阿可拉定在制備用于抑制肝癌干細(xì)胞藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及阿可拉定在制備用于抑制肝癌干細(xì)胞藥物中的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是一種能夠無限制自我更新，并具有分化成不同成熟組織類型的多能性細(xì) 胞。
[0003] 腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的一種或幾種具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。腫瘤干 細(xì)胞具有自我復(fù)制和定向分化的能力，是腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，并導(dǎo)致了器官正常 功能的紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。在例如腦、肺、肝臟、結(jié)腸、前列腺等器官的腫瘤中陸續(xù)發(fā) 現(xiàn)了類似的腫瘤干細(xì)胞，因此，腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是癌癥治療的有效靶點(diǎn)。然而，由于腫瘤 干細(xì)胞具有耐藥性、耐放療和耐化療性的特點(diǎn)，因此，惡性腫瘤難以治愈，一直以來困擾著 人類社會(huì)。
[0004] 肝癌是世界五大常見的癌癥之一，肝癌的根治性治療方法包括手術(shù)及肝移植。然 而，80%以上的肝癌患者參加治療時(shí)，病情已到晚期，無法應(yīng)用上述治療方法。即使能夠?qū)?施手術(shù)切除，術(shù)后的復(fù)發(fā)率也比較高，而且肝癌術(shù)后的長期預(yù)后不能令人滿意。經(jīng)肝動(dòng)脈栓 塞化療或全身化療是肝癌患者通常使用的治療手段，但由于化療藥物的毒性及腫瘤抗化療 藥性強(qiáng)，所以長期看來肝癌的整體治療效果并不理想。
[0005]EpCAM又稱為⑶326,是一種I型跨膜糖蛋白。在肝癌干細(xì)胞和肝癌母細(xì)胞中均有 表達(dá)，但是在正常成熟的細(xì)胞中無表達(dá)，因此，EpCAM可用來作為肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0006] CD133又名Prominin-1、AC133,在造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中均有表達(dá)，是人類 造血干/祖細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，由于CD133肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的致瘤性和增殖性，與肝 祖細(xì)胞的特征相似，并且肝癌病人CD133的高表達(dá)顯示出預(yù)后差并且易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，CD133 也被認(rèn)為是肝癌的標(biāo)志物。
[0007]CD24是一種低分子質(zhì)量高度糖基化的蛋白質(zhì)，是B細(xì)胞分化的標(biāo)記物，在淋巴細(xì) 胞成熟、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及在生理狀態(tài)下的器官組織新陳代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn) 肝癌患者腫瘤內(nèi)如果⑶24高表達(dá)，手術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)率較腫瘤內(nèi)只有低表達(dá)肝癌患者高3 倍，同時(shí)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)也較高。因此，CD24也被認(rèn)為肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。
[0008] 阿可拉定，又名淫羊藿素，是從中藥淫羊藿中提取分離得到的主要活性成分淫羊 藿苷經(jīng)酶轉(zhuǎn)化得到的新的有效單體，其結(jié)構(gòu)式如下式（I)所示：
[0009]
0
[0010] 該化合物的制備方法公開于CN101302548,該方法以淫羊藿苷為原料，以0 -葡萄 糖苷酶進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物離心得到的沉淀用丙酮溶解，離心過濾得到上清液。再將離心得 到的上清液用水進(jìn)行重結(jié)晶，得到阿可拉定純品。
[0011] 在申請(qǐng)?zhí)枮?00780039276. 9的中國專利中公開了一種用于治療與雌激素受體相 關(guān)疾病的化合物和方法，該專利中公開了阿可拉定用于治療與雌激素受體ER-a36相關(guān)的 肝癌。
[0012] 在現(xiàn)有技術(shù)中，并沒有針對(duì)阿可拉定對(duì)ER-a36以外的其他靶點(diǎn)的進(jìn)一步研究， 也沒有阿可拉定對(duì)腫瘤干細(xì)胞，特別是肝癌干細(xì)胞的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是提供阿可拉定在制備用于抑制肝癌干細(xì)胞藥物中的用途。
[0014] 本發(fā)明一方面提供了阿可拉定在制備用于抑制肝癌干細(xì)胞藥物中的用途。
[0015] 優(yōu)選地，其中所述的肝癌干細(xì)胞包括肝癌起始細(xì)胞。
[0016] 優(yōu)選地，其中阿可拉定通過抑制肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM的表達(dá)抑制肝癌干細(xì) 胞。
[0017] 優(yōu)選地，其中阿可拉定通過抑制肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物⑶133的表達(dá)抑制肝癌干細(xì) 胞。
[0018] 優(yōu)選地，其中阿可拉定通過抑制肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物⑶24的表達(dá)抑制肝癌干細(xì)胞。
[0019] 優(yōu)選地，其中阿可拉定用于抑制與STAT3相關(guān)的肝癌干細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過對(duì)阿可拉定的進(jìn)一步研究，確定了阿可拉定 對(duì)肝癌治療的新的靶點(diǎn)，即肝癌的干細(xì)胞，優(yōu)選地，肝癌起始細(xì)胞。因此，阿可拉定有望通過 對(duì)肝癌干細(xì)胞抑制，從根本上治愈肝癌。
【附圖說明】
[0021] 圖1表示阿可拉定對(duì)肝癌細(xì)胞Ifep-12細(xì)胞活力的抑制。
[0022] 圖2表示阿可拉定對(duì)正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞活力的抑制。
[0023] 圖3表示順鉬對(duì)肝癌細(xì)胞Ifep-12細(xì)胞活力的抑制。
[0024] 圖4表示順鉬對(duì)正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞活力的抑制。
[0025] 圖5表示阿可拉定、順鉬對(duì)PCL/PRF/5肝癌干細(xì)胞成球數(shù)目的抑制。
[0026] 圖6表示阿可拉定、順鉬對(duì)PCL/PRF/5肝癌干細(xì)胞成球尺寸的抑制。
[0027] 圖7表示阿可拉定、順鉬對(duì)Huh7肝癌干細(xì)胞成球數(shù)目的抑制。
[0028] 圖8表示阿可拉定、順鉬對(duì)Huh7肝癌干細(xì)胞成球尺寸的抑制。
[0029] 圖9表示阿可拉定、順鉬對(duì)PLC/PRF/5肝癌二代干細(xì)胞球數(shù)目的抑制作用。
[0030] 圖10表示阿可拉定、順鉬對(duì)Huh7肝癌二代干細(xì)胞球數(shù)目的抑制作用。
[0031] 圖11表示阿可拉定和順鉬分別對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞中EpCAM表達(dá)為陽性的細(xì)胞比 例的抑制。
[0032] 圖12表示阿可拉定和順鉬分別對(duì)Huh7細(xì)胞中EpCAM表達(dá)為陽性的細(xì)胞比例的抑 制。
[0033] 圖13表示阿可拉定和順鉬分別在體外處理PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞后，植入體內(nèi)的腫 瘤體積增長情況。
[0034] 圖14表示阿可拉定和順鉬分別在體外處理Huh7肝癌細(xì)胞后，植入體內(nèi)的腫瘤體 積增長情況。
[0035] 圖15表示阿可拉定對(duì)PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM、CD133以及CD24在mRNA 水平的抑制。
[0036] 圖16表示阿可拉定對(duì)Huh7肝癌細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM、⑶133以及⑶24在mRNA水平 的抑制。
[0037] 圖17表示STAT3抑制劑對(duì)PLC/PRF/5和Huh7肝癌干細(xì)胞球數(shù)目的抑制。
[0038] 圖18表示通過對(duì)STAT3進(jìn)行RNA干擾（siSTAT3)處理，阿可拉定能加速抑制肝癌 干細(xì)胞的成球能力。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 以下實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例性說明，不用于限制本發(fā)明，在本發(fā)明保護(hù) 范圍內(nèi)所做的修改、改變、變型等都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0040] 本發(fā)明中的"起始細(xì)胞tumor-initiatingcells(T-ICs) "是腫瘤干細(xì)胞的一種， 具有正常干細(xì)胞的特征，具有自我更新和分化的潛能。腫瘤起始細(xì)胞比腫瘤內(nèi)其他較成熟 的癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療更具抗藥性，是腫瘤化療后復(fù)發(fā)的主要原因之一。
[0041] 本發(fā)明中的人肝癌細(xì)胞Hep-12由來源于復(fù)發(fā)肝癌組織經(jīng)原代培養(yǎng)后建系而 成（有關(guān)該細(xì)胞的建立方法見：Thepropertiesoftumor-initiatingcellsfroma hepatocellularcarcinomapatient^primaryandrecurrenttumor,carcinogenesis. XuXL,XingBC，HanHB，ZhaoWetal，2010 ;31 (2): 167-74)。
[0042] 本發(fā)明中的"肝癌"指的是原發(fā)性肝癌，即起源于肝臟的上皮或間葉組織的肝臟惡 性腫瘤。
[0043] 本發(fā)明中的"STAT3"是信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白家族中的一種蛋白，在細(xì)胞 因子-受體相互作用的過程中充當(dāng)載體，保持信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)傳遞的內(nèi)在特異性，STAT3被發(fā) 現(xiàn)其與腫瘤存在密切的關(guān)系。
[0044] 本發(fā)明中的"siRNA"指的是沉默RNA技術(shù)，本發(fā)明中siSTAT3是STAT3蛋白的RNA 沉默，用于評(píng)估肝癌細(xì)胞中STAT3蛋白的作用。
[0045] 本發(fā)明中的CCK8試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司（Dojindo Laboratories),商品名稱細(xì)胞計(jì)數(shù)器（CellCountingKit)CCK_8,商品編號(hào)為CK04。
[0046] 本發(fā)明中的培養(yǎng)因子B27購自上海英駿生命技術(shù)公司的（Invitrogen)，商品名稱 B27,商品編號(hào) 12587010。
[0047]本發(fā)明中的"DMEM/F12培養(yǎng)基"購自上海英駿生命技術(shù)公司（Invitrogen)，商品 名稱DMEM/F12培養(yǎng)基，商品編號(hào)11039-021。
[0048] 本發(fā)明中的"人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5"購自于日本癌癥研究銀行JapaneseCancer ResearchBank(JCRB)，Tokyo,Japan，商品名稱PLC/PRF/5,商品編號(hào)為JCRB0406。
[0049] 本發(fā)明中的"肝癌細(xì)胞株Huh7"購自于日本癌癥研究銀行JapaneseCancer ResearchBank(JCRB),Tokyo,Japan，商品名稱Huh_7,商品編號(hào)為JCRB0403。
[0050]本發(fā)明中的"肝細(xì)胞株L02"購自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)。
[0051] PLC/PRF/5和肝癌細(xì)胞株Huh-7的區(qū)別均為人肝細(xì)胞肝癌，來源于不同的人。
[0052] 本發(fā)明中的STAT3抑制劑購自