_789 雙酶切鑒定；
[0040] 圖 3 pVAX-S499_789的鑒定。M :DNA Marker III ;1 :S 499_789基因擴增；2 :pVAX-S 499_789 雙酶切鑒定；
[0041] 圖4 pVAX-S499_789表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定。A :轉(zhuǎn)染PVAX-S 499_789的C0S-7細 胞；B :轉(zhuǎn)染pVAXl的C0S-7細胞；
[0042] 圖5 pVAX_S499_789表達產(chǎn)物的免疫印跡鑒定。M :蛋白Marker ;1 :轉(zhuǎn)染pVAXl的 C0S-7 細胞；2 :轉(zhuǎn)染 pVAX-S499_789的 C0S-7 細胞；
[0043] 圖 6 SL7207(pVAX-S499_789)菌株的鑒定。M :DNA Marker III ;1 :沙門氏菌鑒定；2 : S499_789基因的擴增；3 :pVAX-S 499_789的雙酶切；4 :沙門氏菌鑒定；
[0044] 圖7重組減毒沙門菌株的生長曲線；
[0045] 圖8重組沙門菌株的體外穩(wěn)定性分析；
[0046] 圖9重組沙門菌株的體內(nèi)穩(wěn)定性分析；
[0047] 圖10 RT-PCR檢測S基因在小鼠腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。M :DNA Marker III ;1，2, 3, 4:接 種 SL7207 (pVAX-S499_789) 1，3, 5, 7 天；5, 6, 7, 8 :接種 SL7207 (pVAX)后 1，3, 5, 7 天；
[0048] 圖11重組沙門氏菌菌株在脾臟和肝臟中的增殖，A是脾臟，B是肝臟；
[0049] 圖12重組減毒沙門氏菌的小鼠安全性分析。A :腸壁固有層與肌層分離；B :小腸 絨毛杯狀細胞增多；C :小腸絨毛脫落；D :PBS對照組小鼠回腸切片；
[0050] 圖13免疫仔豬T淋巴細胞增殖實驗（*P〈0. 01);
[0051] 圖14免疫仔豬血清樣品中抗PEDV IgG的檢測（*Ρ〈0· 01);
[0052] 圖15免疫仔豬黏膜樣品中抗PEDV IgA的檢測（*Ρ〈0. 01);
[0053] 圖16特異性抗體的病毒中和實驗。A血清抗體IgG的病毒噬斑減少分析 (*Ρ〈0· 01) ;Β黏膜抗體IgA的病毒噬斑減少分析（*Ρ〈0· 01);
[0054] 圖17免疫仔豬血清IFN-Y的測定。A IFN-Y標準品的線性回歸方程；B血清中 IFN-Y水平的變化（*Ρ〈0·01);
[0055] 圖18免疫仔豬血清IL-4的測定。A IL-4標準品的線性回歸方程；B血清中IL-4 水平的變化。
【具體實施方式】
[0056] 實驗材料和試劑：
[0057] 1 材料
[0058] I. 1菌株、毒株及實驗動物
[0059] 豬流行性腹瀉病毒疫苗株（CV777株）、豬流行性腹瀉病毒株，購自中國獸藥監(jiān)察 所或四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病室分離保存；大腸桿菌DH5ci，購自北京天根生物制品有限 公司；減毒鼠傷寒沙門菌SL7207由由德國Helmholtz感染研究中心Kai Schulze教授饋 贈，C0S-7細胞、Vero細胞均購自武漢大學(xué)保藏中心均由實驗室提供；、pVAXl質(zhì)粒，購自美 國Invitrogen公司；；BALB/c小鼠（雌性，6周齡，清潔級）購自成都生物制品研究所，20 日齡仔豬購自雅安某無 PEDV、TGEV、豬輪狀病毒感染史豬場。
[0060] L 2主要試劑
[0061] 兔抗PEDV陽性血清由本室制備保存；限制性內(nèi)切酶、pMD19-T simple Vector、 T4DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒瓊脂糖去 內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Endo-Free Plasmid Mini Kit、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收 試劑盒購自美國OMEGA公司；2XTaq PCR Master Mix、TMB底物溶液、DNA分子量標準等， 北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品RPMI1640, GIBCO公司產(chǎn)品；小鼠用淋巴細胞分離液，天津 灝洋生物制品科技有限責任公司產(chǎn)品；肝素鈉、ConA、MTT，Amresco公司產(chǎn)品；HRP標記的 羊抗兔IgG酶標二抗，Sigma公司產(chǎn)品；FITC標記羊抗兔IgG抗體為北京博奧森公司產(chǎn)品； Anti-PEDV IgG檢測試劑盒、anti-PEDV IgA檢測試劑盒、細胞因子Y-干擾素檢測試劑盒、 IL-4檢測試劑盒，均為美國R&D公司產(chǎn)品。
[0062] 1. 3主要儀器
[0063] Legend Micro 17R centrifuge離心機、恒溫振蕩培養(yǎng)箱，美國Thermo公司產(chǎn)品； ECLIPSE TE 2000-U型熒光倒置顯微鏡，日本Nickon公司產(chǎn)品；半干轉(zhuǎn)印儀、Gene Pulser Xcell 電轉(zhuǎn)儀、MyCyclerTM PCR儀、POWER Pac TM 電泳儀及水平電泳槽、UNIVERSAL H00D凝 膠成像系統(tǒng)、SmartspecTM Plus核酸蛋白儀、Model 680酶標儀，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品； Water Pro Plus超純水儀，美國LABC0NC0公司產(chǎn)品。
[0064] 實施例1本發(fā)明重組菌的構(gòu)建
[0065] 一、構(gòu)建方法
[0066] IPEDV S499_789基因的克隆
[0067] I. 1弓丨物設(shè)計
[0068] 參照GenBank公布的PEDV的S基因 cDNA序列（序列號：KC886306)，利用 Primer5.0設(shè)計引物如下（表1)，其中P1/P3用于擴增3 499_789基因。引物由大連寶生物工 程有限公司合成。
[0069] 表1 &99_789基因的擴增引物序列及酶切位點標示
[0070]
【主權(quán)項】
1. 包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌在制備預(yù)防豬流行性腹瀉疾病 的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述重組沙門氏菌包含攜帶有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的重組pVAXl質(zhì)粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述藥物包含致免疫有效量的重組沙門 氏國。
4. 一種疫苗，其特征在于：它是由包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌 和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述重組沙門氏菌包含攜帶有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的重組pVAXl質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或 防腐劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述佐劑為霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸 毒素或大腸桿菌不耐熱腸毒素 B單位。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述防腐劑為硫柳汞。
9. 權(quán)利要求4-8任意一項所述的疫苗在制備預(yù)防豬流行性腹瀉疾病的藥物中的用途。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述的防豬流行性腹瀉疾病的藥物是口 服制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌在制備預(yù)防豬流行性腹瀉疾病的藥物中的用途，還公開了一種由包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成的預(yù)防豬流行性腹瀉疾病的疫苗。本發(fā)明疫苗可產(chǎn)生的針對豬流行性腹瀉病毒的特異性抗體水平高，對豬流行性腹瀉疾病有良好的保護作用，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。
【IPC分類】A61K48-00, A61K39-215, A61P31-14, A61P1-12
【公開號】CN104667296
【申請?zhí)枴緾N201510058424
【發(fā)明人】黃小波, 曹三杰, 陳杰, 文心田, 梁恩濤, 文翼平, 伍銳, 張雨迪, 段素芬, 朱書權(quán)
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月4日