專利名稱：葡萄球菌屬的趨化性抑制蛋白(chips)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于治療炎癥反應(yīng)的新蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種純化所述蛋白質(zhì)的方法。最后，本發(fā)明涉及一個篩選試驗，應(yīng)用該篩選試驗可檢測類似蛋白質(zhì)。
炎癥反應(yīng)是一種很普遍的過程，其中，防御細(xì)胞奔向一個感染源并在此處保證消滅病原。在這里釋放不同的介體，它們有助于消滅作用但還產(chǎn)生炎癥?？梢詤^(qū)別急性炎癥(例如膿毒)和潛伏的慢性炎癥(例如風(fēng)濕癥)。抵抗力降低了的人更經(jīng)常而且更嚴(yán)重地出現(xiàn)急性炎癥(例如在艾滋病的情況下)。
細(xì)菌感染導(dǎo)致趨化因子的形成，趨化因子保證白細(xì)胞來到感染源。趨化物質(zhì)以梯度形式存在，白細(xì)胞沿著該梯度定向運(yùn)動。趨化劑的來源可能是細(xì)菌自身。這些趨化劑例如是具有末端甲?；男〉鞍踪|(zhì)，例如fMLP(N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸)。其它趨化劑有活化補(bǔ)體因子(過敏毒素C3a和C5a)，白三烯[例如LTB4(白三烯B4)和PAF(血小板活化因子)，以及由不同類別的細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子，例如白細(xì)胞介素-8(單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)，RANTES(活化時調(diào)節(jié)的、正常T-細(xì)胞表達(dá)和分泌的)，eotaxin,MCP(單核細(xì)胞趨化蛋白)，MIP(巨噬細(xì)胞炎性蛋白)和其它趨化因子。
某些趨化因子僅僅對確定類別的白細(xì)胞是特異性的，其它的則影響很多細(xì)胞。趨化因子的受體被細(xì)分為兩大類CC受體和CXC受體，它們都屬于蛇根堿(跨膜7次的受體)。蛇根堿是視紫紅質(zhì)樣的GTP結(jié)合蛋白連接的受體。
趨化細(xì)胞因子的總科(趨化因子)的特征在于4個保守半胱氨酸。根據(jù)前兩個半胱氨酸的相對位置可區(qū)別兩科CXC或α-趨化因子與CC或β-趨化因子。CXC趨化因子尤其對粒細(xì)胞有活性，而CC趨化因子則活化寬范圍的白細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹枝狀細(xì)胞)。該科趨化因子和典型性趨化劑(例如fMLP和C5a)結(jié)合并活化蛇根堿。
趨化因子的中和已在實驗上被應(yīng)用了，具體地說，發(fā)現(xiàn)了施用抗IL-8的抗體在一些動物實驗炎癥模型中有效。此外，最近證實了一些趨化因子受體(尤其CCR5和CXCR4)在HIV感染細(xì)胞中起輔因子的作用。就HIV的T細(xì)胞營養(yǎng)株來說，CXCR4已被鑒定為輔因子，就單主寄生株來說，這是CCR5。用抗體或配體封阻這些受體抑制了體外模型中的HIV感染。此外，發(fā)現(xiàn)了具有CCR5受體的遺傳性變型(包括32個堿基對缺失)的人們能抗HIV感染。
除了趨化性的誘導(dǎo)、白細(xì)胞的定向遷移之外，低濃度的一些趨化因子也是其它白細(xì)胞功能的有效激活劑或引物。所以，希望實現(xiàn)趨化因子的封阻，于是，可以抑制炎癥反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的目的是提高一種具有炎癥-抑制特性、用于治療急性和慢性炎癥反應(yīng)和HIV的新治療劑。
在導(dǎo)致本發(fā)明的研究過程中，在生長的金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(S.aueus)]胞外培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)能封阻不同的趨化因子受體。將不同的細(xì)胞與培養(yǎng)基保溫導(dǎo)致一些趨化因子受體的表達(dá)[既包括典型性趨化劑(例如fMLP和C5a)的受體在粒細(xì)胞上的表達(dá)又包括CXCR4和CCR5受體在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的表達(dá)]大為減少。受體表達(dá)的減少與趨化性相對于趨化因子的大為降低有關(guān)，也與HIV的感染減小有關(guān)。
在生長的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物上清液中表現(xiàn)了該蛋白質(zhì)的活性。然而，按本發(fā)明，還通過一些配體染料柱純化了所述活性蛋白質(zhì)。首先在所謂的“黃色柱”[“活性黃86”配體染料交聯(lián)的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma)]上進(jìn)行了預(yù)純化，接著在吸附層析柱[所謂的“綠色柱”(“活性綠19”配體染料交聯(lián)的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma))]和DNA柱[DNA纖維素(Pharmacia)]上進(jìn)行。后兩種柱可以互換。所述DNA柱除去與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相同分子量的污染物。所述吸附層析柱濃縮蛋白質(zhì)并且對該蛋白質(zhì)是選擇性的。最后，還通過凝膠過濾和任選濃縮的方法進(jìn)行了后純化。在凝膠過濾中，選定了分子量約為17kD的蛋白質(zhì)。這就是本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
所述純化方法的每一步都可通過檢測不同柱的流過物質(zhì)或洗出液的活性來監(jiān)測。這是通過監(jiān)測流過物質(zhì)或洗出液是否能防止fMLP與粒細(xì)胞結(jié)合而進(jìn)行的。實施例中給出了詳盡的試驗方案。
通過微量測序測定了純化了的蛋白質(zhì)的前(N-末端)15個氨基酸。在圖4中給出了該序列。序列分析表明，未發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的或真核生物的氨基酸序列的同源性。所以，這是一種新的、獨特的蛋白質(zhì)。
由于該蛋白質(zhì)是從金黃色葡萄球菌的上清液中分離的并且給出趨化性的抑制作用，所以，本文還將所述蛋白質(zhì)稱為“CHIPS”得自金黃色葡萄球菌的趨化性抑制蛋白。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及CHIPS蛋白質(zhì)，其特征在于a)約為17kD的分子量；b)圖4中給出的N-末端氨基酸序列；以及c)一種生物活性，它包括在實施例1中描述的試驗中防止fMLP與粒細(xì)胞結(jié)合的能力，及其生物活性片段。
CHIPS蛋白質(zhì)影響白細(xì)胞對化學(xué)引誘物源(例如細(xì)菌)的趨化性。發(fā)現(xiàn)了按本發(fā)明，白細(xì)胞(尤其是粒細(xì)胞)上至少兩種受體(fMLP和C5a)的數(shù)量被下調(diào)了。該減量調(diào)節(jié)是可逆的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療組合物，它包含合適的賦形劑和CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段。所述組合物可被用于治療急性和慢性炎癥反應(yīng)和HIV感染。所述蛋白質(zhì)保證封阻提供白細(xì)胞向趨化物質(zhì)運(yùn)動的受體。
本發(fā)明也涉及用于治療急性和慢性炎癥反應(yīng)和HIV感染的CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段，以及CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段在生產(chǎn)用于治療所述癥狀的治療制劑方面的應(yīng)用。
按本發(fā)明的后續(xù)方面，提供了用于治療葡萄球菌(Staphylococcus)感染的、抗CHIPS蛋白質(zhì)和/或其片段的抗體。所述蛋白質(zhì)將封阻CHIPS或其片段的活性，所以再起動被細(xì)菌終止的趨化性，于是恢復(fù)了對細(xì)菌的自然防御。
所述治療組合物(按本發(fā)明，它包含作為活性組分的CHIPS或抗它的抗體)特別希望被胃腸外(更具體地說，靜脈內(nèi))施用。所述治療組合物可通過將CHIPS與適合靜脈內(nèi)施用的、藥物上可接受的賦形劑復(fù)合(即，混合、溶解等)而制備。治療組合物中活性組分的濃度可在0.001％～100％之間變化，取決于治療的性質(zhì)和施藥方法。施用的活性組分劑量同樣取決于施藥途徑和用途，但例如可在0.001～1mg/kg體重、優(yōu)選在1μg～100μg/kg體重的范圍內(nèi)變化。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種純化CHIPS蛋白質(zhì)的方法，該方法包括a)將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物上清液或預(yù)純化后從其獲得的液體導(dǎo)引經(jīng)過吸附層析柱；b1)接著將吸附層析柱的流過物質(zhì)首先導(dǎo)引經(jīng)過親和層析柱，再將親和層析柱的洗出液導(dǎo)引經(jīng)過DNA柱；或者b2)接著將吸附層析柱的流過物質(zhì)首先導(dǎo)引經(jīng)過DNA柱，再將DNA柱的流過物質(zhì)導(dǎo)引經(jīng)過吸附層析柱；c)將步驟b)的最后那個柱的流過物質(zhì)或洗出液導(dǎo)引流過凝膠過濾柱并選擇分子量約為17kD的級分。
“流過物質(zhì)”在本文應(yīng)被理解為那部分裝填的液體，即，該裝填的液體中具有從柱中流出未另外處理的組分。該流過物質(zhì)中的組分不與柱結(jié)合?！跋闯鲆骸睉?yīng)被理解為洗脫后從柱中流出的液體，它包含得自裝填到柱上的液體的、與柱結(jié)合并在洗脫后又從柱中釋放的組分。在本發(fā)明的方法中，吸附柱結(jié)合裝填的培養(yǎng)基或預(yù)純化后從其中獲得的液體的大部分組分。所述親和柱結(jié)合CHIPS和Snase(葡萄球菌核酸酶)，Snase具有與CHIPS相同的分子量以及分別對于親和柱、吸附柱相同的親和性(或其缺乏)。所述DNA柱只結(jié)合Snase，于是將它與CHIPS分離。
如果第一個親和層析柱是所謂的配體染料“黃”柱，第二個親和層析柱是所謂的配體染料“綠”柱，并且，所述DNA柱是DNA纖維素柱，那么，本方法特別奏效。
最后，本發(fā)明還涉及一種測定CHIPS蛋白質(zhì)或具有類似功能的蛋白質(zhì)的活性的測定或分析方法，該方法包括a)在第一個區(qū)室引入容許趨化性的標(biāo)記細(xì)胞(尤其是白細(xì)胞)；b)將一種或多種化學(xué)引誘物引入通過至少能滲透細(xì)胞的膜與第一個區(qū)室隔離的第二個區(qū)室；c)將需測試的蛋白質(zhì)置于第一個區(qū)室中；d)在一定的時間后測定第二個區(qū)室中的標(biāo)記量。
細(xì)胞能朝化學(xué)引誘物的方向運(yùn)動通過所述膜。CHIPS或類似蛋白質(zhì)的存在通過鈍化化學(xué)引誘物的受體而阻止這種遷移。該測試還能更普遍地用于測定其它物質(zhì)的趨化性調(diào)節(jié)活性。那么，方法步驟是相同的。
按這種方式發(fā)現(xiàn)與CHIPS類似的蛋白質(zhì)能經(jīng)歷與CHIPS相同的純化，于是，能測定這二者之間的同源性。
本發(fā)明的CHIPS蛋白質(zhì)還見于表皮葡萄球菌(S.epidermis)和金黃色葡萄球菌中。
在下文的實施例中，除了描述CHIPS對不同的白細(xì)胞上不同趨化因子受體的活性的測試與T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中HIV感染的抑制作用的測試之外，還描述了這種方法其中，經(jīng)過配體染料親和層析與吸附層析、凝膠過濾和濃縮這些步驟從金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物上清液分離CHIPS，給出這些實施例只是為了闡述而決不是以任何方式限制本發(fā)明。
在實施例中參考了下列圖

圖1示出了粒細(xì)胞與一系列濃度葡萄球菌上清液(SaS)保溫以及對fMLP受體和C5a受體的影響。
圖2示出了一系列濃度SaS對于粒細(xì)胞向fMLP的趨化性的影響。
圖3示出了凝膠過濾柱的級分與光密度(OD)(菱形線)和fMLP受體分析中以抑制百分?jǐn)?shù)表示的活性(條形線)。
圖4示出了CHIPS的前15個(N-末端)氨基酸的序列(預(yù)計總共125個中的)。
圖5a示出了粒細(xì)胞與一系列濃度純化了的CHIPS保溫以及對fMLP受體和C5a受體的影響。
圖5b示出了粒細(xì)胞與一系列濃度純化了的CHIPS保溫以及對定向遷移至fMLP的影響。
圖6示出了CXCR4在淋巴細(xì)胞上的表達(dá)。
將2升的SaS導(dǎo)引經(jīng)過前后偶聯(lián)的三個柱(25ml)。這三個柱相繼是“活性黃86”配體染料交聯(lián)的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma)、DNA纖維素(Pharmacia)和“活性綠19”配體染料交聯(lián)的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma)。洗滌后，用2M NaCl洗脫所述綠(活性綠19)柱，匯集活性級分，用聚乙二醇濃縮10x。在Pharmacia Superdex-200凝膠過濾柱上分離濃縮后的物質(zhì)，然后匯集活性級分，濃縮，透析并凍干。將最終純化的物質(zhì)重懸浮于少量無菌水中，特別用于微量測序分析。
為此，將一個樣品在12.5％SDS-PAGE(Mini-ProteanⅡ；BioRad)上分析，再通過Mini Trans-Blotter(BioRad)轉(zhuǎn)移到Immobilon-PPVDF膜(Millipore)上。用考馬斯藍(lán)將蛋白質(zhì)染色，切除約17kD的蛋白質(zhì)。按自動Edman操作法(其中，應(yīng)用了Perkin Elmer/AppliedBiosystems 476A)測定該樣品的N-末端氨基酸序列。通過HPLC分析了氨基酸衍生物。1.2fMLP與粒細(xì)胞的結(jié)合從健康志愿者的肝素化血液分離了粒細(xì)胞，即，按標(biāo)準(zhǔn)方法[Troelstra等，白細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Leukocyte Biol.)61:173～178(1997)]經(jīng)過Histopaque-Ficoll梯度分離的。用無菌水溶解粒細(xì)胞級分中的殘余紅細(xì)胞(達(dá)30sec)，在恢復(fù)等滲性后洗滌。最后將細(xì)胞重懸浮于含0.05％人血清白蛋白的RPMI(Gibco)(RPMI/HSA)中。
在Falcon管中，在37℃下將50μl細(xì)胞(5×106個細(xì)胞/ml)與50μl含CHIPS的原料(SaS，純化的CHIPS或柱級分)保溫30min。將細(xì)胞置于冰上，用RPMI/HSA洗滌一次(在4℃下)，重懸浮于50μl新鮮培養(yǎng)基中。然后，添加5μl BODIPY標(biāo)記的fMLP(最終濃度0.1μM；Molecular Probes)，將樣品在冰上保溫60分鐘。洗滌后，用流式細(xì)胞器(FACScan；Beeton Dickinson)分析與粒細(xì)胞結(jié)合的熒光fMLP。用LysisⅡ軟件計算5000個粒細(xì)胞的平均熒光值。1.3趨化性為了測定定向遷移，應(yīng)用了Transwel系統(tǒng)(Costar)，它包括由3μm聚碳酸酯膜隔離的一個上區(qū)室和一個下區(qū)室。用BCECF[2-羧乙基-5-(和-6-)羧基熒光素；Molecular Probes](一種進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的熒光標(biāo)記)標(biāo)記粒細(xì)胞。在22℃下將細(xì)胞(5×106個)與3μMBCECF-AM[2-羧乙基-5-(和-6-)羧基熒光素的乙酰甲基酯]保溫20分鐘，接著，洗滌三次，以5×106個細(xì)胞/ml重懸浮于RPMI/HSA中。將100μl細(xì)胞和所需量的CHIPS蛋白質(zhì)引入Transwel系統(tǒng)的上區(qū)室，將整個區(qū)室懸浮于標(biāo)準(zhǔn)24孔微量滴定板(Costar)的孔中。每個孔含有600μl RPMI/HSA(添加了或未添加測試用的化學(xué)引誘物)。所述化學(xué)引誘物是重組C5a(Sigma)、重組白細(xì)胞介素-8(Pepro Tech)、血小板活化因子-16(PAF-16；Calbiochem)或fMLP(Sigma)。在37℃下保溫60分鐘后，從孔中移出所述Transwel容器，在CyoFluorⅡ(PerSeptiveBiosystems)中分析微量滴定板的熒光。熒光度是遷移穿過了膜的粒細(xì)胞數(shù)的直接量度，以添加的細(xì)胞數(shù)的熒光百分?jǐn)?shù)表示熒光度。結(jié)果圖1示出了粒細(xì)胞與一系列濃度葡萄球菌上清液(SaS)保溫對fMLP受體和C5a受體的影響?？梢奀5A受體和fMLP受體的急劇減量調(diào)節(jié)。
圖2示出了向引誘劑(fMLP)的趨化性(細(xì)胞運(yùn)動)被強(qiáng)烈抑制了。
圖3示出了最強(qiáng)烈抑制活性處于240和280ml之間的洗出范圍內(nèi)。該體積級分在這里相應(yīng)于約17kD的蛋白質(zhì)。
圖4示出了CHIPS的前35個(N-末端)氨基酸的序列(預(yù)計總共125個中的)?；谠撔蛄?，按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)[尤其按De Haas等在免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)161:3607～3615(1998)以及Alonso de Velasco等在傳染與免疫(Infect.Immun.)62:799～808(1994)中描述的那樣]制備了所述前15個氨基酸的合成肽。在兔中產(chǎn)生的抗該肽的抗體(按生產(chǎn)商Pierce的指示偶聯(lián)到KLH上，用弗氏完全佐劑進(jìn)行皮下免疫，接著用弗氏不完全佐劑強(qiáng)化注射)(例如Alonso de Velasco等在上文描述的那樣)中和了CHIPS的活性。
粒細(xì)胞的平均熒光值是細(xì)胞表面上受體量的量度。以同對比緩沖劑保溫的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示扣除背景值之后的相對表達(dá)量。結(jié)果圖5a示出了由于純化了的CHIPS,C5a受體和fMLP受體二者也從細(xì)胞表面消失了。
圖5b示出了粒細(xì)胞與一系列濃度純化了的CHIPS保溫以及對定向遷移至fMLP的影響?？梢?，向fMLP的趨化性(細(xì)胞運(yùn)動)被純化了的CHIPS完全地而且劑量依賴性地抑制了。
權(quán)利要求
1．葡萄球菌屬的趨化性抑制蛋白質(zhì)(CHIPS蛋白質(zhì))，其特征在于a)約為17kD的分子量；b)圖4中給出的N-末端氨基酸序列；以及c)一種生物活性，它包括在實施例1描述的試驗中防止fMLP與粒細(xì)胞結(jié)合的能力，及其生物活性片段。
2．用作生物活性物質(zhì)的、權(quán)利要求1的CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段。
3．用作藥物的、權(quán)利要求1或2的CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段。
4．用于治療急性和慢性炎癥反應(yīng)和HIV感染的、權(quán)利要求1的CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段。
5．權(quán)利要求1的CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段在生產(chǎn)用于治療急性和慢性炎癥反應(yīng)和HIV感染的治療制劑方面的應(yīng)用。
6．抗CHIPS蛋白質(zhì)和/或其片段的抗體。
7．用于治療葡萄球菌屬感染的權(quán)利要求6的抗體。
8．治療組合物，它包含合適的賦形劑和CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段。
9．用于治療急性和慢性炎癥反應(yīng)和HIV感染的、權(quán)利要求8的組合物。
10．治療組合物，它包含合適的賦形劑和一種或多種抗CHIPS蛋白質(zhì)和/或其生物活性片段的抗體。
11．純化CHIPS蛋白質(zhì)的方法，它包括a)將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)物上清液或預(yù)純化后從其獲得的液體導(dǎo)引經(jīng)過吸附層析柱；b1)接著將吸附層析柱的流過物質(zhì)首先導(dǎo)引經(jīng)過親和層析柱，再將親和層析柱的洗出液導(dǎo)引經(jīng)過DNA柱；或者b2)接著將吸附層析柱的流過物質(zhì)首先導(dǎo)引經(jīng)過DNA柱，再將DNA柱的流過物質(zhì)導(dǎo)引經(jīng)過吸附層析柱；c)將步驟b1)最后那個柱的流過物質(zhì)或步驟b2)最后那個柱的洗出液導(dǎo)引流過凝膠過濾柱并選擇分子量約為17kD的級分。
12．權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述親和層析柱是所謂的配體染料“黃”柱，所述吸附層析柱是所謂的配體染料“綠”柱，并且，所述DNA柱是DNA纖維素柱。
13．測定CHIPS蛋白質(zhì)或具有類似功能的蛋白質(zhì)的活性的方法，該方法包括a)在第一個區(qū)室引入容許趨化性的標(biāo)記細(xì)胞，尤其是白細(xì)胞；b)將一種或多種化學(xué)引誘物引入通過至少能滲透細(xì)胞的膜與第一個區(qū)室隔離的第二個區(qū)室；c)將需測試的蛋白質(zhì)置于第一個區(qū)室中；d)在一定的時間后測定第二個區(qū)室中的標(biāo)記量。
14．測定物質(zhì)的趨化性調(diào)節(jié)活性的方法，該方法包括權(quán)利要求13的方法步驟，其中，需測試的物質(zhì)替代步驟c)中的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的、具有免疫調(diào)節(jié)特性的、細(xì)菌金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療組合物的生產(chǎn),該組合物可作為一般性的炎癥抑制劑和用于治療艾滋病,本發(fā)明還涉及抗CHIPS的抗體在治療葡萄球菌屬感染方面的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/04GK1309662SQ99808416
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月10日
發(fā)明者J·A·G·范斯特里吉普, C·P·M·范凱瑟爾 申請人:亞利制藥有限公司