專利名稱：一種播散肝癌細(xì)胞的分離和鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種播散肝癌細(xì)胞的分離和鑒定方法。
背景技術(shù)：
腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過程。存在于原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤之外的腫瘤細(xì)胞統(tǒng) 稱為播散腫瘤細(xì)月包(Disseminated tumor cell, DTC)，亦稱游離腫瘤細(xì)胞(Isolated tumor cell, ITC)，包括淋巴結(jié)、骨髓和血液等組織中的單個(gè)或小簇腫瘤細(xì)胞。其中進(jìn)入血流的又 稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell, CTC)。
原發(fā)性肝細(xì)胞癌是我國最常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一。盡管近年來治療手段不斷增加， 但并沒有從根本上改變肝癌高死亡率的狀況。究其原因，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高是影響肝癌遠(yuǎn)期療效 的主要因素。肝癌細(xì)胞可以在很早期播散，大多通過血液和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，甚至播散到胸水， 腹水等體液中。因此，播散肝癌細(xì)胞檢測可以作為肝癌早期診斷的一個(gè)標(biāo)記物、作為肝癌細(xì) 胞隱匿播散的一個(gè)確鑿證據(jù)以及作為監(jiān)測療效和預(yù)測復(fù)發(fā)的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。
以往通常采用RT-PCR檢測白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)mRNA來檢測血 循環(huán)中肝癌細(xì)胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特異性不高、操作復(fù)雜、不能估算樣本中腫 瘤細(xì)胞的數(shù)目等。此外，更不可忽視的是，RT-PCR法須破壞細(xì)胞形態(tài)，不能對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞 進(jìn)行觀察、分析和計(jì)數(shù)，而這些數(shù)據(jù)可提供CTC惡性程度和侵襲性方面的信息。故創(chuàng)建行之 有效的播散肝癌細(xì)胞分離/檢測系統(tǒng)，直接對(duì)分離到的播散肝癌細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分析和計(jì)數(shù)， 對(duì)于進(jìn)一步提高肝癌的診斷水平乃至治療效果無疑具有重要意義。
目前常用的播散腫瘤細(xì)胞分離方法是利用單克隆抗體識(shí)別帶有特異表面標(biāo)記的腫瘤細(xì) 胞.包括流式細(xì)胞儀和免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)。前者儀器昂貴，費(fèi)用很高，技術(shù)復(fù)雜，經(jīng)常 會(huì)被所分選細(xì)胞的容量、活性、無菌度等問題所困擾，并且也不能提供有關(guān)細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面 的信息。后者只要是具有特異性表面標(biāo)記的細(xì)胞，不論其含量高低均可以得到分離或富集， 不僅細(xì)胞處理量大(可達(dá)109以上)，分離純度高(可達(dá)95%-99.9%)，而且易于獲得無菌的 細(xì)胞制劑。目前這一技術(shù)在腫瘤學(xué)研究上更多的是利用上皮細(xì)胞單克隆抗體來富集外周血上 皮細(xì)胞，進(jìn)而應(yīng)用RT-PCR等分子生物學(xué)方法或流式細(xì)胞術(shù)鑒定上皮類腫瘤細(xì)胞。遺撼的是， 由于缺乏相應(yīng)的肝癌細(xì)胞表面抗體，迄今鮮見上述兩種方法用于分選播散肝癌細(xì)胞。雖然從理論上講上皮細(xì)胞抗體磁珠也可被用來分選屬于上皮類的肝癌細(xì)胞，但是這些抗體通常只能 識(shí)別部分肝癌細(xì)胞。比如上皮細(xì)胞抗體Ber-EP4單抗只能識(shí)別約67%的肝癌細(xì)胞(Latza U et al. Be:r-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from 腦othelial [J]. J Clin Pathol, 1990, 43(3) :213-9,)。
Ashwell和Morell于20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜表面存在一種肝結(jié) 合蛋白——去唾液酸糖蛋白受體(asialoglyc叩rotein rec印tor， ASGPR)，又稱半乳糖受體 (Morell AG et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin, V. Metabolic studies on sialic acid-free ceruloplasmin in vivo [J]. J Biol Chem' 1968， 243(1) :155-159.) 。 ASGPR是一種跨膜蛋白，其胞外區(qū)含有糖識(shí)別區(qū)(carbohydrate recognition domain, CRD)，能專一性識(shí)別和結(jié)合以半乳糖殘基和N-乙酰半乳糖胺殘基為 端基的糖蛋白(配體)。ASGPR主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物肝賣狀隙的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面，密度很高， 每個(gè)肝細(xì)胞表面可多達(dá)500， 000個(gè)受體。這一特性已被用于設(shè)計(jì)多種實(shí)驗(yàn)研究，比如，利用 放射性核素標(biāo)記這樣的糖蛋白進(jìn)行肝顯像；而以這樣的糖蛋白為載體介導(dǎo)基因或藥物導(dǎo)向肝 實(shí)質(zhì)細(xì)胞，則是肝靶向治療領(lǐng)域的一個(gè)研究命題。但至今未有基于ASGPR來分離播散肝癌細(xì) 胞的報(bào)道。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出敏感、特異、高效和簡便的播散肝癌細(xì)胞分離方法和檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝癌細(xì)胞的分離和鑒定方法，以及本發(fā)明方法所分離到的肝癌細(xì)胞。
發(fā)明人利用ASGPR配體或針對(duì)ASGPR胞外區(qū)的單克隆抗體，創(chuàng)建了基于ASGPR的免疫磁 珠分離播散肝癌細(xì)胞的技術(shù)，從而解決由于缺乏肝癌細(xì)胞表面單克隆抗體所面臨的困擾。由 于正常肝細(xì)胞不會(huì)進(jìn)入血循環(huán)或體液中，只有肝癌細(xì)胞才有可能，因此按照本發(fā)明方法分離 得到的細(xì)胞就是肝癌細(xì)胞。然后采用針對(duì)上皮組織來源腫瘤細(xì)胞的抗體CK3-6H5進(jìn)行免疫細(xì) 胞化學(xué)檢測或者采用流式細(xì)胞儀檢測分離到的播散肝癌細(xì)胞。
本發(fā)明的第一方面提供了一種肝癌細(xì)胞的分離方法，所述分離方法包括下述步驟-
(a) 采集樣品；
(b) 從樣品中分離單個(gè)核細(xì)胞；
(c) 以與ASGPR特異結(jié)合的物質(zhì)A與單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)ASGPR的細(xì)胞結(jié)合，所述物質(zhì)A與磁珠間接連接，形成復(fù)合物B;
(d)磁性分離步驟(c)中的復(fù)合物B。 上述物質(zhì)A選自ASGPR的配體或抗體。
上述ASGPR的配體為可與ASGPR的糖識(shí)別區(qū)(CRD)特異結(jié)合的蛋白、糖、多肽或核酸。 上述與ASGPR的CRD特異結(jié)合的蛋白為以半乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白， 優(yōu)選去唾液酸胎球蛋白。
上述ASGPR的抗體為針對(duì)ASGPR胞外區(qū)的抗體。上述抗體為單克隆抗體。在實(shí)施例中， 所述抗體為小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
上述肝癌細(xì)胞的分離方法，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。其他體液為淋巴液、 胸水或腹水等。
上述步驟(b)中采取的分離方法為密度梯度細(xì)胞分離法。上述密度梯度細(xì)胞分離法所 采用的密度梯度液為Ficoll或Percoll。
上述物質(zhì)A為ASGPR的配體，上述步驟(c)的具體歩驟為
(f) 先以ASGPR的配體-生物素與單個(gè)核細(xì)胞中的肝癌細(xì)胞結(jié)合形成復(fù)合物1;
(g) 再以C-磁珠與復(fù)合物1結(jié)合，形成復(fù)合物Bl;
所述C為與生物素特異結(jié)合的物質(zhì)。 上述C為生物素抗體或鏈霉親和素。
上述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應(yīng)濃度為0. 1-0.8mg/ml，較佳的去唾液酸胎球 蛋白的反應(yīng)濃度為0. 4-0. 8mg/ml ，優(yōu)選0. 4mg/ml 。
上述物質(zhì)A為ASGPR抗體，上述步驟(c)的另一具體步驟為
(h) 先以ASGPR抗體與單個(gè)核細(xì)胞中的肝癌細(xì)胞結(jié)合形成復(fù)合物3; (I)再以二抗-磁珠與復(fù)合物3結(jié)合，形成復(fù)合物B3。
上述抗體為ASGPR單抗；上述步驟(h)中ASGPR單抗的濃度為0. 1-5. On g/ml，較佳的 ASGPR單抗?jié)舛葹?. 0-4. 0 u g/ml ，優(yōu)選2. 0 u g/ml 。
上述ASGPR單抗為小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
本發(fā)明的第二方面提供一種上述分離方法分離到的肝癌細(xì)胞。所分離到的肝癌細(xì)胞完整 無破壞。所述肝癌細(xì)胞可以用于形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色，從而進(jìn)行計(jì)數(shù)；并可用于 培養(yǎng)擴(kuò)增以及進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。
本發(fā)明的第三方面提供了一種肝癌細(xì)胞的鑒定方法，所述鑒定方法為在上述分離方法后增加步驟(e)，檢測鑒定肝癌細(xì)胞是否存在。
上述步驟(e)中可以采用免疫細(xì)胞化學(xué)法或者流式細(xì)胞儀檢測鑒定。 免疫細(xì)胞化學(xué)法是一個(gè)成熟的技術(shù)。將磁性分離獲得的細(xì)胞，通過細(xì)胞離心涂片機(jī)或手 工制成細(xì)胞涂片，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，即可在一張細(xì)胞涂片上進(jìn)行肝癌細(xì)胞的檢測 和計(jì)數(shù)。所采用的一抗可為針對(duì)上皮組織來源腫瘤細(xì)胞的抗體、針對(duì)肝癌細(xì)胞的抗體或針對(duì) 肝細(xì)胞的抗體。上述抗體包括但不限于針對(duì)上皮組織來源腫瘤細(xì)胞的抗體如CK3-6H5;針 對(duì)肝癌細(xì)胞的抗體如AFP抗體；或針對(duì)肝細(xì)胞的抗體如Hep par 1抗體或白蛋白抗體等都可 以用于鑒定肝癌細(xì)胞。
對(duì)于流式細(xì)胞儀檢測鑒定，若采用ASGPR抗體，其工作濃度為0. l-5.0ng/ml。較佳的 工作濃度為2. 0-4. On g /ml，優(yōu)選2.0itg /ml。若采用去唾液酸胎球蛋白，其工作濃度為 0. 1-0. 8mg/ml 。較佳的工作濃度為0. 4-0. 8mg/ml ，優(yōu)選0. 4mg/ml 。
在流式細(xì)胞儀檢測中，根據(jù)熒光標(biāo)記抗體的情況不同，我們將熒光染色法分為直接熒光 染色法和間接熒光染色法，然而直接熒光標(biāo)記法雖然簡單快速，引入的非特異性結(jié)合千擾少， 但是需要有相對(duì)應(yīng)的熒光直接標(biāo)記抗體，不僅價(jià)格較貴，而且在抗體的來源和使用上也受到 極大限制。熒光標(biāo)記的ASGPR配體和ASGPR抗體并無現(xiàn)成的商品，標(biāo)記起來也比較復(fù)雜。因 此，本發(fā)明實(shí)施例中采用間接熒光染色法。
采用本發(fā)明的分離方法和鑒定方法，敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡便。
本發(fā)明的其他方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1.氨基生物素試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin與蛋白質(zhì)的反應(yīng)原理。 圖2.不同濃度的生物素化去唾液酸胎球蛋白標(biāo)記H印3B細(xì)胞的流式圖。 A、 B、 C中，生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度依次為0. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml。 D 中，生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml。
圖3.不同濃度的小鼠抗人ASGPR單抗標(biāo)記Hep3B細(xì)胞的流式圖。
A、 B、 C中，小鼠抗人ASGPR單抗?jié)舛纫来螢?.0ug/ml、 2. Oug/ml、 4. Owg/ml。 D中， 小鼠抗人ASGPR單抗?jié)舛葹?. 0 u g/ml 。
圖4.利用生物素化去唾液酸胎球蛋白從肝癌患者外周血中分離到的播散肝癌細(xì)胞 (CK3-6H5， DAB染色)(X200)。
圖5.利用ASGPR單抗從肝癌患者外周血中分離到的播散肝癌細(xì)胞(CK3-6H5， DAB染色)(X200)。
具體實(shí)施例方式
本文所述二抗，即第二抗體，是相對(duì)第一抗體而言的。在本發(fā)明中，ASGPR為抗原，ASGPR 抗體為第一抗體，針對(duì)ASGPR抗體的抗體是二抗。
本發(fā)明所述其他體液為除血液外的常規(guī)體液，包括但不限于淋巴液、胸水、腹水。
所述"反應(yīng)濃度"為步驟(f)或步驟(h)中與肝癌細(xì)胞上的ASGPR結(jié)合時(shí)，ASGPR的配體 或者抗體的初始濃度，在具體實(shí)施例中，為去唾液酸胎球蛋白的初始濃度或小鼠抗人ASGPR 單抗的初始濃度。在本發(fā)明中，分別通過在分離到的單核細(xì)胞中加入無血清DMEM培養(yǎng)液或 PBS洗液來調(diào)節(jié)ASGPR的配體或抗體的初始濃度。
本發(fā)明所述"多肽"是指由3-50個(gè)氨基酸通過酰胺鍵(也稱肽鍵)相互連接而成的化合 物。氨基酸數(shù)目在50個(gè)以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所述"糖"包括多糖和單糖。單糖如半乳糖或N-乙酰半乳糖等，均可以作為配體 與肝癌細(xì)胞上的ASGPR結(jié)合。
本發(fā)明所述步驟(b)中從樣品中分離單個(gè)核細(xì)胞的方法有多種方法。如可以采用Ficoll
或Percoll等密度梯度液分離單個(gè)核細(xì)胞，也可以采用紅細(xì)胞裂解液裂解樣品中的紅細(xì)胞，
再離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。
本發(fā)明所述"磁珠間接連接"指，生物素化的ASGPR的配體或ASGPR的抗體先與目的細(xì)
胞(即肝癌細(xì)胞)上的ASGPR結(jié)合，然后用鏈霉親和素-磁珠或二抗-磁珠與ASGPR的抗體或
生物素化的ASGPR的配體結(jié)合。因此復(fù)合物B的結(jié)構(gòu)為目的細(xì)胞-ASGPR的配體-生物素-C-
磁珠(復(fù)合物B1)或目的細(xì)胞-ASGPR的抗體-二抗-磁珠(復(fù)合物B3)。上述C選自生物素抗
體或鏈霉親和素。當(dāng)然本發(fā)明也可以采取其他磁性顆粒。生物素與ASGPR的配體以共價(jià)鍵連接。
本發(fā)明所述熒光素選自異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅達(dá)明、四甲基異硫氰酸羅達(dá) 明或藻紅蛋白(PE)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重 量計(jì)算。實(shí)施例l生物素化去唾液酸胎球蛋白的制備
主要材料氨基生物素化試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin (Pierce)，去唾液酸胎球蛋白 (Sigma) ， BCA蛋白定量試劑盒(Pierce) ， L-賴氨酸(國藥)，離心超濾管(截留分子量 50， 000) (Millipore)。
實(shí)驗(yàn)步驟去唾液酸胎球蛋白與氨基生物素化試劑反應(yīng)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。氨基生物 素化試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin能選擇性地與蛋白質(zhì)中的游離氨基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)式如圖1 所示。
反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液移入離心超濾管，25°C， 4000g，離心20min。然后在離心管中加 入雙蒸水和L-賴氨酸，使總體積為3ml， L-賴氨酸終濃度為0. 08mg/ml，室溫放置lh。再將 離心超濾管于25°C， 4000g，離心20min。吸出超濾管中殘留液體，加適量雙蒸水稀釋。用 BCA蛋白定量試劑盒按照說明書操作，測定生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度。最后用雙蒸水 調(diào)整去唾液酸胎球蛋白濃度為3mg/ml， 0.22um濾器無菌過濾后50ul/管分裝，-20'C保存。
實(shí)施例2確定ASGPR配體和抗體的理想流式工作濃度
1.以下實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證生物素化去唾液酸胎球蛋白與ASGPR的反應(yīng)性，及確定生 物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。
主要材料PE標(biāo)記的小鼠抗人CD45單抗(IgGl)、 PE標(biāo)記的小鼠同型單抗(IgGl) 、 FITC 標(biāo)記的鏈霉親和素，均購自晶美公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS洗液 (PBS+1%FBS)，自配。
實(shí)驗(yàn)步驟
1) 計(jì)數(shù)500萬個(gè)H印3B肝癌細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)，20'C， 300g，離心5min,棄上清，用550 U 1無血清DMEM培養(yǎng)液重懸，充分混勻，100pl/管，分裝 入5個(gè)EP管，依次編為1 5號(hào)。l號(hào)管為空白對(duì)照管，2號(hào)管為同型對(duì)照管，3 5號(hào)管為 測試管。
2) 向3 5號(hào)管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3 5號(hào)管生物素化去唾液酸胎 球蛋白的終濃度依次為O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml'終體積均為150ul (體積不足部分 用無血清DMEM培養(yǎng)液補(bǔ)充)。向1、 2號(hào)管中各加入無血清DMEM培養(yǎng)液50u 1。 1~5號(hào)管 37。C孵育lh。
3) 向1 5號(hào)管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。4) 向1 5號(hào)管中各加入100 u 1無血清DMEM培養(yǎng)液。向2 5號(hào)管中各加入10 u 1 FITC 標(biāo)記的鏈霉親和素。向l號(hào)管中加入10y l無血清DMEM培養(yǎng)液。l 5號(hào)管室溫避光孵育20min。
5) 向1 5號(hào)管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。 每管500nl PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細(xì)胞儀及CellQuest軟件檢測分析。 結(jié)果
圖2中，A、 B、 C所對(duì)應(yīng)的生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度依次為O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、
0. 8mg/ml。從圖中可以看出，當(dāng)生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度從0. 2mg/ml增加到0. 4mg/ml 時(shí)，H印3B細(xì)胞熒光強(qiáng)度也相應(yīng)增加；而當(dāng)濃度繼續(xù)增加到0.8mg/ml時(shí)，H印3B細(xì)胞熒光強(qiáng) 度與濃度為0. 4mg/ml時(shí)相比并未增加?？梢姡锼鼗ネ僖核崽デ虻鞍着cASGPR的反應(yīng)性 好，當(dāng)生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml時(shí)，H印3B細(xì)胞表面的ASGPR即已飽和； 而當(dāng)濃度為0.8mg/ml時(shí)，生物素化去唾液酸胎球蛋白是過量的。故選擇0.4mg/ml作為生物 素化去唾液酸胎球蛋白的候選流式工作濃度。
以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)0. 4mg/ml是否為生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。 實(shí)驗(yàn)步驟
1) 計(jì)數(shù)250萬個(gè)HL-60細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)和100萬個(gè) H印3B肝癌細(xì)胞，混合后2(TC， 300g，離心5min，棄上清，用350 u 1無血清DMEM培養(yǎng)液重 懸，充分混勻，100ul/管，分裝入3個(gè)EP管，依次編為1 3號(hào)。l號(hào)管為空白對(duì)照管，2號(hào) 管為同型對(duì)照管，3號(hào)管為測試管。
2) 向3號(hào)管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3號(hào)管生物素化去唾液酸胎球蛋白 的終濃度為0.4mg/ml,終體積均為150 ixl (體積不足部分用無血清DMEM培養(yǎng)液補(bǔ)充)。向
1、 2號(hào)管中各加入無血清DMEM培養(yǎng)液50u 1 。 1 3號(hào)管37。C孵育lh。
3) 向1 3號(hào)管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。
4) 向1 3號(hào)管中各加入100ul無血清DMEM培養(yǎng)液。向3號(hào)管中各加入10 u 1 PE標(biāo)記 的小鼠抗人CD45單抗和10 u 1 FITC標(biāo)記的鏈霉親和素。向2號(hào)管中加入10ul PE標(biāo)記的小 鼠同型單抗和10 u 1 FITC標(biāo)記的鏈霉親和素。向1號(hào)管中加入20ul無血清DMEM培養(yǎng)液。1 3號(hào)管室溫避光孵育20min。
5) 向1 3號(hào)管中各加入lml PBS洗液'20'C， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。 每管500ul PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細(xì)胞儀及CellQuest軟件檢測分析。結(jié)果-
圖2 (D)中，橫坐標(biāo)為ASGPR-FITC，縱坐標(biāo)為CD45-PE。 CD45-ASGPR+定義為H印3B細(xì)胞， CD45+ASGPR—定義為HL-60細(xì)胞，CD45+ASGPR+定義為非特異性染色細(xì)胞。從圖中可以看出，當(dāng) 生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml時(shí)，H印3B細(xì)胞被充分標(biāo)記，且無非特異性染色。 可見，0.4mg/ml為生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。
2、流式細(xì)胞儀驗(yàn)證小鼠抗人ASGPR單抗與ASGPR胞外域的反應(yīng)性，及確定小鼠抗人ASGPR 單抗的理想流式工作濃度。
主要材料小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，為法國Dendritics公司產(chǎn)品。小鼠同型單抗 (IgGl) 、 FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgGl抗體、PE標(biāo)記的大鼠抗人CD45單抗(IgG2a)、 PE標(biāo) 記的大鼠同型單抗(IgG2a)，均購自晶美公司。PBS洗液(PBS+1%FBS)，自配。FACSAria 流式細(xì)胞儀，為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)步驟-
1) 計(jì)數(shù)500萬個(gè)H印3B肝癌細(xì)胞，20°C， 300g，離心5min，棄上清，用550 u 1 PBS洗 液重懸，充分混勻，100y 1/管，分裝入5個(gè)EP管，依次編為1 5號(hào)。l號(hào)管為空白對(duì)照管， 2號(hào)管為同型對(duì)照管，3 5號(hào)管為測試管。
2) 向3 5號(hào)管中加入小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，使得3 5號(hào)管小鼠抗人ASGPR單抗 的終濃度依次為1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4.0ug/ml，終體積均為110ul。向1號(hào)管中加入 PBS洗液10u 1，向2號(hào)管中加入lOu 1小鼠同型單抗(IgG1)。1 5號(hào)管室溫避光孵育20min。
3) 向1 5號(hào)管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。
4) 向1 5號(hào)管中各加入10CUi1 PBS洗液。向2 5號(hào)管中各加入10ul FITC標(biāo)記的大 鼠抗小鼠IgGl。向l號(hào)管中加入10ul PBS洗液。1 5號(hào)管室溫避光孵育20min。
5) 向1 5號(hào)管中各加入lml PBS洗液，20'C， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。 每管500ul PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細(xì)胞儀及CellQuest軟件檢測分析。 結(jié)果
圖3中，A、 B、 C所對(duì)應(yīng)的小鼠抗人ASGPR單抗?jié)舛纫来螢?.0ug/ml、 2. Oug/ml、 4.0 Ug/ml。從圖中可以看出，當(dāng)小鼠抗人ASGPR單抗?jié)舛葹?. 0ug/ml和4. Owg/ml時(shí)，H印3B 細(xì)胞熒光強(qiáng)度也相應(yīng)增加；而當(dāng)濃度繼續(xù)增加到4.0ug/ml時(shí)，H印3B細(xì)胞熒光強(qiáng)度與濃度 為2.0ng/ml時(shí)相比并未增加。可見，小鼠抗人ASGPR單抗與ASGPR的反應(yīng)性好，當(dāng)小鼠抗人ASGPR單抗?jié)舛葹?. 0 u g/ml時(shí)，H印3B細(xì)胞表面的ASGPR即已飽和；而當(dāng)濃度為4. 0 u g/ml 時(shí)，小鼠抗人ASGPR單抗是過量的。故選擇2.0ug/ml作為小鼠抗人ASGPR單抗的候選流式
工作濃度。
以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)2. 0 u g/ml是否為小鼠抗人ASGPR單抗的理想流式工作濃度。 實(shí)驗(yàn)步驟
1) 計(jì)數(shù)250萬個(gè)HL-60細(xì)胞和100萬個(gè)H印3B肝癌細(xì)胞，混合后20'C， 300g，離心5min， 棄上清，用350ulPBS洗液重懸，充分混勻，100yl/管，分裝入3個(gè)EP管，依次編為1 3 號(hào)。l號(hào)管為空白對(duì)照管，2號(hào)管為同型對(duì)照管，3號(hào)管為測試管。
2) 向3號(hào)管中加入小鼠抗人ASGPR單抗，使終濃度為2. Ong/ml，終體積為110ul。向 1號(hào)管中加入PBS洗液10n 1，向2號(hào)管中加入10n 1小鼠同型單抗(IgGl) 。 1 3號(hào)管室 溫避光孵育20min。
3) 向1 3號(hào)管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。
4) 向1 3號(hào)管中各加入100u 1PBS洗液。向3號(hào)管中各加入10ulPE標(biāo)記的小鼠抗人 CD45單抗(IgG2a)禾卩10ul FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。向2號(hào)管中加入10ul PE 標(biāo)記的大鼠同型單抗(IgG2a)和10u 1 FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。向1號(hào)管中加入 20ulPBS洗液。1 3號(hào)管室溫避光孵育20min。
5) 向1 3號(hào)管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重復(fù)1次。 每管500y 1 PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細(xì)胞儀及CellQuest軟件檢測分析。 結(jié)果
圖3 (D)中，橫坐標(biāo)為ASGPR-FITC，縱坐標(biāo)為CD45-PE。 CD45-ASGPR+定義為H印3B細(xì)胞， CD45+ASGPR—定義為HL-60細(xì)胞，CD45+ASGPR+定義為非特異性染色細(xì)胞。從圖中可以看出，當(dāng) 生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為2. Oug/ml時(shí)，H印3B細(xì)胞被充分標(biāo)記，且無非特異性染 色。可見，2.0ug/ml是小鼠抗人ASGPR單抗的理想流式工作濃度。
實(shí)施例3利用ASGPR配體分離和鑒定播散肝癌細(xì)胞
主要材料5ml肝癌患者志愿者的外周血，肝素抗凝。Ficoll-Paque Plus,購自GE Healthcare。磁性分離器、抗生物素磁珠、MS磁性分選柱、30 n m濾網(wǎng)、CK3-6H5抗體(上 皮組織來源的腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物抗體)均購自德國Miltenyi公司。Labofuge②400R臺(tái)式離心機(jī) (帶細(xì)胞離心涂片附件)，購自德國Heraeus公司。多聚賴氨酸玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒，購自美國GBI公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS 洗液(含O. 5%BSA、 80UAil肝素)，自配。試劑1: PBS洗液(含0. 5%BSA、 80U/ml肝素)試劑2:無血清DMEM培養(yǎng)液試劑3:生物素化去唾液酸胎球蛋白，3mg/ml試劑4:抗生物素磁珠步驟(A) Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞1) 將5ml肝素抗凝血、0. 2ml肝素、5ml試劑1于50ml離心管中混勻，平鋪于7ml Ficoll 上，18°C， 600g，離心25min。2) 吸棄上層血清。3) 吸取單個(gè)核細(xì)胞層，置于15ml離心管中。4) 加3倍體積試劑1， 18'C， 300g，離心10min。5) 吸棄上清，8ml試劑l重懸，18°C， 300g，離心10min。6) 徹底吸棄上清。(B) 磁珠分離播散肝癌細(xì)胞1) 力口 130y 1試齊U2。2) 力口20uli式齊U3，混勻。3) 37°C，孵育lh。4) 加5ml試劑l， 18。C, 300g，離心10min，吸棄上清。5) 重復(fù)上一步。6) 力口80u 1試齊U 1。7) 力口20u 1試齊IJ4，混勻。8) 4°C，孵育15min。9) 加5ml試劑l， 18°C， 300g，離心10min。10) 吸棄上清，500ul試劑l重懸(注意盡量不要產(chǎn)生氣泡)。11) 安裝MS磁性分選柱和濾網(wǎng)。12) 500 u 1試劑1加入濾網(wǎng)。13) 待分選柱下方液滴剛剛停止，即向?yàn)V網(wǎng)加入500u 1細(xì)胞懸液。14) 加500 u 1試劑1于15ml離心管中，洗滌殘留細(xì)胞。15) 待分選柱上方液體快流完時(shí)，加入500ul細(xì)胞懸液。16) 待分選柱上方液體快流完時(shí)，加入500ul試劑l。17) 重復(fù)上一步2次。18) 待分選柱下方液滴剛剛停止，將分選柱移出磁場，置于另一個(gè)無菌的15ml離心管上。19) 加lml試劑1于分選柱中，立即用活塞將液體快速推入離心管中。20) 重復(fù)上一步。21) 18°C， 300g，離心10min。22) 吸棄上清，100ul試劑l重懸。(C)播散肝癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 步驟1) 用離心涂片機(jī)將細(xì)胞涂片于多聚賴氨酸玻片上。2) 將玻片置于烤箱中，48°C。3) 待完全干燥后取出。4) 涼至室溫后，滴加lml固定液(95%乙醇)，置于濕盒中，15min 。5) 自來水沖洗數(shù)秒后浸泡于PBS中，2min。6) 甩去PBS，用吸水紙吸去細(xì)胞周圍水分。7) 免疫組化油筆畫圈(距離細(xì)胞區(qū)域邊緣約O. 5mm)。8) 滴加l滴Triton X-100,濕盒中常溫孵育10min。9) PBS洗，2min。10) 甩去PBS，滴加1滴3XHA，濕盒中常溫孵育10min。11) PBS洗，2minX3次。12) 加50nl l:50—抗(CK3-6H5)，濕盒中常溫孵育lh。13) PBS洗，2minX3次。14) 滴加1滴PV卯00試劑1，濕盒中常溫孵育20min。15) PBS洗，2minX3次。16) 滴加1滴PV9000試劑2，濕盒中常溫孵育20min。17) PBS洗，2minX3次。18) 力Q70ti1 DAB顯色液，顯色3 8min，鏡下觀察顯色情況。19) PBS沖洗，終止反應(yīng)。 結(jié)果從肝癌患者外周血中分離到19個(gè)播散肝癌細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果見圖4(CK3-6H5， MB染色)(X200) 。 A、 B、 C所示視野中分別有l(wèi)個(gè)、2個(gè)、1個(gè)較大的、胞漿呈棕黃色(圖 中為深灰)的細(xì)胞，即肝癌細(xì)胞。實(shí)施例4生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠與Ber-EP4抗體磁珠的回收率比較主要材料健康志愿者靜脈血，采用真空肝素抗凝管采血。H印3B肝癌細(xì)胞系，用含10%FBS (GIBCO)的DMEM培養(yǎng)液(GIBC0)培養(yǎng)。磁性分離器、Ber-EP4抗體磁珠、抗生物素磁珠、 MS磁性分選柱、30ym濾網(wǎng)、CK3-6H5抗體(上皮組織來源的腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物抗體)均購自 德國Miltenyi公司。Labofuge 400R臺(tái)式離心機(jī)(帶細(xì)胞離心涂片附件)，購自德國Heraeus 公司。多聚賴氨酸玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒，購自美國GBI 公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS洗液(含0.5MBSA、 80U/ml肝素)，自配。實(shí)驗(yàn)方法將10 40個(gè)H印3B肝癌細(xì)胞摻入5ml肝素抗凝的健康志愿者靜脈血樣本中。 按照實(shí)施例3的方法分離單個(gè)核細(xì)胞。生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠組分離 H印3B細(xì)胞步驟同實(shí)施例3。 Ber-EP4抗體磁珠組分離H印3B細(xì)胞步驟按照說明書進(jìn)行。離心 涂片、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定步驟同實(shí)施例3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次?；厥章视镁鶖?shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。健康志愿者的靜脈血中摻入不同數(shù)目(10 40)的H印3B細(xì)胞，經(jīng)Ficoll分離單個(gè)核細(xì) 胞后，分別用生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠和Ber-EP4抗體磁珠分離回收 H印3B細(xì)胞，生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠的回收率(82. 6 0顯著高于Ber-EP4 抗體磁珠的回收率(48.9%)(代0.Q5)(見表l)。表l.不同磁珠從播散肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蟹蛛x所摻入的H印3B肝癌細(xì)胞細(xì)胞株磁珠摻入的細(xì)胞數(shù)回收率(％)H印3B生物素化去唾液 酸胎球蛋白/生物 素抗體磁珠10/20/30/4082. 6±6. 7H印3BBer-EP4抗體磁珠10/20/30/4048. 9±5. 6實(shí)施例5利用針對(duì)ASGPR胞外區(qū)的單克隆抗體分離和鑒定播散肝癌細(xì)胞 主要材料5ml肝癌患者志愿者的外周血，EDTA抗凝。Ficoll-Paque Plus,購自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，購自法國Dendritics公司。磁性分離器、大鼠抗小鼠IgGl抗體磁珠、MS磁性分選柱、30um濾網(wǎng)、CK3-6H5 (針對(duì)上皮組織來源腫瘤細(xì)胞的 抗體)均購自德國Miltenyi公司。LabofUge 400R臺(tái)式離心機(jī)(帶細(xì)胞離心涂片附件)，購 自德國Heraeus公司。多聚賴氨酸玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒， 購自美國GBI公司。PBS洗液(含2mM EDTA和0. 5%BSA),自配。 步驟(A) Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 具體操作步驟同實(shí)施例3 Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞部分。(B) 磁珠分離播散肝癌細(xì)胞1) 130ul PBS洗液重懸細(xì)胞。2) 加20u 1小鼠抗人ASGPR單抗，混勻。3) 室溫孵育20min。4) 加5ml PBS洗液，18°C， 300g，離心10min，吸棄上清。5) 重復(fù)上一步。6) 力口80u 1 PBS洗液。7) 加20ul大鼠抗小鼠IgGl抗體磁珠，混勻。8) -22)步同實(shí)施例3相應(yīng)部分。(C) 播散肝癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 操作步驟同實(shí)施例3相應(yīng)部分。結(jié)果從肝癌患者外周血中分離到13個(gè)播散肝癌細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果見圖5(CK3-6H5， DAB染色)(X200) 。 A、 B所示視野中各有l(wèi)個(gè)較大的、胞漿呈棕黃色(圖中為深灰)的細(xì) 胞，即肝癌細(xì)胞。實(shí)施例6抗ASGPR單抗/二抗磁珠與Ber-EP4抗體磁珠的回收率比較主要材料健康志愿者靜脈血，采用真空EDTA抗凝管采血。H印3B肝癌細(xì)胞系，用含10%FBS (GIBC0)的DMEM培養(yǎng)液(GIBC0)培養(yǎng)。小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，購自法國Dendritics 公司。磁性分離器、Ber-EP4抗體磁珠、大鼠抗小鼠IgGl抗體磁珠、MS磁性分選柱、30 y m 濾網(wǎng)、CK3-6H5 (針對(duì)上皮組織來源腫瘤細(xì)胞的抗體)均購自德國Miltenyi公司。 LabOfuge 400R臺(tái)式離心機(jī)(帶細(xì)胞離心涂片附件)，購自德國Heraeus公司。多聚賴氨酸 玻片，購自福建邁新公司。PV9000 二步法免疫組化試劑盒，購自美國GBI公司。PBS洗液(含2mM EDTA禾tl 0. 5%BSA)，自配。實(shí)驗(yàn)方法將10 40個(gè)H印3B肝癌細(xì)胞摻入5ml EDTA抗凝的健康志愿者靜脈血樣本中。 按照實(shí)施例5的方法分離單個(gè)核細(xì)胞。抗ASGPR單抗/二抗磁珠組分離H印3B細(xì)胞步驟同實(shí)施 例5。 Ber-EP4抗體磁珠組分離H印3B細(xì)胞步驟按照說明書進(jìn)行。離心涂片、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒 定步驟同實(shí)施例5。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。回收率用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。健康志愿者的靜脈血樣本中摻入不同數(shù)目(10 40)的H印3B細(xì)胞，經(jīng)Ficoll分離單個(gè) 核細(xì)胞后，分別用抗ASGPR單抗/二抗磁珠和Ber-EP4抗體磁珠分離回收H印3B細(xì)胞，抗ASGPR 單抗/二抗磁珠的回收率(85. 3%)高于Ber-EP4抗體磁珠的回收率(48.9%)(代0.05)(見 表2)。表2.不同磁珠從播散肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蟹蛛x所摻入的H印3B肝癌細(xì)胞細(xì)胞株磁珠摻入的細(xì)胞數(shù)回收率(％)Hep3BASGPR單抗/二抗 磁珠10/20/30/4085. 3±4. 1Hep3BBer-EP4抗體磁珠10/20/30/4048. 9±5. 6本發(fā)明使用生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗體磁珠或抗ASGPR單抗/二抗磁珠分離 肝癌細(xì)胞，其回收率均顯著高于Ber-EP4抗體磁珠的回收率。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作 為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本 發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種肝癌細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括下述步驟(a)采集樣品；(b)從樣品中分離單個(gè)核細(xì)胞；(c)以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結(jié)合的物質(zhì)A與單個(gè)核細(xì)胞中的肝癌細(xì)胞結(jié)合，所述物質(zhì)A與磁珠間接連接，形成復(fù)合物B；(d)磁性分離步驟(c)中的復(fù)合物B。
2. 權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述物質(zhì)A選自ASGPR的配體或抗體。
3. 權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(b)中采取的分離方法為密度梯度細(xì) 胞分離法。
4. 權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。
5. 權(quán)利要求4所述的分離方法，其特征在于，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。
6. 權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為ASGPR的配體，所述ASGPR的配 體為可與ASGPR的糖識(shí)別區(qū)(CRD)特異結(jié)合的蛋白、糖、多肽或核酸。
7. 權(quán)利要求6所述的分離方法，其特征在于，所述可與ASGPR的CRD特異結(jié)合的蛋白為以半 乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。
8. 權(quán)利要求7所述的分離方法，其特征在于，所述可與ASGPR的CRD特異結(jié)合的蛋白為去唾 液酸胎球蛋白。
9. 權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為ASGPR胞外區(qū)的抗體。
10. 權(quán)利要求9所述的分離方法，其特征在于，所述ASGPR胞外區(qū)的抗體為單克隆抗體。
11. 權(quán)利要求1-8任一權(quán)利要求所述的肝癌細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為ASGPR 的配體，所述步驟(c)的具體步驟為(f )先以ASGPR的配體-生物素與單個(gè)核細(xì)胞中的肝癌細(xì)胞結(jié)合形成復(fù)合物1; (g)再以C-磁珠與復(fù)合物1結(jié)合，形成復(fù)合物B1; 所述C為與生物素特異結(jié)合的物質(zhì)。
12. 權(quán)利要求11所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(f)中ASGPR的配體為去唾液酸胎 球蛋白；C為鏈霉親和素或生物素抗體。
13. 權(quán)利要求12所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應(yīng)濃 度為0. 1-0. 8mg/ml。
14.權(quán)利要求13所述的肝癌細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋 白的反應(yīng)濃度為0.4-0.8mg/ml。
15. 權(quán)利要求1-5、 9-10任一權(quán)利要求所述的肝癌細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述物質(zhì)A 為ASGPR抗體，所述步驟(c)的具體步驟為(h)先以ASGPR抗體與肝癌細(xì)胞結(jié)合形成復(fù)合物3;(I)再以二抗-磁珠與復(fù)合物3結(jié)合，形成復(fù)合物B3。
16. 權(quán)利要求15所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR抗體為小鼠抗人ASGPR 單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
17. 權(quán)利要求16所述的分離方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反應(yīng)濃度為 0.l-5 y g/ml。
18. 權(quán)利要求17所述的肝癌細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反 應(yīng)濃度為2-4u g/ml。
19. 權(quán)利要求1-10、 12-14、 16-18任一權(quán)利要求所述的分離方法所分離的肝癌細(xì)胞。
20. —種肝癌細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于，包括下述步驟(a) 采集樣品；(b) 從樣品中分離單個(gè)核細(xì)胞；(c) 以與去唾液酸糖蛋白受體特異結(jié)合的物質(zhì)A與單個(gè)核細(xì)胞中的肝癌細(xì)胞結(jié)合，所述物質(zhì) A與磁珠間接連接，形成復(fù)合物B;(d) 磁性分離步驟(c)中的復(fù)合物B;(e) 檢測鑒定肝癌細(xì)胞是否存在。
21. 權(quán)利要求20所述的鑒定方法，其特征在于，所述物質(zhì)A選自ASGPR的配體或抗體。
22. 權(quán)利要求20所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(b)中采取的分離方法為密度梯度 細(xì)胞分離法。
23. 權(quán)利要求20所述的鑒定方法，其特征在于，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。
24. 權(quán)利要求23所述的鑒定方法，其特征在于，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。
25. 權(quán)利要求21所述的鑒定方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為ASGPR的配體，所述ASGPR的 配體為可與ASGPR的糖識(shí)別區(qū)(CRD)特異結(jié)合的蛋白、糖、多肽或核酸。
26. 權(quán)利要求25所述的鑒定方法，其特征在于，所述可與ASGPR的CRD特異結(jié)合的蛋白為以 半乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。
27. 權(quán)利要求26所述的鑒定方法，其特征在于，所述可與ASGPR的CRD特異結(jié)合的蛋白為去 唾液酸胎球蛋白。
28. 權(quán)利要求21所述的鑒定方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為ASGPR胞外區(qū)的抗體。
29. 權(quán)利要求28所述的鑒定方法，其特征在于，所述ASGPR胞外區(qū)的抗體為單克隆抗體。
30. 權(quán)利要求20-27任一權(quán)利要求所述的肝癌細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為 ASGPR的配體，所述步驟(c)的具體步驟為(f) 先以ASGPR的配體-生物素與單個(gè)核細(xì)胞中的肝癌細(xì)胞結(jié)合形成復(fù)合物l;(g) 再以C-磁珠與復(fù)合物1結(jié)合，形成復(fù)合物B1; 所述C為與生物素特異結(jié)合的物質(zhì)。
31. 權(quán)利要求30所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(f)中ASGPR的配體為去唾液酸胎 球蛋白；C為鏈霉親和素或生物素抗體。
32. 權(quán)利要求31所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋白的反應(yīng)濃 度為0. 1-0. 8mg/ml。
33. 權(quán)利要求32所述的肝癌細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(f)中去唾液酸胎球蛋 白的反應(yīng)濃度為0. 4-0. 8mg/ml 。
34. 權(quán)利要求20-24任一權(quán)利要求所述的肝癌細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于，所述物質(zhì)A為 ASGPR抗體，所述步驟(c)的具體步驟為(h) 先以ASGPR抗體與肝癌細(xì)胞結(jié)合形成復(fù)合物3; (I)再以二抗-磁珠與復(fù)合物3結(jié)合，形成復(fù)合物B3。
35. 權(quán)利要求34所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR抗體為小鼠抗人ASGPR 單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
36. 權(quán)利要求35所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反應(yīng)濃度為 0.卜5u g/ml。
37. 權(quán)利要求36所述的肝癌細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(h)中ASGPR單抗的反 應(yīng)濃度為2-4y g/ml。
38. 權(quán)利要求20所述的肝癌細(xì)胞的鑒定方法，其特征在于，所述步驟(e)中采用免疫細(xì)胞化 學(xué)法或者流式細(xì)胞儀檢測鑒定。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種播散肝癌細(xì)胞的分離和鑒定方法，所述方法基于肝癌細(xì)胞膜上的去唾液酸糖蛋白受體，利用去唾液酸糖蛋白受體的配體或者抗體與肝癌細(xì)胞結(jié)合，然后用磁珠間接標(biāo)記所述肝癌細(xì)胞進(jìn)行陽性分離富集，再用免疫細(xì)胞化學(xué)方法或流式細(xì)胞儀等方法鑒定、檢測，可判斷標(biāo)本中是否存在肝癌細(xì)胞。該方法可用于肝癌的診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測及療效監(jiān)測等。本發(fā)明方法可以檢測播散肝癌細(xì)胞，其敏感性高、特異性好，且操作簡便。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101302495SQ20081004019
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者康曉燕, 文 徐, 殷正豐 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)