miR-127在制備治療肌肉疾病的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及肌肉疾病的治療領(lǐng)域，具體涉及miR-127在制備治療肌肉疾病的藥物 中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨生物體的生命活動中離不開骨骼肌的運(yùn)動和支持功能。不僅如此，我們身體所 攝取的糖和脂類等物質(zhì)均在骨骼肌中代謝產(chǎn)生能量，這對維持整個身體的穩(wěn)定狀態(tài)起著非 常重要的作用。許多的疾病如腫瘤、HIV感染、慢性心衰等患者在晚期多伴隨有骨骼肌減少 的癥狀。
[0003] 骨骼肌組織的一個顯著特征是損傷后能夠再生修復(fù)，這個過程是高度協(xié)調(diào)統(tǒng)一 的，骨骼肌干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)在該過程中發(fā)揮了重要功能。骨骼肌干細(xì)胞位于肌纖維膜和 基底膜之間[1]，是骨骼肌干細(xì)胞最主要的類型。骨骼肌干細(xì)胞的數(shù)目在不同物種及不同發(fā) 育階段是不同的：在新生小鼠中骨骼肌干細(xì)胞數(shù)目約為肌細(xì)胞的30%;成年后骨骼肌干細(xì) 胞的比例減少到約4%;年老小鼠骨骼肌干細(xì)胞的比例下降到2%左右。正常生理狀態(tài)下骨 骼肌干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，一旦受到外界刺激如損傷或運(yùn)動，處于靜息狀態(tài)的骨骼肌干細(xì) 胞被激活。激活的骨骼肌干細(xì)胞經(jīng)過增殖、分化及融合形成新的骨骼肌纖維并執(zhí)行正常的 生理功能。然而很多肌病的發(fā)生是因為骨骼肌干細(xì)胞自我更新受阻導(dǎo)致骨骼肌干細(xì)胞庫的 耗竭或者骨骼肌干細(xì)胞的激活、增殖功能受到抑制。
[0004] microRNA(也寫作miRNA或miR)作為一類具有調(diào)控活性的非編碼小分子RNA(通常 18-25nt)，廣泛參與各種組織器官的發(fā)育與疾病發(fā)生。miRNA參與骨骼肌發(fā)育的直接證據(jù)來 自于在骨骼肌組織條件性敲除Dicer基因后小鼠的骨骼肌發(fā)育發(fā)生異常，例如骨骼肌纖維 數(shù)目減少等。Di cer基因編碼的蛋白是miRNA成熟加工過程中所必需的核酸內(nèi)切酶，這表明 miRNA在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)報道有許多miRNA參與骨骼肌損傷再生 的過程[2-5]。第一個報道在損傷修復(fù)過程中發(fā)生表達(dá)改變的是miR-181，在損傷再生的最 后階段miR-181表達(dá)量顯著上調(diào)[6]。11^1?-351在蛇毒心臟毒素(Cardiotoxin，CTX)誘導(dǎo)的骨 骼肌損傷再生的早期表達(dá)量瞬時增加，miR-351通過抑制細(xì)胞周期抑制因子E2F3促進(jìn)骨骼 肌干細(xì)胞的增殖[7] miR-206在CTX損傷后，表達(dá)量顯著上調(diào)，這提示miR-206在骨骼肌損傷 再生中發(fā)揮功能，這與miR-206基因敲除小鼠中骨骼肌損傷再生功能嚴(yán)重受損相一致[8]。 miR-206的表達(dá)量上調(diào)可以抑制許多基因的表達(dá)，其中包括Pax7、Notch3、IGFBP5[8RP HMGB3[9]，而所有這些基因都抑制分化過程。此外，在損傷過程中miR-1的表達(dá)量上調(diào)也有 助于抑制Pax7的表達(dá)[10]。同樣地在CTX損傷后，miR-26a表達(dá)量上調(diào)。當(dāng)在脛骨前肌中敲低 miR-26a后，骨骼肌損傷再生的進(jìn)程減慢[11 ]。在相同的模型中，miR-125b在CTX損傷后表達(dá) 量上調(diào)，miR-125b下游的靶基因胰島素樣生長因子2(IGF-2)表達(dá)增加[12LIGF-2可以調(diào)控 成肌分化過程并抑制后損傷再生進(jìn)程[12]。此外，再生期間，miR-133表達(dá)量的增加以防止 骨骼肌干細(xì)胞變成棕色脂肪細(xì)胞[13 ]。
[0005]肌肉疾病(muscular disorders)通常是指骨豁肌疾病。肌營養(yǎng)不良是一組原發(fā)于 肌肉組織的遺傳病。臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的骨骼肌萎縮與無力、腱反射消失、肌肉假性 肥大。根據(jù)患者肌肉萎縮累及部位可分為多種類型:Duchenne/Becker型肌營養(yǎng)不良（DMD/ BMD)、面肩-肱型肌營養(yǎng)不良、肢帶型肌營養(yǎng)不良、股四頭肌型肌營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端型肌營養(yǎng)不 良、進(jìn)行性眼外肌麻痹型肌營養(yǎng)不良、眼肌-咽肌型肌營養(yǎng)不良。DMD型肌營養(yǎng)不良是最常見 的一類進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥?；疾÷蕿?.3/10萬，占出生男嬰的20-30/10萬，為X-連鎖隱性 遺傳。主要是男孩發(fā)病，女性為致病基因的攜帶者。通常5歲左右發(fā)病。肌萎縮是進(jìn)行性的肌 肉疾病，預(yù)后差，一般在20-30歲時伴隨心肌功能衰竭或呼吸困難等致死。目前針對該病，醫(yī) 學(xué)界尚無有效療法。
[0006] Mdx小鼠是肌營養(yǎng)不良蛋白（dystrophin)缺陷鼠，是研究骨骼肌干細(xì)胞激活、增 殖、分化調(diào)控機(jī)制及骨骼肌損傷-再生機(jī)理的常用模型。目前改善mdx小鼠肌營養(yǎng)不良表型 的治療方案有多種，但都存在缺陷。如移植自體骨骼肌干細(xì)胞到mdx小鼠中，但自體移植的 骨骼肌干細(xì)胞仍然不能表達(dá)肌營養(yǎng)不良蛋白。如果使用異體移植的骨骼肌干細(xì)胞來補(bǔ)償 mdx小鼠缺失的dystrophin蛋白，就會存在如下的問題：1)宿主的免疫排斥反應(yīng);2)移植后 的骨骼肌干細(xì)胞后存活率、自我更新能力及迀移能力降低。
[0007] 因此，研究治療肌肉疾病的分子基礎(chǔ)及治療方法是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種miR-127在制備治療肌肉疾病的藥物中的 用途。
[0009] 基于上述目的本發(fā)明提供了如下1)至3)中任一物質(zhì)在制備治療肌肉疾病的藥物 中的用途：
[0010] l)miR-127；
[0011] 2)含有miR-127的編碼基因的重組載體；
[0012] 3)含有miR-127的編碼基因的重組病毒。
[0013] 優(yōu)選地，所述miR-127的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0014] 可選地，所述肌肉疾病是肌肉損傷，優(yōu)選是急性肌肉損傷。
[0015] 可選地，所述肌肉疾病是肌營養(yǎng)不良，任選是Duchenne/Becker型肌營養(yǎng)不良、面 肩-肱型肌營養(yǎng)不良、肢帶型肌營養(yǎng)不良、股四頭肌型肌營養(yǎng)不良、遠(yuǎn)端型肌營養(yǎng)不良、進(jìn)行 性眼外肌麻痹型肌營養(yǎng)不良或眼肌-咽肌型肌營養(yǎng)不良。
[0016] 可選地，所述藥物通過促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化治療所述肌肉疾病，所述促進(jìn)成肌細(xì) 胞的分化優(yōu)選是提高成肌素和/或肌球蛋白重鏈的表達(dá)。
[0017] 可選地，所述藥物通過促進(jìn)骨骼肌損傷再生治療所述肌肉疾病，所述促進(jìn)骨骼肌 損傷再生優(yōu)選是促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的增殖和分化。
[0018] 可選地，所述藥物通過改善病理和生理表型治療所述肌肉疾病，所述改善病理和 生理表型優(yōu)選是降低血清肌酸激酶水平、和/或改善肌肉疲勞、和/或提高肌纖維張力及爆 發(fā)力。
[0019] 基于相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了如下1)至3)中任一物質(zhì)在促進(jìn)骨骼肌干細(xì) 胞分化的藥物中的用途：
[0020] l)miR-127；
[0021] 2)含有miR-127的編碼基因的重組載體；
[0022] 3)含有miR-127的編碼基因的重組病毒。
[0023]本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞，其是將miR-127、含有miR-127的編碼基因的重組 載體或含有miR-127的編碼基因的重組病毒導(dǎo)入至出發(fā)細(xì)胞中得到的重組細(xì)胞。
[0024] 可選地，將所述的重組細(xì)胞用于制備治療肌肉疾病的藥物，或用于制備促進(jìn)骨骼 肌干細(xì)胞分化的藥物。
【附圖說明】
[0025] 圖l:miR-127在成年小鼠的不同組織中的表達(dá)豐度；
[0026] 圖2:miR-127在C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化；
[0027]圖3:miR-127在骨骼肌干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化；
[0028] 圖4:C2C12細(xì)胞分化24h后未轉(zhuǎn)染miR-127的對照組(NC)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-127的實 驗組(OE)MyoG的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果；
[0029] 圖5:相對于對照組，實驗組MyoG陽性細(xì)胞數(shù)目；
[0030] 圖6: C2C12細(xì)胞分化24h后對照組與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-127實驗組MyoG在轉(zhuǎn)錄水平的表 達(dá)量；
[0031] 圖7:C2C12細(xì)胞分化24h后對照組與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-127實驗組MyoG在蛋白水平的表 達(dá)量；
[0032] 圖8: C2C12細(xì)胞分化36h后對照組與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-127實驗組表達(dá)MHC的細(xì)胞免疫 熒光染色結(jié)果；
[0033] 圖9:相對于對照組，實驗組MHC陽性細(xì)胞數(shù)目；
[0034] 圖10 :C2C12細(xì)胞分化36h后對照組與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-127實驗組MHC在轉(zhuǎn)錄水平的表 達(dá)量；
[0035] 圖11 :C2C12細(xì)胞分化36h后對照組與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-127實驗組MHC在蛋白水平的表 達(dá)量；
[0036] 圖12:CTX誘導(dǎo)8-10周小鼠肌肉損傷再生7.5天后脛骨前肌橫切面染色結(jié)果；
[0037] 圖13:肌肉損傷后7.5天脛骨前肌橫切面上核在中央的肌纖維（中央核纖維)數(shù)目 比例統(tǒng)計；
[0038]圖14:肌肉損傷后7.5天胚胎型MHC(myh3)的相對表達(dá)量；
[0039] 圖15:在CTX損傷3.5天后MyoD、Pax7的雙免疫熒光染色結(jié)果，DAPI染色定位細(xì)胞 核，圖片顯示為代表性視野；
[0040] 圖16:相對于野生型小鼠（WT)，轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)中MyoD/Pax7雙陽性細(xì)胞相對數(shù) 目；
[0041 ]圖17:從miR-127轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)與野生型小鼠（WT)中分離骨骼肌干細(xì)胞后培養(yǎng) 分化36h后MHC的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果；
[0042]圖18:從miR-127轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)與野生型小鼠（WT)中分離骨骼肌干細(xì)胞后培養(yǎng) 分化36h后MHC的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果；
[0043]圖19:相對于野生型小鼠（WT)，從miR-127轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)中分離的骨骼肌干細(xì)胞 分化36h后MHC陽性細(xì)胞的相對數(shù)目；
[0044] 圖20:野生型小鼠（FT)、miR-127轉(zhuǎn)基因小鼠（TG)、mdx;miR-127(mdx;TG)小鼠和 mdx小鼠血清中肌酸激酶(CK)水平檢測結(jié)果；
[0045] 圖21:mdx;miR-127和mdx脛骨前肌伊文思藍(lán)（EBD)浸潤面積及層粘連蛋白 (Laminin)的免疫熒光染色；
[0046]圖22:mdx;miR-127和mdx脛骨前肌脛骨前肌中伊文思藍(lán)浸染的面積統(tǒng)計結(jié)果；
[0047] 圖23: mdx; miR-127和mdx小鼠跑步時間記錄結(jié)果；
[0048] 圖24:m