專利名稱：人溶血磷脂酶基因(cbfblh05)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸、由其編碼的多肽和這些多核苷酸和多肽在治療和可能可以用于治療的其激動(dòng)劑、拮抗劑和/或抑制劑化合物的鑒定中的用途以及這些多肽和多核苷酸的生產(chǎn)。發(fā)明背景尋找藥物的方法正經(jīng)歷著根本性的變化，新的方法中包括“功能基因組學(xué)”，即基于基因組或基因的高流通量生物學(xué)。該方法正在迅速取代原來基于“位置克隆”的方法。首先鑒定表現(xiàn)為生物功能或遺傳病的表型，然后根據(jù)其遺傳圖譜位置逆向?qū)ふ矣嘘P(guān)基因。
功能基因組學(xué)主要依賴各種生物信息學(xué)工具，由現(xiàn)有的多個(gè)分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中鑒定可能的目的基因序列。這就需要不斷鑒定和表征其他基因及其相關(guān)多肽/蛋白質(zhì)，作為尋找藥物的靶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及CBFBLH05，特別是CBFBLH05多肽和多核苷酸和重組材料以及它們的生產(chǎn)方法。另一方面，本發(fā)明涉及利用這些多肽和多核苷酸的方法，包括治療肝病、癌癥、自身免疫病和腎病(以下稱為本發(fā)明限定疾病)等疾病。再一方面，本發(fā)明涉及利用本發(fā)明提供的材料鑒定激動(dòng)劑和拮抗劑/抑制劑的方法以及利用鑒定的化合物治療與CBFBLH05不平衡相關(guān)的癥狀。最后，本發(fā)明涉及檢查與CBFBLH05活性或水平異常相關(guān)的疾病的診斷試驗(yàn)。發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明涉及CBFBLH05多肽。這些肽包括含有以下氨基酸序列的分離多肽，所述氨基酸序列與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％，最優(yōu)選同一性為至少97-99％。這些多肽還包括含有序列2的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的肽還包括以下分離的多肽，其氨基酸序列與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％，最優(yōu)選同一性為至少97-99％。這些多肽還包括序列2的多肽。
本發(fā)明的多肽還包括由含有序列1的多核苷酸編碼的分離多肽。
本發(fā)明的多肽引起人們的關(guān)注是因?yàn)槿巳苎字缚寺∽阅殠а煅婕?xì)胞CD34+細(xì)胞，它具有兩種表達(dá)形式短鏈型和長鏈型。在CD34+細(xì)胞中主要是短鏈型。這些特性以下稱為“CBFBLH05活性”或“CBFBLH05多肽活性”或“CBFBLH05生物活性”。這些活性還包括所述CBFBLH05多肽的抗原和免疫原活性，特別是序列2的多肽的抗原和免疫原活性。優(yōu)選，本發(fā)明的多肽具有至少一種CBFBLH05的生物活性。
本發(fā)明的多肽可以是“成熟”蛋白的形式，也可以是較大蛋白如融合蛋白的一部分。通常包括附加氨基酸序列較為有利，附加氨基酸序列包括分泌或前導(dǎo)序列，原序列，幫助純化的序列如聚組氨酸殘基，或重組生產(chǎn)過程中有助于穩(wěn)定的附加序列。
本發(fā)明也包括上述多肽的變體，即參照物中保守氨基酸發(fā)生置換的多肽，保守置換是指一個(gè)殘基被具有類似特性的其他氨基酸殘基置換。典型的這種置換包括Ala，Val，Leu和Ile之間的置換；Ser和Thr之間的置換；酸性殘基Asp和Glu之間的置換；Asn和Gln之間的置換；堿性殘基Lys和Arg之間的置換；或芳香族殘基Phe和Tyr之間的置換。特別優(yōu)選的是其中置換、缺失或增加幾個(gè)、5-10個(gè)、1-5個(gè)1-3個(gè)、1-2個(gè)或1個(gè)氨基酸或這些方式的組合的變體。
本發(fā)明的多肽可以通過任何合適的方式制備。這些多肽包括分離的天然存在的多肽，重組生產(chǎn)的多肽，合成生產(chǎn)的多肽，或這些方法組合生產(chǎn)的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域廣為人知。
本發(fā)明另一方面涉及CBFBLH05多核苷酸。這些多核苷酸包括含有以下核苷酸序列的分離多核苷酸，所述核苷酸序列編碼的多肽與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％。多肽同一性為至少97％是高度優(yōu)選的，多肽同一性為至少98-99％更高度優(yōu)選，多肽同一性為至少99％是最優(yōu)選的。這些多核苷酸包括含有編碼序列2的多肽的序列1中的核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸還包括含有以下核苷酸序列的分離的多核苷酸，上述核苷酸序列與編碼序列2氨基酸序列的核苷酸序列整個(gè)編碼區(qū)的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％。同一性為至少97％的多核苷酸是高度優(yōu)選的，同一性為至少98-99％的多核苷酸更高度優(yōu)選，同一性為至少99％的多核苷酸是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的多核苷酸還包括含有以下核苷酸序列的分離的多核苷酸，上述核苷酸序列與序列1的整個(gè)核苷酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％。同一性為至少97％的多核苷酸是高度優(yōu)選的，同一性為至少98-99％的多核苷酸更高度優(yōu)選，同一性為至少99％的多核苷酸是最優(yōu)選的。這些多核苷酸包括含有序列1的多核苷酸的多核苷酸和序列1的多核苷酸。
本發(fā)明也提供上述多核苷酸的互補(bǔ)多核苷酸。
序列1的核苷酸序列與大鼠溶血磷脂酶基因同源(H.Sugimoto，J.Biol.Chem.，1996271(13)7705-7711)。序列1的核苷酸序列為cDNA序列，含有一個(gè)多肽編碼序列(核苷酸6-647)，編碼序列2的214氨基酸的多肽。編碼序列2多肽的核苷酸序列可以與序列1中的多肽編碼序列相同，或者不同，而是由于遺傳密碼的豐余(簡并)形成的，但也編碼序列2的多肽。序列2的多肽結(jié)構(gòu)上與該家族的其他蛋白相關(guān)，與大鼠磷脂酶同源和/或結(jié)構(gòu)相似(H.Sugimoto，J.Biol.Chem.，1996271(13)7705-7711)。
預(yù)期本發(fā)明優(yōu)選的多肽和多核苷酸具有其同源多肽和多核苷酸類似的生物功能/特性。并且，本發(fā)明的優(yōu)選多肽和多核苷酸具有至少一種CBFBLH05活性。
本發(fā)明的多核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選技術(shù)從cDNA文庫中獲得，該文庫使用表達(dá)序列標(biāo)記(EST)分析由來自人臍帶血細(xì)胞的mRNA衍生(Adams，M.K.，et al.，Science(1991)2521651-1656；Adams，M.D.，et al.，Nature，(1992)355632-634；Adams，M.D.，et al.，Nature(1995)377 Supp3-174)。本發(fā)明的多核苷酸也可以來自天然來源如基因組DNA文庫，或可以使用眾所周知的市售技術(shù)合成。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用于重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽時(shí)，該多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列本身；成熟多肽編碼序列與其他編碼序列框內(nèi)融合的序列，其他編碼序列例如前導(dǎo)或分泌序列、前或原或前原蛋白序列或其他融合多肽部分的編碼序列。例如可以編碼幫助融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明這一方面的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是6-組氨酸肽或HA標(biāo)記，前者以pQE載體提供(Qiagen，Inc.)，有關(guān)論述參見Gentz et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86821-824。多核苷酸也可以含有非編碼的5＇或3＇序列，如轉(zhuǎn)錄、非翻譯序列，剪切和聚腺苷酸化信號，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和穩(wěn)定mRNA的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案包括編碼多肽變體的多核苷酸，所述變體包括序列2的氨基酸序列(序列2)，其中置換、缺失或增加幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、1-2或1個(gè)氨基酸殘基或是這些方式的組合。
本發(fā)明的多核苷酸與序列1的核苷酸序列等同或足夠等同，因此可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針或核酸擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)的引物，以分離編碼本發(fā)明多肽的全長cDNA和基因組克隆，也可以分離與序列1具有高序列相似性的其他基因(包括編碼除人以外的物種的同源物和直向同源物的基因)的cDNA和基因組克隆。一般這些核苷酸序列與參照物序列的同一性為70％、優(yōu)選同一性為80％，更優(yōu)選同一性為90％，最優(yōu)選同一性為95％。探針或引物一般包括至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸，也可以包括至少50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的探針為30到50個(gè)核苷酸。
獲得編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸包括除人以外的物種的同源物或直向同源物的方法包括以下步驟用具有序列1或其片段的標(biāo)記探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選合適的文庫；分離含有所述多核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。這些雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條件包括在如下溶液中42℃溫育過夜，然后在約65℃用0.1×SSC洗滌濾膜，所述溶液包括50％甲酰胺，5×SSC(150 mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性剪切的鮭精DNA。因此，本發(fā)明也包括通過用具有序列1或其片段的序列的標(biāo)記探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選合適的文庫獲得的多核苷酸。
技術(shù)人員可以認(rèn)識到，在多種情況下，分離的cDNA序列是不完整的，其中編碼多肽的區(qū)域在cDNA的5＇末端被切短。這是由于逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，該酶本身具有較低的持續(xù)合成能力(聚合反應(yīng)過程中酶保持附著于模板的能力的度量)，在第1條cDNA鏈合成過程中不能獲得mRNA模板的完整DNA拷貝。
獲得全長cDNA或延長短cDNA的方法現(xiàn)有幾種是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如基于cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)法的方法(參見例如Frohman et al.，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最新的技術(shù)改進(jìn)如MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)大大簡化了長鏈cDNA的搜尋工作。在MarathonTM技術(shù)中，由自選定組織抽提的mRNA制備cDNA，在其兩端連接“銜接子”序列。然后使用基因特異性和銜接子特異性的寡核苷酸引物組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)，擴(kuò)增cDNA“缺失”的5＇端。使用“嵌套”引物重復(fù)PCR反應(yīng)，所謂嵌套引物是指設(shè)計(jì)成在擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)退火的引物(通常為在銜接子序列3＇下游退火的銜接子特異性引物和在已知基因序列5＇上游退火的基因特異性引物)。通過DNA測序分析該反應(yīng)產(chǎn)物，將該產(chǎn)物直接與現(xiàn)有cDNA連接獲得完整序列，或使用新序列信息設(shè)計(jì)5＇引物另外進(jìn)行全長PCR，從而構(gòu)建全長cDNA。
本發(fā)明的重組多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法由含有表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程改造的宿主細(xì)胞制備。因此，本發(fā)明另一方面涉及含有本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)遺傳工程改造含有本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。利用衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可用來生產(chǎn)這些蛋白。
為進(jìn)行重組生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程改造含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以通過多種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊中所述的方法實(shí)現(xiàn)，所述實(shí)驗(yàn)手冊如Davis et al.，《分子生物學(xué)基本方法》(1986)和Sambrook et al.，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。優(yōu)選的這些方法包括例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、微注射、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、摩擦轉(zhuǎn)化、粒子轟擊或感染。
合適宿主的代表性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞，如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草桿菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞和曲霉細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和草地夜蛾Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293和Bowes melanoma細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。
可使用多種表達(dá)系統(tǒng)，這些表達(dá)系統(tǒng)包括染色體、附加體和病毒衍生的系統(tǒng)等，例如衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒的載體，和衍生自上述元件組合的載體，所述病毒包括桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，組合載體如衍生自質(zhì)粒和細(xì)菌噬菌體遺傳元件、粘粒和噬菌粒的載體。表達(dá)系統(tǒng)可以含有調(diào)節(jié)和啟動(dòng)表達(dá)的控制區(qū)。一般來說，任何適于在宿主中維持、增殖或表達(dá)多核苷酸的系統(tǒng)或載體均可使用。合適的核苷酸序列可以通過多種已知的常規(guī)技術(shù)插入到表達(dá)系統(tǒng)中，所述技術(shù)可參見例如Sambrook et al.，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》第2版(同上)。為了翻譯的蛋白可以分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)、周質(zhì)空間或胞外環(huán)境，可以向所需的多肽上加入合適的分泌信號。這些信號可以是多肽內(nèi)源的，也可以是外源分泌信號。
如果本發(fā)明的多肽要表達(dá)用于篩選試驗(yàn)，一般優(yōu)選多肽在細(xì)胞表面生成。在這種情況下，細(xì)胞可以在用于篩選試驗(yàn)之前收獲。如果該多肽分泌到培養(yǎng)基中，可以回收培養(yǎng)基以回收和純化多肽；如果在細(xì)胞內(nèi)生成，細(xì)胞首先要裂解，然后回收多肽。
本發(fā)明的多肽可以通過已知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換色譜，磷酸纖維素色譜，疏水相互作用色譜，親和色譜，羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優(yōu)選高效液相色譜用于純化。如果多肽在分離或純化過程中變性，已知的重折疊蛋白的方法可用于恢復(fù)活性構(gòu)象。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽作為診斷試劑的應(yīng)用。檢測特征在于與功能障礙相關(guān)的序列1多核苷酸的基因的突變形式可以提供一種診斷工具，這可以增加或限定一種由于該基因的表達(dá)不足、表達(dá)過量或表達(dá)異常產(chǎn)生的疾病或疾病易感性的診斷。該基因中攜帶突變的個(gè)體可以通過多種技術(shù)在DNA水平上檢測出來。
診斷核酸可以獲自受試者細(xì)胞，如血、尿、唾液、組織活檢樣品或尸檢材料?；蚪MDNA可以直接用來檢測，或在分析之前使用PCR或其他擴(kuò)增技術(shù)酶促擴(kuò)增。RNA或cDNA可以類似方式使用。缺失和插入可以通過與正常基因型相比擴(kuò)增產(chǎn)物的大小變化檢測。點(diǎn)突變可以通過將擴(kuò)增DNA與標(biāo)記的CBFBLH05核苷酸序列雜交來鑒別。完全匹配的序列可以通過RNA酶消化或融解溫度上的差異與錯(cuò)配雙鏈區(qū)分。DNA序列差異也可以通過DNA片段在加入或不加變性劑的凝膠上的電泳遷移率或直接DNA測序來檢測(可參見例如Myers et al.，Science(1985)2301242)。在特定位置的序列變化也可以通過核酸酶保護(hù)試驗(yàn)如RNA酶和S1保護(hù)法或化學(xué)切割法來顯示(可參見Cotton et al.，PNASUSA(1985)854397-4401)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建含有CBFBLH05核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針陣列(array)，以便進(jìn)行例如基因突變的有效篩選。陣列技術(shù)方法廣為人知，適用性廣泛，可用來解決分子遺傳學(xué)中的多種問題，包括基因表達(dá)，遺傳連鎖和遺傳變異性。(參見例如M.Chee et al.，Science，Vol.274，pp610-613(1996)。
診斷試驗(yàn)通過利用上述方法檢測CBFBLH05基因的突變，提供了診斷或確定對本發(fā)明限定疾病的易感性的方法。此外，這些疾病可以通過以下方法診斷確定來自受試者樣品中的多肽或mRNA的水平異常降低或增加。表達(dá)降低或增加可以使用核苷酸定量領(lǐng)域已知的任何方法在RNA水平上確定，所述方法例如核酸擴(kuò)增，包括PCR、RT-PCR、RNA酶保護(hù)、RNA印跡和其他雜交方法。可用于確定來自宿主的樣品中的蛋白如本發(fā)明多肽的水平的試驗(yàn)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些試驗(yàn)方法包括放射免疫試驗(yàn)、競爭結(jié)合試驗(yàn)、蛋白印跡分析和ELISA試驗(yàn)。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及包括以下成分的診斷藥盒(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選序列1的核苷酸序列，或其片段；(b)與(a)中核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選序列2的多肽，或其片段；(d)本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選序列2的多肽的抗體。
應(yīng)當(dāng)理解，在這種藥盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一種主要成分(substantial component)。這種藥盒可用于診斷疾病或?qū)膊〉囊赘行?，所述疾病特別是肝病、癌癥、自身免疫病和腎病等。
本發(fā)明的核苷酸序列對染色體鑒定也有價(jià)值。該序列可以特異靶向一個(gè)個(gè)體染色體上的特定位置并可與其雜交。根據(jù)本發(fā)明染色體相關(guān)序列的作圖是將這些序列與疾病相關(guān)的基因聯(lián)系起來的重要的第一步。一旦序列已經(jīng)被定位在具體的染色體位置，該序列在染色體上的物理位置可以與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。這些數(shù)據(jù)可參見例如V.McKusick，《人類的孟德爾遺傳)》(由Johns Hopkins University Welch Medical Library在線獲得)。定位在同一染色體區(qū)域的基因和疾病之間的關(guān)系可以通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)確定。
受影響和正常個(gè)體中cDNA或基因組序列的差異也可以確定。如果在某些或全部受影響個(gè)體中觀察到某一突變，而在正常個(gè)體中未觀察到該突變，則該突變可能是疾病的病因。
本發(fā)明的多肽或其片段或類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞也可用作免疫原，生成對本發(fā)明的多肽免疫特異性的抗體?！懊庖咛禺愋缘摹痹诒绢I(lǐng)域中表示對本發(fā)明多肽的親和力明顯大于對本領(lǐng)域其他相關(guān)多肽的親和力。
針對本發(fā)明的多肽的抗體可以通過常規(guī)方法向動(dòng)物優(yōu)選非人類的動(dòng)物給藥多肽或含表位片段、類似物或細(xì)胞獲得。為了制備單克隆抗體，可以使用提供連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生成的抗體的任何技術(shù)。實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.and Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)，三瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，ImmunologyToday(1983)472)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，《單克隆抗體和癌癥治療》，pp77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)如美國專利4,946,778所述的技術(shù)也可以改進(jìn)后用來生產(chǎn)本發(fā)明多肽的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠或其他有機(jī)體包括其他哺乳動(dòng)物也可以用來表達(dá)人源化抗體。
上述抗體也可以用來分離或鑒定表達(dá)所述多肽的克隆或純化親和色譜技術(shù)制備的多肽。
抗本發(fā)明多肽的抗體也可以用來治療本發(fā)明限定疾病等。
另一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程改造的含有本發(fā)明多肽的可溶性融合蛋白或其片段，和各亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各個(gè)部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1的重鏈恒定區(qū)部分，其中融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以通過加入可被血凝因子Xa切割的切割序列將Fc部分除去。此外，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，和其在藥物篩選、診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面還涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的實(shí)例可以參見國際專利申請WO94/29458和WO94/22914。
本發(fā)明的其他方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括用本發(fā)明的多肽免疫接種哺乳動(dòng)物，產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞應(yīng)答，從而保護(hù)該動(dòng)物免于本發(fā)明限定疾病等。本發(fā)明的其他方面也涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，通過在體內(nèi)指導(dǎo)多核苷酸表達(dá)并編碼多肽的載體來給藥本發(fā)明的多肽，以便誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，生成抗體保護(hù)動(dòng)物免于疾病。
本發(fā)明的其他方面涉及免疫原/疫苗制劑(組合物)，將其引入哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，可誘導(dǎo)針對本發(fā)明多肽的免疫應(yīng)答，其中該組合物含有本發(fā)明的多肽或多核苷酸。該疫苗制劑還可以含有合適的載體。因?yàn)樵摱嚯脑谖钢锌梢员唤到?，?yōu)選通過腸胃外途徑給藥(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)等注射)。適合胃腸外給藥的制劑包括含水和不含水的無菌注射液，其中可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與受者血液等滲的溶質(zhì)；含水和不含水的無菌懸浮液，其中可以含有懸浮劑或增稠劑。該制劑可以是單劑或多劑容器形式，例如密封安瓿和小瓶，也可以保存在凍干條件下，只需在使用前加入無菌液體載體即可。疫苗制劑也可以含有增強(qiáng)制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)，如水包油系統(tǒng)或本領(lǐng)域已知的其他系統(tǒng)。劑量取決于疫苗的比活性，可以通過常規(guī)試驗(yàn)方便地確定。
本發(fā)明的多肽與多種生物功能有關(guān)，包括多種疾病狀態(tài)，特別是以上所述本發(fā)明限定疾病。因此，有必要設(shè)計(jì)鑒定刺激或抑制多肽功能的化合物的篩選方法。因而，本發(fā)明另一方面提供篩選化合物的方法，以鑒定刺激或抑制多肽功能的化合物。一般來說，激動(dòng)劑或拮抗劑可以用于以上所述本發(fā)明限定疾病的治療和預(yù)防目的。化合物可以從多種來源鑒定，例如細(xì)胞、無細(xì)胞制備物、化學(xué)文庫和天然產(chǎn)品混合物。鑒定的這些激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑可以是本發(fā)明多肽的天然或修飾的底物、配體、受體、酶等；或者是本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)或功能模擬物。可參見Coligan et al.，Current Protocol in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
篩選試驗(yàn)可以簡單地測試候選化合物與多肽、具有該多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜或其融合蛋白的結(jié)合，利用直接或間接與候選化合物結(jié)合的標(biāo)記檢測?；蛘吆Y選方法包括與標(biāo)記競爭物的競爭。并且，這些篩選方法可以測試候選化合物是否會產(chǎn)生多肽激活或抑制產(chǎn)生的信號，使用適合于具有多肽的細(xì)胞的檢測系統(tǒng)。激活抑制劑通常在已知激動(dòng)劑存在時(shí)試驗(yàn)，觀察候選化合物存在對激動(dòng)劑激活的影響。結(jié)構(gòu)活性多肽可以用于篩選反向激動(dòng)劑或抑制劑的方法中，在不存在激動(dòng)劑或抑制劑時(shí)測定候選化合物是否抑制多肽的激活。另外，篩選試驗(yàn)可以簡單地包括以下步驟混合候選化合物與含有本發(fā)明多肽的溶液，形成混合物，測定混合物中CBFBLH05活性，比較混合物與標(biāo)準(zhǔn)品的CBFBLH05活性。如上述由Fc部分和CBFBLH05多肽形成的融合蛋白等融合蛋白也可用于高流通量篩選試驗(yàn)，以鑒定本發(fā)明多肽的拮抗劑(參見D.Bennett et al.，JMol Recognition，852-58(1995)；and K.Johanson et al.，J Biol Chem，270(16)9459-9471(1995))。
本發(fā)明的多核苷酸、多肽和多肽的抗體也可以用來設(shè)計(jì)檢測加入的化合物對細(xì)胞中mRNA和多肽生成的影響的篩選方法。例如，可以設(shè)計(jì)ELISA，通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法使用單克隆和多克隆抗體來測定分泌或細(xì)胞結(jié)合的多肽水平。這可以用來從合適的工程改造的細(xì)胞或組織中尋找可以抑制或增加多肽生成的物質(zhì)(也可以分別稱為拮抗劑或激動(dòng)劑)。
該多肽可以用來鑒定存在的膜結(jié)合或可溶受體，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)受體結(jié)合技術(shù)。這些包括但不限于配體結(jié)合和交聯(lián)試驗(yàn)，其中多肽用放射性同位素(如125I)標(biāo)記，化學(xué)修飾(如生物素化)，或與適合檢測或純化的肽序列融合，與推測的受體源(細(xì)胞、細(xì)胞膜、細(xì)胞上清、組織提取物、體液)溫育。其他方法包括生物物理技術(shù)，如表面胞質(zhì)共振和分光術(shù)。這些篩選方法也可以用來鑒定多肽的激動(dòng)劑和拮抗劑，它們與多肽對存在的受體的結(jié)合競爭。進(jìn)行這些試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
可能的多肽拮抗劑的實(shí)例包括多肽的抗體，或者在某些情況下為與多肽的配體、底物、受體、酶等密切相關(guān)的寡核苷酸或蛋白，例如配體、底物、受體、酶等的片段；或者為與本發(fā)明的多肽結(jié)合但不引發(fā)應(yīng)答的小分子，從而抑制多肽的活性。
因此，本發(fā)明另一方面涉及一種篩選藥盒，用來鑒定本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等；或者是降低或增加這些多肽生成的化合物，該藥盒包括(a)本發(fā)明的多肽；(b)表達(dá)本發(fā)明多肽的重組細(xì)胞；(c)表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞膜；(d)本發(fā)明多肽的抗體；其中，多肽優(yōu)選為序列2的多肽。
應(yīng)當(dāng)理解，在這種藥盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一種主要成分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易意識到，本發(fā)明的多肽也可以用于基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)多肽的激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑的方法中，包括(a)首先確定多肽的三維結(jié)構(gòu)；(b)推測激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑中可能的反應(yīng)或結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)；(c)合成預(yù)期與推測的結(jié)合或反應(yīng)部位結(jié)合或反應(yīng)的候選化合物；(d)測試候選化合物是否確實(shí)為拮抗劑、拮抗劑或抑制劑。應(yīng)當(dāng)理解，該過程通常是交互式過程。
另一方面，本發(fā)明提供了與CBFBLH05多肽活性過高或過低有關(guān)的異常癥狀如肝病、癌癥、自身免疫病和腎病的治療方法。
如果多肽活性過高，可以有幾種方法。一種方法包括向受試者給藥上述抑制劑化合物(拮抗劑)，可選與可藥用載體組合，其用量可以抑制多肽的功能，例如通過阻斷配體、底物、受體、酶等的結(jié)合，或通過抑制第二信號，從而緩解異常癥狀。另一種方法中給藥能夠與內(nèi)源多肽競爭結(jié)合配體、底物、酶、受體等的可溶形式的多肽。這種競爭物的典型實(shí)例包括CBFBLH05多肽的片段。
在另一種方法中，可以使用表達(dá)阻斷技術(shù)抑制編碼內(nèi)源CBFBLH05多肽的基因的表達(dá)。已知的這種技術(shù)包括使用反義序列，可以是內(nèi)部產(chǎn)生的或單獨(dú)給藥(參見例如O＇Connor，J Neurochem(1991)56560，《基因表達(dá)反義抑制劑的寡脫氧核苷酸》CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))?；蛘呖梢允褂门c基因形成三螺旋的寡核苷酸(參見例如Lee，et al.，Nucleic Acid Res(1979)63073；Cooney et al.，Science(1988)241456；Dervan et al.，Scicence(1991)2511360)?？梢越o藥這些寡聚體或在體內(nèi)表達(dá)有關(guān)寡聚體。
為了治療CBFBLH05和其活性表達(dá)不足的異常癥狀，有幾種方法可以使用。一種方法包括向受試者給藥治療有效量的激活本發(fā)明多肽的化合物，即上述激動(dòng)劑，結(jié)合給藥可藥用的載體，從而緩解異常癥狀?；蛘?，可以使用基因治療來實(shí)現(xiàn)受試者相關(guān)細(xì)胞內(nèi)源生產(chǎn)CBFBLH05。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以如上述經(jīng)工程改造用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)。然后分離逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體并導(dǎo)入用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞中，載體中含有編碼本發(fā)明多肽的RNA，因而包裝細(xì)胞可以產(chǎn)生含有目的基因的感染性病毒粒子?？梢韵蚴茉囌呓o藥這些生產(chǎn)細(xì)胞，以便體內(nèi)改造細(xì)胞并在體內(nèi)表達(dá)多肽。基因治療的有關(guān)論述可參見第20章，“基因治療和其他基于分子遺傳學(xué)的治療方法(及其中的參考文獻(xiàn))，《人類分子遺傳學(xué)》，T Strachan and A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)。另一種方法是給藥治療有效量的本發(fā)明的多肽，結(jié)合給藥合適的藥用載體。
另一方面，本發(fā)明提供含有治療有效量的多肽和可藥用載體或賦形劑的藥物組合物，所述多肽如本發(fā)明多肽的可溶形式，激動(dòng)劑/拮抗劑肽或小分子化合物。這些載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合。本發(fā)明還涉及藥包和藥盒，其中包括一個(gè)或多個(gè)容器，裝有一種或多種本發(fā)明的上述組合物成分。本發(fā)明的多肽和其他化合物可以單獨(dú)使用，或與其他化合物如治療化合物聯(lián)合使用。
組合物應(yīng)適于給藥途徑，例如全身或口服途徑。優(yōu)選的全身給藥方式包括注射，一般是靜脈內(nèi)注射。也可使用其他注射途徑如皮下、肌肉、或腹膜內(nèi)途徑。全身給藥的其他方法包括使用膽酸鹽或梭鏈孢酸或其他表面活性劑等滲透劑經(jīng)粘膜和經(jīng)皮給藥。此外，如果本發(fā)明的多肽或其他化合物可以配制成腸道或膠囊劑，也可以口服給藥。這些化合物也可以以軟膏、糊劑、凝膠等形式表面和/或局部給藥。
所需劑量范圍取決于本發(fā)明肽或其他化合物的選擇、給藥途徑、制劑性質(zhì)、受試者癥狀的性質(zhì)和主治醫(yī)師的判斷。合適的劑量范圍為0.1到100μg/kg。鑒于可以獲得的化合物有多種，不同的給藥途徑有不同的效果，所需劑量的變化范圍很大是可以預(yù)見的。例如，預(yù)期口服給藥較靜脈注射所需劑量大。這些劑量水平的變化可以使用用來優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法調(diào)整，這在本領(lǐng)域是眾所周知的。
治療用多肽也可以在受試者體內(nèi)內(nèi)源產(chǎn)生，這種治療形式通常稱為“基因治療”。因此，例如來自受試者的細(xì)胞可以用多核苷酸如編碼來自體內(nèi)的多肽的DNA或RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體工程改造。然后將這些細(xì)胞引入受試者體內(nèi)。
多核苷酸和多肽序列構(gòu)成了有價(jià)值的信息源，可以用來鑒定具有類似同源性的其他序列。通過將序列存儲在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上，然后利用存儲的數(shù)據(jù)借助眾所周知的檢索工具如GCC檢索序列數(shù)據(jù)庫，使鑒定大為便利。因此，本發(fā)明另一方面提供一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其上存儲有含有序列1的多核苷酸和/或由其編碼的多肽序列。
為便于理解本說明書中常用的術(shù)語，提供以下定義。
“抗體”在本文中包括單克隆和多克隆抗體、嵌合、單鏈和人源化抗體以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表達(dá)文庫的產(chǎn)物。
“分離的”表示“通過人工”改變其天然狀態(tài)。如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)從其原始環(huán)境改變或取出或者已經(jīng)取出并改變。例如，在本文中使用該術(shù)語時(shí)，在活動(dòng)物體內(nèi)存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經(jīng)與天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)分開的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。
“多核苷酸”一般指聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA，單鏈和雙鏈RNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA，含有DNA和RNA的雜合分子，可以是單鏈或更常見為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。此外，“多核苷酸”還指含有RNA或DNA或RNA和DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語“多核苷酸”也包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA，以及為穩(wěn)定性或其他原因已對骨架進(jìn)行修飾的DNA或RNA?！靶揎棥眽A基包括例如三苯甲基化堿基和肌苷等稀有堿基?？梢詫NA和RNA進(jìn)行多種修飾，因此，“多核苷酸”包括自然界中常見的多核苷酸的化學(xué)、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞特征性的DNA和RNA化學(xué)形式。“多核苷酸”也包括相對短的、通常被稱為寡核苷酸的多核苷酸。
“多肽”指含有通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排物(peptideisosteres)互相連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何肽或蛋白?！岸嚯摹奔劝ǘ替?通常稱為肽)的寡肽或寡聚體，也包括長鏈(通常稱為蛋白)。多肽可能含有20種基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^翻譯后加工等天然方法或本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這些修飾在基本教科書和專論以及大量研究論文中敘述詳盡。修飾可以發(fā)生在多肽的任何部位，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。在給定多肽的不同位點(diǎn)同類修飾可以以相同或不同的程度存在。并且給定多肽可以含有多種類型的修飾。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，也可以為分支或不分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可能由于翻譯后的天然加工或合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)輟合、血紅素的共價(jià)輟合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)輟合、脂或脂衍生物的共價(jià)輟合、磷脂酰肌醇的共價(jià)輟合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價(jià)交聯(lián)的形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；?、γ羧化、糖基化、GPI錨定物形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二酰化、外消旋化、硒?；?selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸加入蛋白質(zhì)，如精氨酰化和遍在蛋白化(可以參見例如《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性》第2版，T.E. Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York，1993 and Wold，F(xiàn).，“翻譯后蛋白修飾前景與展望”，1-12頁，《蛋白的翻譯后共價(jià)修飾》B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York，1983；Seifter et al.，“蛋白修飾和非蛋白輔因子的分析”，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan et al.，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化”，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62)。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過誘變技術(shù)或直接合成制備。
“同一性”在本領(lǐng)域中已知是通過比較序列確定的兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也表示通過這些序列鏈之間的匹配確定的多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度?！巴恍浴笨梢酝ㄟ^已知方法方便地計(jì)算，包括但不限于以下文獻(xiàn)中所述方法《計(jì)算分子生物學(xué)》，Lesk，A.M.，ed.Oxfbrd UniversityPress，New York，1988；《計(jì)算生物學(xué)簡介和基因組工程》，Smith D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》第1部分，Griffin A.M.，and Griffin H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》，von Heinje，G.，Academic Press，1987；《序列分析引物》，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M StocktonPress，New York，1991；Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath.，481073(1988)。確定同一性的方法被設(shè)計(jì)成使測試的序列之間匹配最大。而且，確定同一性的方法已被編成可公開獲得的計(jì)算機(jī)程序。確定兩個(gè)序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research(1984)12(1)387)，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul，S.F.et al.，J Molec Biol(1990)215403)。BLAST X程序可從NCBI或其他來源獲得(BLAST手冊，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，etal.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用來確定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)包括1)算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)BLOSSUM62，來自Hentikoff andHentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8910915-10919(1992)缺口補(bǔ)償12缺口長度補(bǔ)償4可以應(yīng)用這些參數(shù)的一個(gè)程序是Genetics Computers Group，MadisonWI提供的gap程序。上述參數(shù)是肽比較的缺省參數(shù)(末端缺口不補(bǔ)償)。
多核苷酸比較的參數(shù)包括1)算法Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)匹配＝+10，錯(cuò)配＝0缺口補(bǔ)償50缺口長度補(bǔ)償3可以獲得的程序Genetics Computers Group，Madison WI提供的gap程序。這些是肽比較的缺省參數(shù)。
多核苷酸和多肽“同一性”的優(yōu)選含義在以下(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸實(shí)施方案還包括分離的多核苷酸，其所含的多核苷酸序列與序列1的參照序列的同一性為至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％，其中所述多核苷酸序列可以與序列1的參照序列相同，或與參照序列比較包括一定數(shù)量的核苷酸改變，其中所述改變選自至少一個(gè)核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換、顛換)或插入，所述改變可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5＇或3＇末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散在分布在參照序列中，其中所述核苷酸改變的數(shù)量如下確定序列1中的總核苷酸數(shù)乘以同一性百分?jǐn)?shù)，然后將其結(jié)果從序列1的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn為序列1的總核苷酸數(shù)，y值在50％時(shí)為0.50，在60％時(shí)為0.60，在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，在90％時(shí)為0.90，在95％時(shí)為0.95，在97％時(shí)為0.97，在100％時(shí)為1.00，·是乘法運(yùn)算的符號，其中若xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。編碼序列2多肽的多核苷酸序列的改變可以在編碼序列中產(chǎn)生無義、錯(cuò)義或移碼突變，因此改變由改變后的多核苷酸編碼的多肽。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與序列2的參照序列相同，可以是100％相同，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)核酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5＇或3＇末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的核酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散在分布在參照序列中。同一性百分?jǐn)?shù)一定時(shí)核酸改變的數(shù)量如下確定序列2中的總氨基酸數(shù)乘以同一性百分?jǐn)?shù)，然后將其結(jié)果從序列2的總氨基酸數(shù)中減除，或者
nn≤xn-(xn·y)其中nn為氨基酸改變數(shù)量，xn為序列2的總氨基酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，·是乘法運(yùn)算的符號，其中若xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。
(2)多肽實(shí)施方案還包括分離的多肽，其所含的多肽序列與序列2的參照多肽序列的同一性為至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％，其中所述多肽序列可以與序列2的參照序列相同，或與參照序列比較包括一定數(shù)量的氨基酸改變，其中所述改變選自至少一個(gè)氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散在分布在參照序列中，其中所述氨基酸改變的數(shù)量如下確定序列2中的總氨基酸數(shù)乘以同一性百分?jǐn)?shù)，然后將其結(jié)果從序列2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·Y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為序列2的總氨基酸數(shù)，y值在50％時(shí)為0.50，在60％時(shí)為0.60，在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，在90％時(shí)為0.90，在95％時(shí)為0.95，在97％時(shí)為0.97，在100％時(shí)為1.00，·是乘法運(yùn)算的符號，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
例如，本發(fā)明的多肽序列可以與序列2的參照序列相同，可以是100％相同，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散在分布在參照序列中。同一性百分?jǐn)?shù)一定時(shí)氨基酸改變的數(shù)量如下確定序列2中的總氨基酸數(shù)乘以同一性百分?jǐn)?shù)，然后將其結(jié)果從序列2的總氨基酸數(shù)中減除，或者
na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為序列2的總氨基酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，·是乘法運(yùn)算的符號，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
“融合蛋白”指由兩個(gè)通常不相關(guān)的融合基因或其片段編碼的蛋白。例如，EP-A-0 464公開了含有免疫球蛋白分子恒定區(qū)各部分和其他人蛋白或其部分的融合蛋白。在很多情況下，在治療和診斷中使用免疫球蛋白Fc區(qū)作為融合蛋白的一部分較為有利，可以導(dǎo)致改進(jìn)的藥物動(dòng)力特性(參見例如EP-A 0232 262)。另一方面，在某一些應(yīng)用中，在融合蛋白表達(dá)、檢測和純化后能夠切除Fc部分較為理想。
本說明書中所引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請，全部引作參考，如同每一出版物單獨(dú)和個(gè)別地指明引作參考一樣。序列信息序列11 GGTGTATGTG CGGCAATAAC ATGTCAACCC CGCTGCCCGC CATCGTGCCC51 GCCGCCCGGA AGGCCACCGC TGCGGTGATT TTCCTGCATG GATTGGGAGA101 TACTGGGCAC GGATGGGCAG AAGCCTTTGC AGGTATCAGA AGTTCACATA151 TCAAATATAT CTGCCCGCAT GCGTTTGATA TTATTGGGCT TTCACCAGAT201 TCACAGGAGG ATGAATCTGG GATTAAACAG GCAGCAGAAA ATATAAAAGC251 TTTGATTGAT CAAGAAGTGA AGAATGGCAT TCCTTCTAAC AGAATTATTT301 TGGGAGGGTT TTCTCAGGGA GGAGCTTTAT CTTTATATAC TGCCCTTACC351 ACACAGCAGA AACTGGCAGG TGTCACTGCA CTCAGTTGCT GGCTTCCACT401 TCGGGCTTCC TTTCCACAGG GTCCTATCGG TGGTGCTAAT AGAGATATTT451 CTATTCTCCA GTGCCACGGG GATTGTGACC CTTTGGTTCC CCTGATGTTT501 GGTTCTCTTA CGGTGGAAAA ACTAAAAACA TTGGTGAATC CAGCCAATGT551 GACCTTTAAA ACCTATGAAG GTATGATGCA CAGTTCGTGT CAACAGGAAA601 TGATGGATGT CAAGCAATTC ATTGATAAAC TCCTACCTCC AATTGATTGA651 CGTCACTAAG AGGCCTTGTG TAGAAGTACA CCAGCATCAT TGTAGTAGAG701 TGTAAACCTT TTCCCATGCC CAGTCTTCAA ATTTCTAATG TTTGCAGTGT751 TTAAATGTTT TGCAAATACA TGCCATTAAC ACAGATCAAT AATATCTCCT801 CTGAGAATTT ATGATCTTAA GTCTATACAT GTATTCTTAT AAGACGACCC851 AGGATCTACT ATATTAGAAT AGATGAAGCA GGTAGCTTCT TTTTTCTCAA901 ATGTAATTCA GCAAAATAAT ACAGTACTGC CACCAGATTT TTTATTACAT951 CATTTGAAAA TTAGCAGTAT GCTTAATGAA AATTTGTTCA GGTATAAATG1001 AGCAGTTAAG ATATAAACAA TTTATGCATG CTGTGACTTA GTCTATGGAT1051 TTATTCCAAA ATTGCTTAGT CACCATGCAG TGTCTGTATT TTTATATATG1101 TGTTCATATA TACATAATGA TTATAATACA TAATAAGAAT GAGGTGGTAT1151 TACATTATTC CTAATAATAG GGATAATGCT GTTTATTGTC AAGAAAAAGT1201 AAAATCGTTC TCTTCAATTA ATGGCCCTTT TATTTTGGGA CCAGGCTTTT1251 ATTTTCCCTG ATATTATTTC TATTTAATAC TCTTTTCTCT CAAGAAAAAA序列21 MCGNNMSTPL PAIVPAARKA TAAVIFLHGL GDTGHGWAEA FAGIRSSHIK51 YICPHAFDII GLSPDSQEDE SGIKQAAENI KALIDQEVKN GIPSNRIILG101 GFSQGGALSL YTALTTQQKL AGVTALSCWL PLRASFPQGP IGGANRDISI151 LQCHGDCDPL VPLMFGSLTV EKLKTLVNPA NVTFKTYEGM MHSSCQQEMM201 DVKQFIDKLL PPID
序列表(1)一般信息(i)申請人上海第二醫(yī)科大學(xué)(ii)發(fā)明名稱人溶血磷脂酶基因(CBFBLH05)(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人Ratner & Prestia(B)街道P.O.Box 980(C)城市Valley Forge(D)州PA(E)國家USA(F)郵政編碼19482(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Prestia，Paul F(B)登記號23,031(C)參考/案卷號GP-70497(ix)電訊信息(A)電話610/407-0700(B)傳真610/407-0701(C)電傳846169(2)序列1信息(i)序列特征(A)長度1300堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述序列1GGTGTATGTG CGGCAATAAC ATGTCAACCC CGCTGCCCGC CATCGTGCCC GCCGCCCGGA 60AGGCCACCGC TGCGGTGATT TTCCTGCATG GATTGGGAGA TACTGGGCAC GGATGGGCAG 120AAGCCTTTGC AGGTATCAGA AGTTCACATA TCAAATATAT CTGCCCGCAT GCGTTTGATA 180TTATTGGGCT TTCACCAGAT TCACAGGAGG ATGAATCTGG GATTAAACAG GCAGCAGAAA 240ATATAAAAGC TTTGATTGAT CAAGAAGTGA AGAATGGCAT TCCTTCTAAC AGAATTATTT 300TGGGAGGGTT TTCTCAGGGA GGAGCTTTAT CTTTATATAC TGCCCTTACC ACACAGCAGA 360AACTGGCAGG TGTCACTGCA CTCAGTTGCT GGCTTCCACT TCGGGCTTCC TTTCCACAGG 420GTCCTATCGG TGGTGCTAAT AGAGATATTT CTATTCTCCA GTGCCACGGG GATTGTGACC 480CTTTGGTTCC CCTGATGTTT GGTTCTCTTA CGGTGGAAAA ACTAAAAACA TTGGTGAATC 540CAGCCAATGT GACCTTTAAA ACCTATGAAG GTATGATGCA CAGTTCGTGT CAACAGGAAA 600TGATGGATGT CAAGCAATTC ATTGATAAAC TCCTACCTCC AATTGATTGA CGTCACTAAG 660AGGCCTTGTG TAGAAGTACA CCAGCATCAT TGTAGTAGAG TGTAAACCTT TTCCCATGCC 720CAGTCTTCAA ATTTCTAATG TTTGCAGTGT TTAAATGTTT TGCAAATACA TGCCATTAAC 780ACAGATCAAT AATATCTCCT CTGAGAATTT ATGATCTTAA GTCTATACAT GTATTCTTAT 840AAGACGACCC AGGATCTACT ATATTAGAAT AGATGAAGCA GGTAGCTTCT TTTTTCTCAA 900ATGTAATTCA GCAAAATAAT ACAGTACTGC CACCAGATTT TTTATTACAT CATTTGAAAA 960TTAGCAGTAT GCTTAATGAA AATTTGTTCA GGTATAAATG AGCAGTTAAG ATATAAACAA1020TTTATGCATG CTGTGACTTA TCTATGGAT TTATTCCAAA ATTGCTTAGT CACCATGCAG1080TGTCTGTATT TTTATATATG TGTTCATATA TACATAATGA TTATAATACA TAATAAGAAT1140GAGGTGGTAT TACATTATTC CTAATAATAG GGATAATGCT GTTTATTGTC AAGAAAAAGT1200AAAATCGTTC TCTTCAATTA ATGGCCCTTT TATTTTGGGA CCAGGCTTTT ATTTTCCCTG1260ATATTATTTC TATTTAATAC TCTTTTCTCT CAAGAAAAAA 1300(2)序列2信息(i)序列特征(A)長度214氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述序列2195 200 205Leu Leu Pro Pro Ile Asp l Pro Ala210 15Ala Arg Lys Ala Thr Ala Ala Val Ile Phe Leu His Gly Leu Gly Asp20 25 30Thr Gly His Gly Trp Ala Glu Ala Phe Ala Gly Ile Arg Ser Ser His35 40 45Ile Lys Tyr Ile Cys Pro His Ala Phe Asp Ile Ile Gly Leu Ser Pro50 55 60Asp Ser Gln Glu Asp Glu Ser Gly Ile Lys Gln Ala Ala Glu Asn Ile65 70 75 80Lys Ala Leu Ile Asp Gln Slu Val Lys Asn Gly Ile Pro Ser Asn Arg85 90 95Ile Ile Leu Gly Gly Phe Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ser Leu Tyr Thr100 105 110Ala Leu Thr Thr Gln Gln Lys Leu Ala Gly Val Thr Ala Leu Ser Cys115 120 125Trp Leu Pro Leu Arg Ala Ser Phe Pro Gln Gly Pro Ile Gly Gly Ala130 135 140Asn Arg Asp Ile Ser Ile Leu Gln Cys His Gly Asp Cys Asp Pro Leu145 150 155 160Val Pro Leu Met Phe Gly Ser Leu Thr Val Glu Lys Leu Lys Thr Leu165 170 175Val Asn Pro Ala Asn Val Thr Phe Lys Thr Tyr Glu Gly Met Met His180 185 190Ser Ser Cys Gln Gln Glu Met Met Asp Val Lys Gln Phe Ile Asp Lys195 200 205Leu Leu Pro Pro Ile Asp210
權(quán)利要求
1.一種選自以下多肽的分離的多肽(i)含有與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的氨基酸序列的分離多肽；(ii)含有序列2氨基酸序列的分離多肽；或(iii)其氨基酸序列為序列2的分離多肽。
2.一種選自以下多核苷酸的分離的多核苷酸(i)分離的多核苷酸，其含有的核苷酸序列編碼與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的氨基酸序列的多肽；(ii)分離的多核苷酸，其含有與序列2多肽序列的整個(gè)編碼核苷酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的核苷酸序列；(iii)分離的多核苷酸，其含有與序列1的整個(gè)核苷酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的核苷酸序列；(iv)分離的多核苷酸，其含有編碼序列2多肽的核苷酸序列；(v)分離的多核苷酸，其為序列1的多核苷酸；或(vi)分離的多核苷酸，其可用具有序列1或其片段的序列的標(biāo)記探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選合適的文庫獲得；或與所述分離多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的多肽的免疫特異性抗體。
4.一種治療方法，用于治療(i)需要權(quán)利要求1的多肽活性或表達(dá)提高的受試者，包括(a)向受試者給藥治療有效量的所述多肽的激動(dòng)劑；和/或(b)向受試者提供分離的多核苷酸，其含有編碼所述多肽的核苷酸序列，其形式可以實(shí)現(xiàn)所述多肽活性的體內(nèi)產(chǎn)生；或(ii)需要抑制權(quán)利要求1的多肽的活性或表達(dá)的受試者，包括(a)向受試者給藥治療有效量的所述多肽的拮抗劑；和/或(b)向受試者提供抑制編碼所述多肽的核苷酸序列表達(dá)的核酸分子；和/或(c)向受試者給藥治療有效量的與所述多肽競爭其配體、底物或受體的多肽。
5.診斷受試者中與權(quán)利要求1多肽的表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，包括(a)確定受試者基因組中所述多肽的編碼核苷酸序列是否存在突變；和/或(b)分析來自所述受試者的樣品中是否有所述多肽表達(dá)或其表達(dá)量。
6.鑒定刺激或抑制權(quán)利要求1的多肽功能的化合物的篩選方法，包括選自以下的一種方法(a)利用直接或間接與候選化合物結(jié)合的標(biāo)記測定候選化合物與多肽(或具有該多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(b)在標(biāo)記競爭物存在時(shí)測定候選化合物與多肽(或具有該多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(c)利用對具有多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜合適的檢測系統(tǒng)，確定候選化合物是否產(chǎn)生多肽激活或抑制產(chǎn)生的信號；(d)將候選化合物與含有權(quán)利要求1的多肽的溶液混合，形成混合物，測定混合物中的多肽活性，比較混合物與標(biāo)準(zhǔn)品的活性；或(e)利用ELISA試驗(yàn)等測定候選化合物對細(xì)胞中所述多肽和編碼所述多肽的mRNA的生成的影響。
7.權(quán)利要求1的多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑。
8.含有一種多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，該多核苷酸在所述表達(dá)系統(tǒng)存在于相容細(xì)胞中時(shí)能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽。
9.制備重組宿主細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求8的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使得宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下能夠生成一種多肽，其含有與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少70％的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的方法制備的重組宿主細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的重組宿主細(xì)胞的膜，其表達(dá)一種多肽，所述多肽包括與序列2的整個(gè)氨基酸序列的同一性為至少70％的氨基酸序列。
12.生產(chǎn)多肽的方法，包括在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，由培養(yǎng)物中回收多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了CBFBLH05多肽和多核苷酸以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法。本發(fā)明還公開了在治療和診斷試驗(yàn)中利用CBFBLH05多肽和多核苷酸的方法。
文檔編號A61K48/00GK1275131SQ98810060
公開日2000年11月29日 申請日期1998年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月11日
發(fā)明者周雋, 茅矛, 葉珉, 張慶華 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)