高純度溶血磷脂酰膽堿的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括在鈣離子溶液中，先加入磷脂酰膽堿與膽酸鹽攪拌后，再加入磷脂酶A2保溫進(jìn)行水解反應(yīng)得到溶血磷脂酰膽堿，丙酮沉淀將產(chǎn)品分離出。本發(fā)明加入膽酸鹽，使磷脂酰膽堿乳滴變小、變細(xì)，反應(yīng)溶液變稀，使反應(yīng)物在5小時左右水解完全，能明顯縮短反應(yīng)時間，其中在磷脂酰膽堿濃度高達(dá)30-40%，其轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿的效率仍能達(dá)到100%。此外，本法副產(chǎn)物如甘油磷酰膽堿和未水解的磷脂酰膽堿相比現(xiàn)有技術(shù)顯著減少。本發(fā)明生產(chǎn)的溶血磷脂酰膽堿純度高，可以省去多次的純化步驟，進(jìn)而可以縮短生產(chǎn)周期并能大幅降低生成本。
【專利說明】高純度溶血磷脂酰膽堿的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高純度溶血磷脂酰膽堿的制備方法，尤其涉及一種以卵磷脂為原 料制備高純度溶血磷脂酰膽堿的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 溶血磷脂酰膽堿是卵磷脂的代謝產(chǎn)物，亦稱溶血卵磷脂，在食品工業(yè)及化妝品工 業(yè)中可以作為食品添加劑及乳化劑使用，高純度的溶血磷脂酰膽堿在藥學(xué)上可以作為藥物 中間體用，是一類安全無毒的藥物載體。例如在專利CN100536851中作為丙戊酸的載體，其 結(jié)合物可以作為一類優(yōu)良的抗癲癇藥物使用，其制備通常利用磷脂酶A2促進(jìn)磷脂酰膽堿 的水解來生產(chǎn)溶血磷脂酰膽堿。
[0003] 早在二十世紀(jì)初人們就已經(jīng)知道磷脂酰膽堿可以借助酶促水解轉(zhuǎn)化成溶血磷脂 酰膽堿。1935年Hughes用實驗證明卵磷脂轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰膽堿）的單分子 膜水解與諸如pH值、溫度和卵磷脂分子的表面濃度等因素有關(guān)。Hanahan證明在雞蛋卵磷 脂與磷脂酶A2之間的醚溶性絡(luò)合物導(dǎo)致釋放不飽和脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿。1963年， Dawson也發(fā)現(xiàn)了磷脂酶A2將磷脂酰膽堿水解成溶血磷脂酰膽堿和脂肪酸分子，并確定酶 的活性與鈣離子存在與否有關(guān)，并且添加丁醇將激發(fā)磷脂酶的活性。英國專利GB1215868 介紹了進(jìn)一步改進(jìn)方案，即在有脂肪(油)存在的條件下進(jìn)行有磷脂酶A2參與的磷脂的水解 反應(yīng)。中國專利CN1210560通過加入單酸甘油酯以期改進(jìn)水解效果，但是由于反應(yīng)溫度過 高、反應(yīng)時間過長，致使反應(yīng)物中副產(chǎn)物仍然很多，并且單酸甘油酯加入量非常大，是磷脂 酰膽堿的5倍量)，成本很高。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)揭示的磷脂酰膽堿水解方法依然存在一些缺點，如產(chǎn)品純度低，磷脂酰 膽堿原始物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率不超60-70%，甘油磷酰膽堿和未水解的磷脂酰膽堿等副產(chǎn)物高， 特別是高濃度(濃度為30-40%)的磷脂酰膽堿水解時，由于濃度高，反應(yīng)物粘稠，需要長達(dá) 96小時的反應(yīng)時間，轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酰膽堿的效率更低，副產(chǎn)物的產(chǎn)生比例更高，為了得到 高純度的終產(chǎn)物需要多次純化去除副產(chǎn)物，從而限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 由于現(xiàn)有技術(shù)上的缺陷，所以需要提出更有效的將磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰 膽堿的方法，以得到高純度的可藥用的溶血磷脂酰膽堿。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種溶血磷脂酰膽堿的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] -種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括在鈣離子溶液中，先加入磷脂酰膽 堿與膽酸鹽攪拌后，再加入磷脂酶A2保溫進(jìn)行水解反應(yīng)得到溶血磷脂酰膽堿。
[0009] 上述制備溶血磷脂酰膽堿的方法中，所述水解反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物通過丙酮沉 淀將溶血磷脂酰膽堿分離出。
[0010] 上述制備溶血磷脂酰膽堿的方法中，所述的膽酸鹽選自膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛黃 膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鈉中的一種或幾種。優(yōu)選為膽酸鈉。所述的鈣離子溶液為CaCl2A 溶液。所述CaCl2水溶液的濃度為0. 1~0. 4mol/L，優(yōu)選0. 1~0. 2 mol/L。所述的膽酸鹽與 磷脂酰膽堿的摩爾比為〇. 〇5?1 :1，優(yōu)選0. f 0. 3 :1。
[0011] 上述制備溶血磷脂酰膽堿的方法中，所述磷脂酶A2加入前反應(yīng)體系的起始pH值 7?9,優(yōu)選疒8。再加入磷脂酶A2保持一定溫度進(jìn)行水解反應(yīng)，磷脂酶A2的使用量通常為 100g 憐脂醜膽喊（卵憐脂）加入 1 ?2ml 酶液（Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)。加完磷脂酶A2后將反應(yīng)混合物升溫至4(T80°C的溫度，優(yōu)選大約5(T60°C，并將 混合物再攪拌一定時間進(jìn)行水解反應(yīng)，如:T6h，優(yōu)選4~5h，然后使用丙酮沉淀分離溶血磷 脂酰膽堿。
[0012] 上述制備溶血磷脂酰膽堿的方法中，所述保溫的溫度為4(T80°C，溫度優(yōu)選 5(T60°C。所述水解反應(yīng)的時間為:T6h，優(yōu)選4?5h。
[0013] 本發(fā)明所述的室溫為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的25±5°C。本發(fā)明所涉及的原料除 特別說明外均可以通過市場購買獲得。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：
[0015] 本發(fā)明加入膽酸鹽，使磷脂酰膽堿乳滴變小、變細(xì)，反應(yīng)溶液變稀，加快反應(yīng)速度， 使反應(yīng)物在5小時內(nèi)水解完全，顯著縮短了反應(yīng)時間，即使磷脂酰膽堿在溶液中的濃度高 達(dá)3(Γ40% (重量比)，其轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿的效率仍能達(dá)到100%。此外，本法副產(chǎn)物如 甘油磷酰膽堿(二個脂肪酸完全水解下來的副產(chǎn)物）和未水解的磷脂酰膽堿相比現(xiàn)有技術(shù) 顯著減少。本發(fā)明生產(chǎn)的溶血磷脂酰膽堿純度高，可以省去多次的純化步驟，進(jìn)而可以縮短 生產(chǎn)周期并能大幅降低生成本。本方法得到的產(chǎn)物，氫化后產(chǎn)品性質(zhì)更加穩(wěn)定，易于儲存， 更加適合藥用或應(yīng)用于食品工業(yè)。

【具體實施方式】
[0016] 下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。
[0017] 磷脂酰膽堿購自上海太偉藥業(yè)，分子量785 ;磷脂酶Α2購自丹麥諾和諾德制藥公 司，膽酸鈉購自國藥集團化學(xué)試劑公司。
[0018] 實施例1
[0019] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入116ml 0. lmol/L CaCljjC溶液，50g磷 脂酰膽堿，6g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/L NaOH溶液控制體系 初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2(Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)， 升溫至50°C攪拌5h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固體再以1L 丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得25g粉末狀溶血磷脂酰膽堿， 純度99. 2%。
[0020] 實施例2
[0021] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入75ml 0.2mol/L CaClyjC溶液，50g 磷脂酰膽堿，8. 22g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 8,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至5(TC攪拌5h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得26. 7g粉末狀溶血 磷脂酰膽堿，純度98. 7%。
[0022] 實施例3
[0023] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入70ml 0. 4mol/L CaCl2水溶液，50g 磷脂酰膽堿，5. 48g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至6(TC攪拌4h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得26g粉末狀溶血磷 脂酰膽堿，純度99. 1%。
[0024] 實施例4
[0025] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入75ml 0.3mol/L CaClyjC溶液，50g 磷脂酰膽堿，1. 37g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 9,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至8(TC攪拌3h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得25. 3g粉末狀溶血 磷脂酰膽堿，純度99. 2%。
[0026] 實施例5
[0027] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入116ml 0· lmol/L CaClyjC溶液，50g 磷脂酰膽堿，2. 74g膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控 制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，升溫至40?攪拌6h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得24. 8g粉末狀溶血 磷脂酰膽堿，純度為99. 3%。
[0028] 實施例6
[0029] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入90ml0. 2mol/L CaCl2水溶液，50g磷 脂酰膽堿，2. 64g脫氧膽酸鈉，劇烈攪拌30min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液 控制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark),升溫至5(TC攪拌5h,冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得26. 7g粉末狀溶血 磷脂酰膽堿，純度為98. 9%。
[0030] 實施例7
[0031] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入90ml 0· 2mol/L CaCl2水溶液，50g磷 脂酰膽堿，10. 27g牛黃膽酸鈉，劇烈攪拌50min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液 控制體系初始 pH 值 8,加入 lml 憐脂酶 A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，升溫至60?攪拌4h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得25. 4g粉末狀溶血 磷脂酰膽堿，純度為98.6%。
[0032] 實施例8
[0033] 配有氮氣保護(hù)裝置的1000ml反應(yīng)瓶中加入90ml 0· 2mol/L CaCl2水溶液，50g磷 脂酰膽堿，6. 65g牛黃脫氧膽酸鈉，劇烈攪拌40min，使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶 液控制體系初始 pH 值 7,加入 lml 憐脂酶 A2(Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，升溫至60?攪拌4h，冷卻至室溫，慢慢加入2L丙酮，析出固體，傾出上層清液，固 體再以1L丙酮分三次攪拌洗滌，分散成粉末狀，抽濾，40°C真空干燥，得26. 0g粉末狀溶血 磷脂酰膽堿，純度為98. 8%。
[0034] 實施例9
[0035] 氫化釜中加入10g上述實施例制備的溶血磷脂酰膽堿，160ml二氯甲烷/95%乙醇 溶液（V二氯甲烷：V95%乙醇=3:1)攪拌溶解，加入0. 5g 10%Pd/C，密封后，以氮氣，氫氣置 換氣體3次，充入氫氣，保持0. 5MPa，50°C反應(yīng)5h。排空后，取出反應(yīng)液，抽濾，濾液濃縮干， 加入15ml無水乙醇溶解，室溫下滴加150ml丙酮，析出白色固體，冷卻至0°C攪拌2h，抽濾， 40°C真空干燥，得9. 3g白色粉末，純度99. 5%。
[0036] 實施例10
[0037] 70ml 0.4mol/L CaCljK溶液，50g磷脂酰膽堿，不同量的膽酸鈉，劇烈攪拌30min， 使其分散均勻，通過加入4mol/LNaOH溶液控制體系初始pH值7,加入lml磷脂酶A2 (Lecitase 10L, 10580IU/ml, Novo Nordisk, Denmark)，保持 50°C進(jìn)行水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為 溶血磷脂酰膽堿的百分比(見表1)。
[0038] 其通過HPLC法測定轉(zhuǎn)化率：利用高效液相色譜測定酶解反應(yīng)前后反應(yīng)體系中磷 脂酰膽堿的含量來計算溶血磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)化率。柱條件：nova-pak@silica柱長15cm，柱 徑3. 9_，柱壓280psi，流速0. 4ml/min。檢測波長204mm。流動相：乙腈：甲醇：水=65 : 2 : 14 (v:v:v)〇
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，其特征在于該方法包括在鈣離子溶液中，先加入 磷脂酰膽堿與膽酸鹽攪拌后，再加入磷脂酶A2保溫進(jìn)行水解反應(yīng)得到溶血磷脂酰膽堿。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述水解反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物通過丙酮 沉淀將溶血磷脂酰膽堿分離出。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的膽酸鹽選自膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛 黃膽酸鈉、牛黃脫氧膽酸鈉中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的膽酸鹽是膽酸鈉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的鈣離子溶液為CaCl2水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述CaCl2水溶液的濃度為0. 1~0. 4mol/ L，優(yōu)選 0· 1 ?0· 2 mol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的膽酸鹽與磷脂酰膽堿的摩爾比為 0· 05?1 :1，優(yōu)選 0· 1 ?0· 3 :1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述磷脂酶A2加入前反應(yīng)體系的起始pH 值疒9,優(yōu)選疒8。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述保溫的溫度為4(T80°C，溫度優(yōu)選 50?60。。。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述水解反應(yīng)的時間為:T6h，優(yōu)選4~5h。
【文檔編號】C12P13/00GK104250658SQ201310261747
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】馬彥琴, 王勇, 周英珍 申請人:江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司