專利名稱：：在人肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種在人肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體及其用途，特別涉及外源基因表達(dá)為人甲胎蛋基因上游啟動子、增強(qiáng)子所控制的，利用EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制元件構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒載體及其用途。EB病毒屬于皰疹病毒科，它體內(nèi)可感染人B細(xì)胞，同時(shí)體外能轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞使之永生化，在EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，病毒一般呈隱性感染狀態(tài)，病毒DNA以閉合環(huán)狀游離于細(xì)胞染色體外自主復(fù)制，與宿主染色體DNA復(fù)制同步，目前已明確EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制僅依賴病毒基因組的兩段序列元件，起順式作用的質(zhì)粒型復(fù)制起始區(qū)OriP和反式蛋白EBNA-I的編碼區(qū)段，總長度不及病毒基因組的三十分之一。在大腸桿菌質(zhì)粒中引入EB病毒基因組的這兩段序列元件，可構(gòu)成一個既能在大腸桿菌中擴(kuò)增，又能在人細(xì)胞自主復(fù)制的穿梭載體，它能以較高的轉(zhuǎn)染頻率導(dǎo)入人細(xì)胞表達(dá)和復(fù)制，同時(shí)插入高達(dá)幾十kb的外源基因也不影響其附加子特性。(Yates，J.etalStablereplicationofplasmidsderivedfromEpstein-BarrVirusinvariousmammaliancells.Nature313812)，目前這種含EB病毒復(fù)制子的真核質(zhì)粒多用于真核表達(dá)文庫的構(gòu)建及目標(biāo)基因的表達(dá)上并已有商品化試劑供應(yīng)，CLONTECHlabortories，Inc的pDR2(#6167-1)就是其中之一，外源基因的表達(dá)受組成型的啟動子勞氏肉瘤病毒(Rouscarcomavirus)的長末端控制，沒有組織特異性?；蛑委煹呐d起對腫瘤的治療提出了新的思路。其中有選擇性往腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入如核酸水解酶、HSV-1胸苷激酶基因等所謂自殺基因，這些基因的表達(dá)會導(dǎo)致被導(dǎo)入細(xì)胞的死亡，這種工作往往是將自殺基因置于一種腫瘤細(xì)胞特異的啟動子控制之下，使基因在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)而不影響正常細(xì)胞的功能。目前已確定甲胎蛋白基因的調(diào)控序列時(shí)具有肝癌細(xì)胞表達(dá)專一性的啟動子，甲胎蛋白是人胚胎期的主要血清蛋白，是由胎肝細(xì)胞分泌產(chǎn)生的。在成熟期肝細(xì)胞分泌甲胎蛋白的能力已消失，但在原發(fā)性肝癌的患者，甲胎蛋白發(fā)生異常表達(dá)，患者血清中檢出甲胎蛋白是判斷肝腫瘤發(fā)生的依據(jù)之一。研究已表明控制甲胎蛋白表達(dá)的產(chǎn)生是其基因上游的啟動子和增強(qiáng)子序列，(Watanabe，K.etal.，Cell-specificenhanceractivityinafarupsteamregionofthehumanα-fetoproteingene，JBiolChem，1987，2624812----4819)，相信是細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，低分化或不分化的肝癌細(xì)胞中，與甲胎蛋白表達(dá)有關(guān)的一些反式因子的表達(dá)激活了甲胎蛋白基因上游的啟動子與增強(qiáng)子所致。Hubber等將甲胎蛋白調(diào)控序列克隆于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將嵌合了甲胎蛋白上游調(diào)控區(qū)的外源基因?qū)氡磉_(dá)甲胎蛋白的肝癌組織則獲蛋白活性，而導(dǎo)入正常肝細(xì)胞則不表達(dá)(Huber，B.E.etal.，RetroviralmediatedgenetherapyforthetraetmentofhepatocellularCarcinomaAinnovativeapproachforcarcergenetherapy，ProcNatlAcadSciUSA，1991，888039--8043)。但逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的表達(dá)和復(fù)制需將基因整合到細(xì)胞的染色體以及重組病毒直接用于人體等，都存在著安全性問題，同時(shí)獲得高滴度的重組病毒并非易事，制備重組病毒需將重組病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞產(chǎn)生重組病毒顆粒，并需濃縮和純化，過程相對繁瑣。本發(fā)明的目的是提供一種新型的肝細(xì)胞特異表達(dá)載體，它可以非病毒感染的形式將外源基因?qū)塍w內(nèi)復(fù)制和表達(dá)，具有比直接使用逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)更高的安全性。其特點(diǎn)是被導(dǎo)入肝細(xì)胞的外源基因不與染色體發(fā)生整合行為，游離于染色體外穩(wěn)定存在并自主復(fù)制，它作為一種大腸桿菌、人細(xì)胞穿梭質(zhì)?？稍诖竽c桿菌大量擴(kuò)增，經(jīng)簡單的純化就可應(yīng)用于肝細(xì)胞受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，能以如常規(guī)給藥的方式特異地將外源基因?qū)敫渭?xì)胞并僅在表達(dá)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞才發(fā)生特異表達(dá)。本發(fā)明的肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體pEBAF(寄存于大腸桿菌DH5α株，含該質(zhì)粒的菌種命名為EscherichiacoliDH5α/pEBAF，已于1996年2月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號為CGMCCNO.0255)，見附圖1，由下列DNA元件組成1，肝癌細(xì)胞表達(dá)特異啟動子、增強(qiáng)子--------甲胎蛋白基因上游調(diào)控序列。2，甲胎蛋白啟動子、增強(qiáng)子之后有多個單酶切位點(diǎn)BamHI、SalI、PvuII供插入外源基因之用，多克隆位點(diǎn)后是源于SV40病毒的2533---2770bp處的加多聚腺苷酸信號序列。3，人細(xì)胞自主復(fù)制子及其反式作用因子-------EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制所需序列元件OriP、EBNA-I4，真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志基因(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)。5，大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰氨酶基因)。本發(fā)明用于的新型載體構(gòu)建的原始質(zhì)粒有如下幾種pDR2Clontech公司商品質(zhì)粒#6167-1。pAF5.1cat(Watanabe，K.etal.，Cell-specificenhanceractivityinafarupsteamregionofthehumanα-fetoproteingene，JBiolChem，1987，2624812----4819).pBRCEB病毒95.8株基因組BamHIC片段(3994-----13215bp)克隆于pBR322質(zhì)粒。pBluesciptIIKSStratagene公司商品質(zhì)粒#212207下面是自主復(fù)制型肝癌細(xì)胞特異表達(dá)載體pEBAF的構(gòu)建過程1，首先構(gòu)建不含外源基因啟動子的自主復(fù)制型質(zhì)粒，在pDR2的基礎(chǔ)上刪除質(zhì)粒上的Roussarcomavirus的末端重復(fù)序列，并引入多個單一限制酶位點(diǎn)，有NotI、XabI、BamHI、SalI、PvuII供插入啟動子之用，此質(zhì)粒命名為pBV101(寄存于大腸桿菌DH5α株，含該質(zhì)粒的菌種命名為EscherichiacoliDH5α/pBV101，已于1996年2月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號為CGMCCNO.0255)。見附圖2詳細(xì)如下從pBRC中切下SacI----SacII2.7kb含EB病毒復(fù)制子的片段，克隆與pBluescriptIIKS的SacI、SacII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pKSoriP；再從pKSoriP中以EcoRV、BamHI消化，回收約500bp的片段，與從pDR2中以EcoRV、BamHI消化回收9.5kb的大片段連接，獲得pBV101。2，從pAF5.1cat出發(fā)，經(jīng)過三步亞克隆，刪去cat基因，獲得質(zhì)粒pAF5.1，人甲胎蛋白基因的啟動子序列可以很方便的從在其3′端引入BamHI單位點(diǎn)切下。3，pAF5.1以XmnI和BamHI消化，回收5.5kp的含人甲胎蛋白啟動子的片段，(其中5.1kb為人甲胎蛋白基因上游調(diào)控序列，5′段有源于pBR322XmnI----EcoRI398bp序列〕與pBV101以NotI消化后klenow酶補(bǔ)平，再以BamHI酶切所得的10kb質(zhì)粒片段相連接，獲得自主復(fù)制型的肝癌特異表達(dá)的載體pEBAF。本發(fā)明提出的復(fù)制型肝癌細(xì)胞特異表達(dá)載體pEBAF，可應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的基因治療，外源基因可以是對細(xì)胞毒性的基因或細(xì)胞因子類基因，載體可通過物理方法，如脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染或細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用導(dǎo)入宿主細(xì)胞，能游離于細(xì)胞染色體外自主復(fù)制，但甲胎蛋白啟動子控制表達(dá)的外源基因僅在表達(dá)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞才發(fā)生轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮功能，因此在肝癌的基因治療中可在不影響正常肝細(xì)胞功能的同時(shí)，選擇性殺死腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明提出的復(fù)制型肝癌細(xì)胞特異表達(dá)載體pEBAF，可寄存在大腸桿菌DH5α株，含pEBAF質(zhì)粒的菌株命名為大腸桿菌DH5α/pEBAF(EscherichiacoliDH5α/pEBAF)，不含外源基因啟動子的自主復(fù)制型質(zhì)粒pBV101，同樣可寄存在大腸桿菌DH5α株，含pBV101質(zhì)粒的菌株命名為大腸桿菌DH5α/pBV101(EscherichiacoliDH5α/pBV101)，上述兩菌種均可在含0----100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％tryptone，0.5％yeastextract，1％NaCl)傳代培養(yǎng)。以下實(shí)施例對本發(fā)明的自主復(fù)制型肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的質(zhì)粒pEBAF制備和用途作了詳細(xì)說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。在這些實(shí)施例中，HepG2(日本RikenCellBankRCB0459)、BEL7402(陳瑞銘實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1978，1137--47)是表達(dá)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞系，SMMC7721(董春榮第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1980，15--9)是不表達(dá)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞系、Hela細(xì)胞(puck，T.etal.，J.Exp.Med.，1956，163272--284)是人宮頸癌上皮細(xì)胞系，A549細(xì)胞(美國ATCC185-CCL)是人肺癌上皮細(xì)胞系。實(shí)施例1質(zhì)粒的制備。pEBAF/DH5α接種于200mlLB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收菌體，加5ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重懸菌體，冰浴下加10ml溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，5分鐘后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml〕混勻，15000rpm離心15分鐘，上清加0.6倍體積異丙醇沉淀。沉淀以2mlTE溶液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH5.0)溶解，等體積酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提除蛋白質(zhì)，然后在Sepharose4B柱(15.0×1.0cm)凝膠過濾，收集流出的質(zhì)粒峰。實(shí)施例2以螢火蟲熒光素酶基因的克隆說明外源基因表達(dá)載體的構(gòu)建。從質(zhì)粒pMAMneoluc(CLONTECH#6171-1)以NheI、XhoI切下1.9kb含完整螢火蟲熒光素酶基因的DNA片段，插入與pEBAF多克隆位點(diǎn)XbaI、SalI處，構(gòu)建報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)為人甲胎蛋白基因調(diào)控序列所控制的質(zhì)粒pEBAFluc。實(shí)施例3克隆了外源基因的pEBAF載體在肝細(xì)胞的特異表達(dá)10μgpEBAFluc與25μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine(GibcoBRL#18324)混合與200μl細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫放置30分鐘，補(bǔ)培養(yǎng)液至1.0ml，分別直接加入培養(yǎng)約50萬的HepG2、BEL7402、SMMC7721、Hela、A549細(xì)胞中，48小時(shí)后測細(xì)胞熒光素酶活性，結(jié)果在表達(dá)甲胎蛋白的人肝細(xì)胞系HepG2、BEL7402中都能測出熒光素酶的顯著表達(dá)，而不表達(dá)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞系和非肝細(xì)胞系則檢不出活性。(附圖)實(shí)施例4pEBAF載體在細(xì)胞中的附加子特性與自主復(fù)制行為10μgpEBAFluc與25μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試Lipofectmine(GibcoBRL#18324)混合與200μl細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫放置30分鐘，補(bǔ)培養(yǎng)液至1.0ml，直接加入培養(yǎng)約100萬的HepG2，48小時(shí)后往培養(yǎng)基中加入200μg/ml潮霉素B，每隔3天換液1次，在選擇壓力下獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞提取染色體DNA以EB病毒探針進(jìn)行分子雜交，未能檢出載體與染色體整合的證據(jù)，提取的小分子DNA部分能檢出載體的存在，對甲基化敏感的限制酶DpnI、MboI切試驗(yàn)證實(shí)載體對上述酶的切割行為與在大腸桿菌中提取的質(zhì)粒不一樣，說明被導(dǎo)入細(xì)胞的載體的自主復(fù)制行為。權(quán)利要求1，一種在人肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體pEBAF，其特征在于由下列DNA元件組成(1)、肝癌細(xì)胞表達(dá)特異啟動子、增強(qiáng)子--------甲胎蛋白基因上游調(diào)控序列；(2)、甲胎蛋白啟動子、增強(qiáng)子之后有多個單酶切位點(diǎn)BamHI、SalI、PvuII供插入外源基因之用，多克隆位點(diǎn)后是源于SV40病毒的2533---2770bp處的加多聚腺苷酸信號序列；(3)、人細(xì)胞自主復(fù)制子及其反式作用因子-------EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制所需序列元件OriP、EBNA-I；(4)、真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志基因(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)；(5)、大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰氨酶基因)。2，一種在人肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體pEBAF(由權(quán)利要求1所述的五種DNA構(gòu)件所組成)的用途，其特征在于可應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的基因治療，外源基因可以是對細(xì)胞毒性的基因或細(xì)胞因子類基因，載體可通過物理方法，如脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染或細(xì)胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用導(dǎo)入宿主細(xì)胞，能游離于細(xì)胞染色體外自主復(fù)制，但甲胎蛋白啟動子控制表達(dá)的外源基因僅在表達(dá)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞才發(fā)生轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮功能，因此可選擇性殺死腫瘤細(xì)胞。3，根據(jù)權(quán)利要求1和2人肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體pEBAF其特征在于，可克隆任何外源基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的原代或傳代肝細(xì)胞用于原發(fā)性肝癌的基因治療。4，根據(jù)權(quán)利要求1和2人肝癌細(xì)胞特異表達(dá)的自主復(fù)制型載體pEBAF，其特征在于可克隆任何外源基因以非病毒感染的方式導(dǎo)入體內(nèi)用于原發(fā)性肝癌的基因治療。全文摘要一種在人肝癌細(xì)胞特異病毒的自主復(fù)制型載體及其用途，它是由肝癌細(xì)胞特異的啟動子——甲胎蛋白基因的啟動子、EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制子及其反式作用因子、真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志、和帶大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌質(zhì)粒骨架所組成。它可以非病毒感染的形式將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)自主復(fù)制和僅在產(chǎn)甲胎蛋白的肝癌細(xì)胞才發(fā)生特異表達(dá)，具有比直接使用重組病毒顆粒直接感染細(xì)胞更高的安全性，主要用于原發(fā)性肝癌的基因治療，可選擇性殺死腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的功能。文檔編號A61K48/00GK1135531SQ96101408公開日1996年11月13日申請日期1996年2月14日優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日發(fā)明者顏?zhàn)臃f,侯云德,喬健,李福勝申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所