光熱轉(zhuǎn)換效率測(cè)試結(jié)果;從圖2中可以看出，相比于水組分來(lái)說(shuō)，隨著時(shí)間的增加，不同濃度的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的溶液溫度均有一定程度的升高，具有濃度依賴性，其中400yg/ml的樣品的升溫幅度在18°C。表明二硫化鉬片層結(jié)構(gòu)具有較好的光熱轉(zhuǎn)換能力。
[0139](2)將實(shí)施例1得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑(S卩M0S2-CpG-PEG)進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)(圖3)。結(jié)果表明，不同濃度的片層二硫化鉬納米免疫佐劑與小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW 264.7共孵育48小時(shí)后，細(xì)胞活性沒(méi)有明顯降低。說(shuō)明在目前所使用的濃度劑量下(最大劑量50yg/mL) 二硫化鉬納米免疫佐劑對(duì)細(xì)胞成活率影響很小。
[0140](3)將實(shí)施例1得到的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑(S卩M0S2-CpG-PEG)聯(lián)合紅外激光考察對(duì)免疫激活細(xì)胞因子TNF-α分泌水平的影響。
[0141]同時(shí)考察單純CpG，單純PEG，單純MoS2、MoS2-PEG(即對(duì)比例I)和MoS2-CpG-PEG刺激產(chǎn)生TNF-a的能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，單純PEG，單純MoS2和MoS2-PEG刺激產(chǎn)生的TNF-a維持在低水平，聯(lián)合紅外激光后也沒(méi)有明顯變化;單純CpG誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-a的能力有了明顯提升，但是聯(lián)合紅外激光效果并不明顯；而M0S2-CpG-PEG本身較其他幾個(gè)組分均有顯著的提升，聯(lián)合紅外激光后進(jìn)一步提高了 TNF-a的分泌水平。圖4中對(duì)照是指蒸餾水。
[0142]實(shí)施例2-4制備的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑作用效果與實(shí)施例1相當(dāng)。
[0143]
【申請(qǐng)人】聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，是由CpG和PEG對(duì)二硫化鉬納米片層進(jìn)行修飾得到的產(chǎn)物，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為100-300:1;所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為10-30:1。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，其特征在于，其粒徑為50-200nmo3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，其特征在于，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為300:1;所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑，其特征在于，所述二硫化鉬納米片層為通過(guò)使用剝離劑將二硫化鉬液相剝離獲得;優(yōu)選地，所述剝離劑選自正丁基鋰和/或氯化鋰;和/或，所述二硫化鉬納米片層為1-10層。5.—種片層二硫化鉬基納米免疫佐劑的制備方法，包括以下步驟:在冰浴條件下將二硫化鉬納米片層進(jìn)行超聲處理;然后與CpG和PEG混合，在搖床中溫控孵育；離心去除游離的CpG和PEG，即得。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述超聲功率為50-900W，處理時(shí)間為10分鐘-10小時(shí);所述搖床轉(zhuǎn)速為50-500rpm/min，所述孵育溫度為4-37°C，孵育時(shí)間為Ih-24h； 優(yōu)選地，所述超聲功率為150-300w，處理時(shí)間為30分鐘-1小時(shí)；所述搖床轉(zhuǎn)速為50-150rpm/min;所述孵育溫度為20-25°C，孵育時(shí)間為10-14h。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為100-300:1;所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為10-30:1;所述PEG的分子量為2000-10000； 優(yōu)選地，所述二硫化鉬納米片層與CpG的摩爾比為300:1;所述二硫化鉬納米片層與PEG的摩爾比為30:1;所述PEG的分子量為5000;和/或，所述二硫化鉬納米片層為1_10層。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述二硫化鉬納米的制備方法包括以下步驟: (1)保護(hù)性氣氛下，向二硫化鉬粉末中加入剝離劑分散液，進(jìn)行液相剝離反應(yīng)； (2)反應(yīng)完畢，向反應(yīng)液中加入溶劑，分層取沉淀； (3)將步驟(2)所得沉淀分散在一定溶劑中，超聲，離心，取上清液進(jìn)行透析，得到二硫化鉬納米片層水溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述剝離劑選自正丁基鋰和/或氯化鋰;所述二硫化鉬和剝離劑的摩爾比為I: 2-10，優(yōu)選為3:8 ； 所述剝離劑分散液的分散溶劑選自正己烷、環(huán)己烷、苯中的一種或幾種的混合液； 所述液相剝離反應(yīng)的溫度為4-37°C，反應(yīng)時(shí)間l_144h; 步驟(2)所述溶劑與步驟(I)所述剝離劑分散液互溶； 步驟(3)所述溶劑選自去離子水、甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或幾種的混合液； 步驟(3)所述透析的分子截留量為14kDa;透析時(shí)間之48h010.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑或權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述方法制備的片層二硫化鉬基納米免疫佐劑用于制備免疫佐劑的應(yīng)用或用于制備疫苗的應(yīng)用;優(yōu)選地，用于制備具有提高抗原的免疫原性、增強(qiáng)免疫應(yīng)答功能的免疫佐劑的應(yīng)用或用于制備具有提高抗原的免疫原性、增強(qiáng)免疫應(yīng)答功能的疫苗的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK105833265SQ201610249084
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】韓秋森, 楊蓉, 王新環(huán), 王琛
【申請(qǐng)人】國(guó)家納米科學(xué)中心