一種三維管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是通過(guò)細(xì)胞自組裝來(lái)制備三維管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法，涉及生物制造與組織工程的使能技術(shù)，特別是管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)體外構(gòu)建的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]實(shí)現(xiàn)生物組織的修復(fù)和再生是組織工程的主要目標(biāo)。為實(shí)現(xiàn)組織乃至器官的功能再生，越來(lái)越多的研宄人員設(shè)計(jì)并制造各種人工替代結(jié)構(gòu)體并將其廣泛應(yīng)用于生物組織工程，且此類(lèi)制造逐漸向著更為復(fù)雜和精細(xì)的方向發(fā)展。具有管狀結(jié)構(gòu)的生物組織(比如氣管、血管、淋巴管以及腸等)在高等生物體內(nèi)廣泛存在。此類(lèi)三維管狀結(jié)構(gòu)體的人造替代物通常需要采用特定的材料在體外構(gòu)建相應(yīng)的三維結(jié)構(gòu)體，然后進(jìn)行相應(yīng)技術(shù)處理，進(jìn)而得到與體內(nèi)的管狀組織形狀接近的替代物，比如通過(guò)雙層經(jīng)編組織的紡織型人造血管(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN101069756A，2007)，管體上連續(xù)緞設(shè)有紋路的滌綸人造血管(實(shí)用新型CN201341972Y，2009)，在機(jī)織機(jī)上織造的機(jī)織人造血管(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN102920531A，2013)，以及由滌綸人工血管和支架人工血管連通組合形成的改良型支架人工血管(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，CN104161605A, 2014)等。
[0003]此類(lèi)管狀的人造血管局部替代物都需要先制造出由纖維材料等外部材料構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)，然后再將其植入體內(nèi)并與相應(yīng)的人體組織形成良好連接和融合，進(jìn)而完成實(shí)現(xiàn)人造血管的血液輸運(yùn)功能。然而，此類(lèi)管狀結(jié)構(gòu)體雖然制造精細(xì)，但由其本身的材料仍是一些人工合成材料(非生物體自身的組織)，因而仍然很有可能引起人體的排異反應(yīng)以及不可預(yù)料的并發(fā)癥等問(wèn)題。雖然近年來(lái)一些國(guó)外研宄者運(yùn)用化合高分子材料結(jié)合能夠較好抵抗排異反應(yīng)的生物分子制作出了一些特殊的“印刷墨水”，并利用基于該“印刷墨水”的3D打印技術(shù)制造出人造血管替代物，但這種方法的實(shí)施過(guò)程復(fù)雜，且成本很高。
[0004]因此，如果能夠充分利用生物體自身細(xì)胞的自我組織(self-organizing)特性，構(gòu)建特定的微環(huán)境進(jìn)行干細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)，使來(lái)源于人體自身的干細(xì)胞自組裝成一種模擬天然生物組織的管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且無(wú)需由合成材料制備的管狀人工替代物，這樣就能夠從根本上大大減輕人體的排異反應(yīng)，并大幅度降低人工血管或其他人工管狀組織的制造成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前管狀的人造血管局部替代物制造和實(shí)施過(guò)程復(fù)雜，成本高，而且?guī)?lái)人體排異反應(yīng)的概率較大等缺點(diǎn)，提供一種通過(guò)干細(xì)胞在體外特定凝膠微結(jié)構(gòu)中的三維培養(yǎng)制備出三維管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法。此方法將大量細(xì)胞至于水凝膠中培養(yǎng)，使其在三維空間伸展、迀移并相互連接，并在兩種水凝膠的界面處形成中空管狀的類(lèi)似血管的結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)完全由細(xì)胞構(gòu)成，不含其它任何材料)。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]該方法通過(guò)構(gòu)建由具有不同機(jī)械特性和不同分子擴(kuò)散率的上層水凝膠(I)與下層水凝膠(2)組成的復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)，并對(duì)水凝膠中的細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，即可使細(xì)胞在上下層水凝膠的分界面附近自組裝成為直管狀結(jié)構(gòu)(4)或彎曲管狀結(jié)構(gòu)(5)。
[0008]具體步驟如下:
[0009]A:將包含細(xì)胞的下層水凝膠(2)的前體溶液在具有特定微結(jié)構(gòu)的模具上進(jìn)行固化，形成固化型水凝膠結(jié)構(gòu)，所述的模具是聚二甲基硅氧烷PDMS模具。
[0010]B:將包含細(xì)胞的上層水凝膠⑴的前體溶液通過(guò)移液器置于步驟(A)中的固化型水凝膠之上，對(duì)其進(jìn)行凝固化處理，形成上下兩層水凝膠粘合而成的復(fù)合式水凝膠。
[0011]C:將步驟(B)中的細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，即可在上下層水凝膠的分界面附近自組裝成為直管狀結(jié)構(gòu)(4)或彎曲管狀結(jié)構(gòu)(5)。
[0012]該方法需要使用具有不同結(jié)構(gòu)特性的兩種凝膠來(lái)構(gòu)造特定的水凝膠界面，并且兩種凝膠內(nèi)包含細(xì)胞的濃度不相同，或者只有一種凝膠中含有細(xì)胞。利用細(xì)胞因子在不同結(jié)構(gòu)特性(例如凝膠內(nèi)部成分的濃度或比例不同)的水凝膠中擴(kuò)散率的不同，使其在界面處出現(xiàn)累積并使之局部濃度增大；利用界面附近細(xì)胞的濃度梯度作用，使得細(xì)胞發(fā)生跨界面移動(dòng)趨勢(shì)，并使細(xì)胞在界面處的濃度增大，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子和細(xì)胞在界面處的初步聚集。這就使得界面處的細(xì)胞和細(xì)胞因子(含活化子和阻滯子)的局部濃度會(huì)明顯高于其他區(qū)域。然后，利用凝膠微系統(tǒng)中的大分子反應(yīng)擴(kuò)散過(guò)程中的圖靈不穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)特定時(shí)間的細(xì)胞三維培養(yǎng)，使得活化子和阻滯子的濃度沿著界面交線(xiàn)方向的均勻分布狀態(tài)被打破，并逐漸構(gòu)建出許多分布的局部高濃度區(qū)域，這些局部區(qū)域的幾何形狀接近柱狀體(一種三維圖靈斑圖，這里簡(jiǎn)稱(chēng)柱狀聚集區(qū)域)。在此之后，利用細(xì)胞的趨化移動(dòng)特性，使得大量細(xì)胞逐漸向界面處的各個(gè)柱狀區(qū)域聚集，形成多個(gè)柱狀多細(xì)胞聚集體，同時(shí)細(xì)胞在這些緊湊的局部區(qū)域內(nèi)大量分泌活化子和阻滯子。當(dāng)細(xì)胞聚集到一定程度之后，根據(jù)活化子自催化生成的規(guī)律，活化子在局部位置的濃度明顯升高會(huì)導(dǎo)致活化子的產(chǎn)出趨于飽和(即其濃度接近飽和，增長(zhǎng)明顯放緩)，且其在中心區(qū)域內(nèi)活化子的濃度梯度明顯降低，這就會(huì)導(dǎo)致在各個(gè)柱狀聚集區(qū)域中心部分的細(xì)胞趨化作用明顯減小，這同時(shí)使得細(xì)胞的擴(kuò)散作用占據(jù)了主導(dǎo)地位(擴(kuò)散作用和趨化作用分別使細(xì)胞向正反兩個(gè)方向移動(dòng)，因此是此消彼長(zhǎng)的關(guān)系)，于是整個(gè)柱狀區(qū)域內(nèi)細(xì)胞整體上逐漸由中心向外圍擴(kuò)散并在中心區(qū)域形成空腔。
[0013]隨著中心區(qū)域的細(xì)胞向外圍擴(kuò)散，管壁區(qū)域的細(xì)胞增多，細(xì)胞趨化移動(dòng)的方向開(kāi)始反向，變?yōu)橛芍行南蛑鼙诘姆较虿⒅饾u增大；但同時(shí)隨著管壁區(qū)域活化子濃度增大并趨于飽和，以及細(xì)胞在管壁區(qū)域進(jìn)一步增多，由中心朝向管壁的細(xì)胞趨化移動(dòng)又開(kāi)始逐漸減小，而由管壁朝向中心方向的擴(kuò)散作用再次占據(jù)主導(dǎo)地位，細(xì)胞又開(kāi)始向中心區(qū)域移動(dòng)，但移動(dòng)的距離范圍更小，遠(yuǎn)不能到達(dá)中心區(qū)域。之后，細(xì)胞沿著管半徑方向的迀移過(guò)程將多次重復(fù)上述過(guò)程，細(xì)胞在管半徑方向上的迀移將來(lái)回多次，且幅度越來(lái)越小，最后逐漸到達(dá)平衡位置，于是多細(xì)胞中空管狀結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)延時(shí)培養(yǎng)少數(shù)幾天即可使得多細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)周?chē)椭胁康哪z盡可能完全被細(xì)胞分泌的酶降解掉。于是，經(jīng)過(guò)若干天的細(xì)胞三維培養(yǎng)，上述柱狀多細(xì)胞聚集體最終形成中空的管狀結(jié)構(gòu)。管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的直徑與相鄰界面的距離相關(guān)；管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度與水凝膠二維界面的高度相關(guān)。
[0014]本發(fā)明提供的三維管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的制備方法中的水凝膠界面通過(guò)兩種具有不同性質(zhì)的水凝膠上下粘結(jié)形成。下層水凝膠的上表面具有陣列式的凹凸相間的圖案；上層水凝膠的下表面也具有陣列式的凹凸相間的圖案，且與下層水凝膠的上表面的凹凸結(jié)構(gòu)互補(bǔ)地?zé)o縫粘結(jié)。下層的水凝膠和上層的水凝膠粘結(jié)形成的復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)整體浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中，并每隔一天或兩天更換新鮮培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)若干天的長(zhǎng)期培養(yǎng)之后，即可以在上下層水凝膠的界面附近制備出管狀三維多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
[0015]作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明所述的上層水凝膠和下層水凝膠可以是纖維蛋白凝膠、基底膜基質(zhì)凝膠、透明質(zhì)酸凝膠或者其他適于細(xì)胞生長(zhǎng)的水凝膠。所述的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞與上皮細(xì)胞的組合或間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的組合。
[0016]在初始情況下，細(xì)胞被均勻的包裹于上層水凝膠和下層水凝膠中，且細(xì)胞在上層水凝膠和下層水凝膠中的密度是不同的，且二者密度至少相差一倍。而且上層水凝膠和下層水凝膠之間的界面是連續(xù)的凹凸曲面，或者是水平與豎直面交替的連續(xù)界面，這種連續(xù)界面是周期性的或非周期性的。
[0017]作為對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定，上層水凝膠和下層水凝膠之間的局部界面是水平面、豎直面或曲面。
[0018]采用本發(fā)明的方案后，取得的有益效果是:
[0019]本發(fā)明所提出的這種三維管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法完全依靠細(xì)胞的自組裝，完全省去了目前已有的管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)制備方法中所必需的外部結(jié)構(gòu)材料及復(fù)雜的加工制作工藝，整個(gè)制備方法更充分的利用了大量細(xì)胞之間的相互通訊能力，并更接近于體內(nèi)組織的天然形成過(guò)程，為人造管狀組織的制備提供了一種更接近體內(nèi)天然組織、可靠性高的方法。
[0020]而且本發(fā)明中的三維管狀多細(xì)胞結(jié)構(gòu)是在不同水凝膠的界面處制備出中空管狀的類(lèi)似血管的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)完全由細(xì)胞構(gòu)成，不含其它合成材料，能夠大大減輕目前管狀人造組織所需的由聚合物制造的替代物所帶來(lái)排異反應(yīng)的問(wèn)題，并能夠大幅度降低人工血管或其他