=7.0,加入四腔室水浴槽中，一般組織溫度在37Π (1Χ骨骼 肌調(diào)節(jié)溫度為25 °C，其中通過95 %氧氣-5 %二氧化碳，30min以上。
[0143] 分離完整的趾長伸肌(EDL)，骨骼肌組織分離的完整與否對實(shí)驗(yàn)最后的結(jié)果影響 很大。將完整分離的EDL固定在兩個(gè)電極之間（這個(gè)步驟在電解液中操作，動作盡量要快）， 先在電解液中平衡IOmin。
[0144] 抽搐張力檢測的條件:使用IOV電壓，持續(xù)時(shí)間為0.3ms的方波。重復(fù)3次，每次隔10 秒一次。
[0145] 強(qiáng)直張力檢測的條件:使用IOV電壓，持續(xù)時(shí)間為200ms的一串波，其中每個(gè)為持續(xù) 時(shí)間為〇. 3ms的方波。重復(fù)3次，每次間隔3min。
[0146] 結(jié)果：
[0147] 圖20:野生型小鼠（WT)、miR-127轉(zhuǎn)基因小鼠〇6)、111(11;1^1?-127小鼠和111(匕小鼠血 清中肌酸激酶（CK)水平檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，跑步后4h，WT和TG小鼠血清CK值無顯著性差 異;mdx;miR-127小鼠血清CK顯著性低于mdx小鼠。這說明111丨1?-127緩解了111(^小鼠的肌膜破 損程度。
[0148] 圖21:mdx;miR-127和mdx腓腸肌(Gas)伊文思藍(lán)(EBD)浸潤面積及Laminin免疫熒 光染色。作為代表，僅顯示了腓腸肌中伊文思藍(lán)浸染損傷肌肉的染色結(jié)果圖片。
[0149] 圖22:基于圖21染色結(jié)果，統(tǒng)計(jì)mdx;miR-127和mdx腓腸肌(Gas)中伊文思藍(lán)浸染的 面積。結(jié)果顯不，mdx ;miR_127小鼠肌群伊文思藍(lán)浸染面積明顯減少。同樣說明miR-127緩解 了 mdx小鼠的肌膜破損程度。
[0150] 圖23:記錄11^6、11^;11^-127和11^小鼠達(dá)到疲勞程度時(shí)的跑步時(shí)間。結(jié)果顯示， WT和TG小鼠跑步時(shí)長沒有顯著差異;mdx ;miR-l 27小鼠組跑步時(shí)間顯著長于mdx小鼠組。
[0151] 圖24:為mdx;miR-127和mdx肌肉爆發(fā)力檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，WT和TG小鼠肌肉爆發(fā) 力沒有顯著差異;mdx ;miR-127小鼠肌肉爆發(fā)力顯著大于mdx小鼠組。
[0152] 圖25:為mdx; mi R-127和mdx肌肉耐力檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，WT和TG小鼠肌肉耐力沒 有顯著差異;mdx ;miR_127小鼠肌肉耐力顯著大于mdx小鼠組。
[0153] 綜合上述，在人類DMD疾病模型mdx小鼠中過表達(dá)miR-127可以顯著地改善mdx小鼠 的病理表型和生理功能。
[0154] 參考文獻(xiàn)
[0155] I.Mauro,A.,Satellite cell of skeletal muscle fibers.J Biophys Biochem Cytol,1961.9:p.493-5.
[0156] 2·Lepper,C·,T·A·Partridge ,and C.M.Fan,An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.Development,2011.138(17):p.3639-46.
[0157] 3.McCarthy,J.J.,et al.,Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle.Development,2011.138(17):p.3657-66.
[0158] 4.Murphy,M.M. ,et al.,Satellite celIs , connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development, 2011.138(17):p.3625-37.
[0159] 5 · Sambas i van ,R. ,et al. ,Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.Development,2011.138 (17):p.3647-56.
[0160] 6.Naguibneva, I.,et al., The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-AlI during mammalian myoblast differentiation.Nat Cell Biol, 2006.8(3):p.278-84.
[0161] 7.ChenjY. ,et al. ,MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation.PhysioI Genomics,2012.44(21):p.1042-51.
[0162] 8.LiujN.,et al.,microRNA-206 promotes skeletal muscle regeneration and delays progression of Duchenne muscular dystrophy in mice.J Clin Invest, 2012.122(6):p.2054-65.
[0163] 9.MaciottajS.,et al.,Hmgb3 is regulated by microRNA-206 during muscle regeneration.PLoS One,2012.7(8):p.e43464.
[0164] 10·Chen，J·F·，et al·，microRNA_l and microRNA-206 regulate skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation by repressing Pax7.J Cell Biol，2010.190(5):p.867-79.
[0165] 11 . Dey , B . K . , e t al . ,miR-26a is required for skeletal muscle differentiation and regeneration in mice.Genes Dev,2012.26(19):p.2180-91.
[0166] 12·Ge，Y·，Y·Sun，and J·Chen，IGF-II is regulated by microRNA_125b in skeletal myogenesis.J Cell Biol,2011.192(1):p.69-81.
[0167] 13.YinjH.,et al. ,MicroRNA-133 controls brown adipose deter mination in skeletal muscle satellite cells by targeting Prdml6.Cell Metab,2013.17(2): p.210-24.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 如下1)至3)中任一物質(zhì)在制備治療肌肉疾病的藥物中的用途： 1. miR-127； 2) 含有miR-127的編碼基因的重組載體； 3) 含有miR-127的編碼基因的重組病毒。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR-127的核苷酸序列如SEQ ID No.l 所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌肉疾病是肌肉損傷，優(yōu)選是急性肌 肉損傷。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌肉疾病是肌營養(yǎng)不良，任選是 Duchenne/Becker型肌營養(yǎng)不良、面肩-肱型肌營養(yǎng)不良、肢帶型肌營養(yǎng)不良、股四頭肌型肌 營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端型肌營養(yǎng)不良、進(jìn)行性眼外肌麻痹型肌營養(yǎng)不良或眼肌-咽肌型肌營養(yǎng)不 良。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述藥物通過促進(jìn)成肌細(xì)胞 的分化治療所述肌肉疾病，所述促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化優(yōu)選是提高成肌素和/或肌球蛋白重 鏈的表達(dá)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述藥物通過促進(jìn)骨骼肌損 傷再生治療所述肌肉疾病，所述促進(jìn)骨骼肌損傷再生優(yōu)選是促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的增殖和分 化。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述藥物通過改善病理和生 理表型治療所述肌肉疾病，所述改善病理和生理表型優(yōu)選是降低血清肌酸激酶水平、和/或 改善肌肉疲勞、和/或提高肌纖維張力及爆發(fā)力。8. 如下1)至3)中任一物質(zhì)在促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞分化的藥物中的用途： 1. miR-127； 2) 含有miR-127的編碼基因的重組載體； 3) 含有miR-127的編碼基因的重組病毒。9. 一種重組細(xì)胞，其是將miR-127、含有miR-127的編碼基因的重組載體或含有miR-127 的編碼基因的重組病毒導(dǎo)入至出發(fā)細(xì)胞中得到的重組細(xì)胞。10. 如權(quán)利要求9所述的重組細(xì)胞在制備治療肌肉疾病的藥物中的用途，或制備促進(jìn)骨 骼肌干細(xì)胞分化的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了miR-127在制備治療肌肉疾病的藥物中的用途。本發(fā)明提供了如下1)至3)中任一物質(zhì)在制備治療肌肉疾病的藥物中的用途：1)miR-127；2)含有miR-127的編碼基因的重組載體；3)含有miR-127的編碼基因的重組病毒。其可用于制備治療肌肉疾病的藥物，有效治療肌肉疾病。
【IPC分類】A61K48/00, C12N5/10, A61P21/00, A61K31/7105
【公開號】CN105688227
【申請?zhí)枴緾N201610073384
【發(fā)明人】朱大海, 張勇, 翟麗麗, 武日茂
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年2月2日