一種預防豬流行性腹瀉疾病的疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種預防豬流行性腹瀉疾病的疫苗。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉疾病（Porcine epidemic diarrhea, PED)的病 原，該病以產(chǎn)房1-7日齡仔豬淡黃色水樣腹瀉、嚴重脫水為主，剖檢可見仔豬腸道內(nèi)脹氣、 有黃色乳凝塊。PEDV主要通過糞-口途徑傳播，產(chǎn)房仔豬通過消化道攝入病毒后，病毒主要 入侵空腸和回腸部位小腸黏膜上皮細胞，并開始病毒復制。PEDV的感染導致上皮細胞膜表 面的雙糖酶（乳糖酶、蔗糖酶、麥芽糖酶）、氨肽酶、堿性磷酸酶的活性下降；同時，腸絨毛上 皮細胞正常結(jié)構(gòu)破壞并發(fā)生細胞破碎，造成腸絨毛萎縮，腸道表面積減少，從而導致小腸消 化不良、吸收不良等機能障礙，誘發(fā)仔豬發(fā)生腹瀉并脫水。
[0003] PEDV最早在英國發(fā)現(xiàn)，并流行于歐洲從上世紀八十年代以后，中國、日本、韓國也 開始有所報導。2010年至今，該病已廣泛流行于中國、韓國、泰國、美國等國。該病對產(chǎn)房仔 豬極高的發(fā)病率和致死率、較高的治療成本及防控成本，以及病毒基因發(fā)生變異造成強毒 株的出現(xiàn)，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。
[0004] 隨著PEDV分子生物學研究的深入，PEDV免疫機理基本清楚，屬于典型的局部黏膜 免疫為主，存在于血清中PEDV IgG不能提供有效保護，而腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗 體（SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔豬通過初乳來獲得母源SIgA，從而產(chǎn)生對流行性腹瀉的被 動免疫保護。
[0005] 目前大多都是傳統(tǒng)型滅活苗和弱毒苗，但是它存在毒力返強及散毒的風險，需要 改進。為了研制出更為安全、高效、成本低廉、保存和使用方法簡易的豬流行性腹瀉疫苗，人 們開始利用基因工程手段開發(fā)黏膜免疫疫苗，以期達到進一步預防和控制該病的目的。如， 徐麗麗等構(gòu)建了可表達PEDV S蛋白COE區(qū)域、SD區(qū)域的減毒沙門氏菌重組疫苗，其包含的 抗原基因長，菌株穩(wěn)定性越差，同時其包含crp毒力基因，安全性難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的重組菌株。
[0007] 本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌在制備預防豬流 行性腹瀉疾病的藥物中的用途。
[0008] 目的基因 S499_789核昔酸序列（SEQ ID NO :1):
[0009] Gttactttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt
[0010] cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt
[0011] gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat
[0012] gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg
[0013] tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt
[0014] tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca
[0015] aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt
[0016] atgactctgg atgtgtgtac caagtatact atctatggct ttaaaggtga gggtattatt
[0017] acccttacaa attctagcat tttggcaggt gtttattata catctgattc tggacagttg
[0018] ttagccttta agaatgtcac tagtggtgct gtttattctg tcacgccatg ttctttttca
[0019] gagcaggctg catatgttaa tgatgatata gtgggtgtta tttctagttt gtctaactcc
[0020] acttttaaca atactaggga gttgcctggt ttcttctacc attctaatga cggctccaat
[0021] tgtacagagc ctgtgttggt gtatagtaac ataggtgttt gtaaatctgg cagtattggc
[0022] tatgttccat ctcagtatgg ccaagtcaag attgcaccca cggttactgg gaatattagt
[0023] attcccacca actttagtat gagtatt
[0024] 對應的 S499_789氨基酸序列（SEQ ID NO :2):
[0025] VKLVKAKARGPRQAGICEVRYTSLVVGSTTKVVSKRVENANVNLVVVDEDVTLNTTGRTVVVDGLAFFE SDGFYRHLADADWIEHPVYKSACELKPVroCDPIPDFPLPVAASVAELCVQTDLLLKNYNTPYKTYSCWRGDKCC ITCTLQFKAPSYVEDAVNFVDLCTKNIGTAGFHEFYITAHEQQDLQGFLTTCCTMSGFECFMPTIPQCPAVLEEIDG GSIWRSFITGLNTMWDFCKRLKVSFGLDGIVVTVARKFKRLGALLAEMYNTYLSTVVENLVLAGVSFK
[0026] 優(yōu)選地，所述重組沙門氏菌包含攜帶有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的重組 pVAXl質(zhì)粒。
[0027] 其中，所述藥物包含致免疫有效量的重組沙門氏菌。
[0028] 本發(fā)明疫苗它是由包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌和藥學上可 接受的輔料或者載體制備而成。
[0029] 優(yōu)選地，所述重組沙門氏菌包含攜帶有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的重組 pVAXl質(zhì)粒。
[0030] 優(yōu)選地，所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或防腐劑。
[0031] 優(yōu)選地，所述佐劑為霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素或大腸桿菌不耐熱腸毒素 B 單位。
[0032] 優(yōu)選地，所述防腐劑為硫柳汞。
[0033] 前述的疫苗在制備預防豬流行性腹瀉疾病的藥物中的用途。
[0034] 優(yōu)選地，所述的防豬流行性腹瀉疾病的藥物是口服制劑，通過口服的方式給藥。
[0035] 在研究過程中，發(fā)明人根據(jù)經(jīng)驗選擇S蛋白的第499-789段基因片段，制備得到了 免疫原性非常強的重組菌株，其產(chǎn)生的針對豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體高于滅活 疫苗，可以有效預防豬流行性腹瀉疾病，取得了意料不到的技術效果。
[0036] 本發(fā)明重組沙門氏菌免疫豬后，可以產(chǎn)生大量針對豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA 抗體，對豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉疾病有良好的保護作用，本發(fā)明疫苗中包含的 SEQ ID N0:1所示核苷酸序列短，穩(wěn)定性好，不包含crp毒力基因，安全性好，臨床應用前景 優(yōu)良。
[0037] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0038] 圖 I S499_789基因擴增。M :DNA Marker III ;1，2S 499_789基因擴增；
[0039] 圖 2 pMD19-T-S499_789的鑒定。M :DNA Marker III ;1:S 499_789基因擴增； 2:pMD19-T-S499