專(zhuān)利名稱(chēng)：新型同多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二氨基單羧酸的新型同多肽、其鹽類(lèi)、旋光異構(gòu)體及其外消旋體。此外，本發(fā)明還涉及制備這些化合物的方法。
更具體地講，本發(fā)明涉及二氨基一元羧酸的同多肽，其結(jié)構(gòu)如通式(Ⅰ)所示
式中R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自代表氫或C1-4烷基(進(jìn)一步地講代表低級(jí)烷基)，r為10-400的平均值。
m為0-10的整數(shù)，n為0-10的整數(shù)。
上式中各取代基可以相同或不同。
人們都知道，二氨基一元羧酸的同多肽在自然界中很少見(jiàn)它存在于某些肽抗菌素內(nèi)、細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)、若干蛋白質(zhì)的交聯(lián)鍵內(nèi)和Clavicepamines之中。其中某些表現(xiàn)出生物效應(yīng)并且也可采用微生物方法制備。
按照日本的研究結(jié)果，由25-30個(gè)通過(guò)異肽鍵彼此連接在一起的單體單元組成的L-賴(lài)氨酸聚合物可通過(guò)鏈霉菌產(chǎn)生〔Shima和Sakai《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》45，2503(1981)〕。這種聚-ε-L-賴(lài)氨酸能夠使各種噬菌體鈍化《Shima等人《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》46，1917(1982)〕，并且可應(yīng)用生物合成方法制備該物質(zhì)〔Sima等人NipponNogeKagaKuKaishi57，221-226(1983)〕。
Clavicepamines為由麥角的腐物寄生培養(yǎng)物(麥角菌)分離出的富含有賴(lài)氨酸的堿性蛋白質(zhì)，對(duì)人體用藥很重要。這些蛋白質(zhì)可被化學(xué)分離為分子量為2，000-17，000并且賴(lài)氨酸含量為30-95%(摩爾)的化合物。其生物檢測(cè)結(jié)果表明具有細(xì)胞增生延遲效果，所以它們能夠抑制動(dòng)物腫瘤的生長(zhǎng)，而實(shí)際應(yīng)用中又不會(huì)產(chǎn)生有毒的副作用(TycKaK學(xué)術(shù)論文，1978)。
結(jié)構(gòu)測(cè)定的結(jié)果表明，ε-賴(lài)氨酸(多)肽為Clavicepamines的基本結(jié)構(gòu)單元〔SzoKan，Kelemen和ToroKJ.Chromatogr283(1986)〕。在所期望的Clavicepamines生物效果中聚異賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)單元所起的作用至今仍是未知的。
合成聚-L-異賴(lài)氨酸、其與氨基酸形成的?；苌镆约熬?β-L-α，β-二氨基丙酸的抗病毒活性已被印度研究人員測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些多肽不僅具有抗病毒活性，同時(shí)具備誘發(fā)CAM培養(yǎng)物中類(lèi)似于干擾素的抗病毒因子的能力〔印度《實(shí)驗(yàn)生物學(xué)雜志》20，227(1982);“印度化學(xué)雜志”21B，483(1982)〕。
為了研究化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物效果間的關(guān)系，本發(fā)明的目的是以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)具有給定分子量和低多分散性，由10-400個(gè)單元組成的、L-二氨基-元羧酸的異肽。對(duì)所需化合物的基本要求是純度高、多分散性低和立體化學(xué)純度高。
眾所周知，生物聚合物所產(chǎn)生的效果受其分子量分布的影響很大。由于不同的旋光異構(gòu)體具有對(duì)立的及不同的生物效果，例如動(dòng)物腫瘤的生長(zhǎng)會(huì)受到D-精氨酸的抑制，但是L-精氨酸會(huì)對(duì)其起到促進(jìn)作用，因此，氨基酸的構(gòu)型非常重要〔Szende和TyihaKLancet2546，824(1968)Szende學(xué)術(shù)論文，1974〕。外消旋混合物或外消旋聚合物不能表現(xiàn)出原有的、適宜的生物效果。
所需多肽應(yīng)具備高純度和低多分散性?？蛇x用合成法解決這一問(wèn)題。采用α-Z-保護(hù)賴(lài)氨酸活性酯〔Hull法，《生物聚合物》17，2427(1978)〕和α-BOC-保護(hù)賴(lài)氨酸-五氯苯基-酯〔Gangopadhyay和Mathur法，“印度化學(xué)雜志”21B483(1982)〕進(jìn)行縮聚。按照Nishi法〔Int.J.Biol.Macromd.2，53(1980)〕，通過(guò)二苯基磷?；B氮化物(DPPA)使α-Z-賴(lài)氨酸-OH聚合。上述文章的作者未公開(kāi)任何涉及這些產(chǎn)物的分子量，分子量分布和旋光純度的數(shù)據(jù)。我們的經(jīng)驗(yàn)表明所獲得的低分子量(最大值為2500)和高多分散性的產(chǎn)物的產(chǎn)率較低，且不具備任何生物效果。Kushawa和其合作者〔生物聚合物19，219(1980)〕及Mathur等人〔Int.J.PeptideProt.Res.17，189(1981)〕的合成方法是最為適用的低分散性產(chǎn)物的制備法。通過(guò)這些方法可制備ε-聚賴(lài)氨酸和δ-聚烏氨酸。方法的原理對(duì)兩種化合物均相同以得到保護(hù)的氨基酸甲酯與得到保護(hù)的活性酯或疊氮化物為原料，首先制備三肽一甲基酯。經(jīng)堿解后，將三肽-酸活化為活性酯的形式(轉(zhuǎn)變?yōu)樗奈迓缺交?。于ω-氨基終端解除保護(hù)后，得到三肽，它具有縮聚反應(yīng)活性。最后，脫除α-氨基保護(hù)基，分離出同多肽。在這些步驟中，在α-位使用了BOC保護(hù)基，在ω-位使用了Z-氨基保護(hù)基。可分別通過(guò)強(qiáng)酸處理和催化加氫脫除這些保護(hù)基。在上述內(nèi)容中，未提及特征的作為聚合物旋光純度數(shù)據(jù)及分子量、分子量分布。
本文所用簡(jiǎn)稱(chēng)及其含義如下所示Z.芐氧羰基BOC叔丁氧羰基-ONp對(duì)硝基苯基-OSnN-羥基-琥珀酰亞氨基-OPcp五氯苯基-OPfp五氟苯基-OBtN-羥基-苯并三唑基BuOCO異丁氧羰基EtOCO乙氧羰基N3疊氮基EEDQN-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫異喹啉EtOAc乙酸乙酯
IIDQN-異丁氧羰基-2-異丁氧基-1，2-二氫異喹啉THF四氫呋喃DMF二甲基甲酰胺HPLC高性能液相色譜OPTLC超壓薄層色譜IEF等電點(diǎn)聚焦MS質(zhì)譜NMR核磁共振譜Zco2由釋出CO2測(cè)得的Z-基MW分子量TLC薄層色譜BuOH 丁醇AcOH乙酸在重復(fù)進(jìn)行這些方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在下列缺點(diǎn)在齊聚物制備過(guò)程中，其羧基一直受到甲基酯的保護(hù)，所以得到的齊聚物無(wú)法直接用于縮聚反應(yīng)。為了得到活性中間體，可由相應(yīng)的甲基酯經(jīng)堿解釋出羧基。這一步驟導(dǎo)致了外消旋化及其它副反應(yīng)發(fā)生，從而降低了產(chǎn)率。不利的結(jié)果是生成的聚合物具有高多分散性。此外，由于芐氧羰基ω-氨基保護(hù)基可被催化加氫脫除，因此，它的應(yīng)用同樣存在不足之處。如此制得的聚合物在我們的生物試驗(yàn)中失效。
本發(fā)明的目的是通過(guò)研究出一種從未用于生產(chǎn)二氨基二元羧酸的異肽的新方法以便克服上述缺點(diǎn)。
本發(fā)明是基于下述設(shè)想來(lái)完成的;首先制備能夠直接用于縮聚反應(yīng)的活性齊聚物，其中羧基受到活性酯基的保護(hù)，而肽偶合則以較之活性酯保護(hù)基的氨解快得多的速率進(jìn)行。這一偶合方法比活性酯方法能夠提供程度更高的活化。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，“反饋”活化方法很適用于異肽及二氨基羧酸鹽的制備，進(jìn)行COOH基的暫時(shí)保護(hù)并同時(shí)進(jìn)行活化最好選用對(duì)硝基苯酯，而進(jìn)行肽偶合最好采用混合酐法，反應(yīng)過(guò)程中未發(fā)生氨基的BOC保護(hù)及Z基保護(hù)。這樣可合成得到任何二氨基羧酸的同或系列異肽。此外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，采用可重復(fù)的方法在寬分子量范圍內(nèi)制取低多分散性同多肽。中間產(chǎn)物及目的產(chǎn)物均為高純度結(jié)晶并易于分離。
另外，本發(fā)明還基于下列設(shè)想在有二氨基羧酸存在條件下，對(duì)硝基苯酯是最為適用的羧基臨時(shí)保護(hù)及同時(shí)活化的基團(tuán)，而對(duì)于肽偶合來(lái)說(shuō)，采用混合酐法最為理想，可選用Z和BOC基為其它提供保護(hù)。
最后，本發(fā)明還基于下列設(shè)想任何二氨基一元羧酸的同或系統(tǒng)異肽均可通過(guò)上述方法合成，合成過(guò)程中未發(fā)生外消旋化反應(yīng)，即它們的構(gòu)型不變。
綜上所述，本發(fā)明涉及通式(Ⅰ)所示的同多肽、其鹽、旋光異構(gòu)體和外消旋體，式(Ⅰ)中取代基定義如上所述。
按照本發(fā)明方法，通過(guò)通式(Ⅱ)所示的單體或齊聚物與通式(Ⅲ)所示的單體偶合制備通式(Ⅳ)所示的化合物，然后脫除R2保護(hù)基，若S≤9，化合物(Ⅳ)再與化合物(Ⅲ)反應(yīng)或以已知方法進(jìn)行縮聚，便可制得化合物(Ⅰ)
式中q＝1-9，R1為氨基保護(hù)基(于齊聚物中，所有R1均相同)，R3為適用于羧基保護(hù)及同時(shí)活化的活性酯基，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，m和n如上所述。
R2為不同于R1的氨基保護(hù)基，它可由R1基團(tuán)旁邊被有選擇地脫除，x為羧基活化基，條件是-COX基比COOR3基更為活潑，R1，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，m和n如上
式中取代基如上所定義，S為整數(shù)2-10，然后脫除產(chǎn)物中的R1保護(hù)基。若得到的化合物(Ⅰ)以游離堿的形式存在，可將其轉(zhuǎn)變?yōu)樗幱名}，若為鹽，可被轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x堿或另一種鹽。
可選用異構(gòu)體為原料制取相應(yīng)的旋光異構(gòu)體。若要制備外消旋聚合物，則需選用單體的外消旋體為原料。
用于本發(fā)明方法的R1和R2為肽化學(xué)中眾所周知的、可被選擇性脫除的保護(hù)基，R1以芐氧羰基(Z)為佳，R2以叔丁氧羰基(BOC)為佳。基團(tuán)-OR3為適用于羧基保護(hù)和活化的活性酯基，例如-ONp，-OSn，-OPcp，-OPfp，-OBt;X代表BiuOCO-，EtOCO-，N3，-OSn，-OPcp，-OPfp，至于X究竟代表哪一種基團(tuán)，則取決于反應(yīng)條件和R3的定義，例如，它可以是BiuOCO-，EtOCO-。
在用作本發(fā)明方法的原料的式(Ⅱ)所示單體中，R1為Z，R2為BOC，R3為-ONp。BOC基團(tuán)經(jīng)酸解被脫除，然后經(jīng)混合酐法偶合被保護(hù)二氨基羧酸，脫除BOC保護(hù)基后，縮聚如此獲得的二肽，或者是用下一個(gè)得到保護(hù)的氨基酸如法進(jìn)行再次偶合，重復(fù)該步驟直至產(chǎn)生十肽菌素為止。
最好的方法是重復(fù)進(jìn)行偶合，直至產(chǎn)生三肽為止并將所獲得的適用于直接進(jìn)行縮聚的低聚物用預(yù)定量的氨基酸殘余物轉(zhuǎn)化為同多肽。Z-保護(hù)基的脫除(即消除保護(hù))最好是在乙酸之中用HBr進(jìn)行。分離目的產(chǎn)物。
進(jìn)行混合酐法的最佳條件如下a)溶劑乙腈、THF、DMF、二氯甲烷;
b)成酐試劑氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁酯、EEDQ、IIDQ，
叔堿三乙胺、二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉，c)活化時(shí)間及溫度10-30分鐘，-10-20℃，d)用反應(yīng)混合物中的三乙胺或二異丙基乙胺中和氨基組分鹽。
純目的產(chǎn)物的產(chǎn)率60%-80%。
采用本發(fā)明方法可制備同和系列同多肽。
可以采用現(xiàn)有的分離技術(shù)如HPLC、OPTLC、IEF和結(jié)構(gòu)測(cè)定方法如IR、MS、NMR分析制得的異肽。研究結(jié)果及對(duì)照物證實(shí)了其結(jié)構(gòu)。
為了檢測(cè)生物活性，使用了按實(shí)施例所述方法被提純的物質(zhì)。提純可通過(guò)沉析法、柱色譜及凝膠色譜法完成。
在生物研究的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)在由本發(fā)明方法制備的聚-L-異賴(lài)氨酸〔聚合度(P.d.)10-400〕中，聚合度為40-200、分子量為5500-20300的聚合物在體內(nèi)和體外均具有細(xì)胞增生延遲作用，即抗腫瘤活性和抑制瘤轉(zhuǎn)移。分子量為10200-15400、聚合度為80-120的產(chǎn)物的活性最高。目前制備的其它物質(zhì)均無(wú)效力，這主要是由于在Kushawa或Mathur的方法實(shí)施期間有外消旋反應(yīng)發(fā)生以及目的產(chǎn)物的高多分散性所致。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，Kushawa或Hull方法制備的、聚合度為80-120的聚-L-賴(lài)氨酸不具備抗病毒活性。
與已知方法相比，本發(fā)明合成方法的優(yōu)點(diǎn)在于-具備預(yù)期生物效果的產(chǎn)物可長(zhǎng)期重復(fù)制取，-能夠制備直接轉(zhuǎn)用于縮聚反應(yīng)的齊聚物，從而消除了對(duì)生物效果有害的上述水解步驟及外消旋化反應(yīng)，-所制得的產(chǎn)物的分子量分布適宜(即具有低多分散性)，并且其分子量分布范圍寬，這樣有利于產(chǎn)生需要的生物效果(例如，聚合物SZTP-14的分子量為12700±200，多分散性3.7)。產(chǎn)率及中間體和目的產(chǎn)物的純度均較高。這兩種物質(zhì)均易于結(jié)晶和被分離。重復(fù)這些步驟并不困難。
-肽偶合步驟的反應(yīng)時(shí)間較短。
-借助催化加氫進(jìn)行的去保護(hù)反應(yīng)可通過(guò)氨基保護(hù)基的合并而被免除，這意味著為工業(yè)化生產(chǎn)又提供了一個(gè)有利條件。
-本發(fā)明方法的最重要優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)步驟中不包括外消旋化反應(yīng)。
如上所述，迄今獲得的產(chǎn)物在我們的生物實(shí)驗(yàn)中不能發(fā)揮效用。另外，本發(fā)明方法合成的聚合物呈現(xiàn)出預(yù)期的生物活性。
在本發(fā)明制備的化合物(Ⅰ)中，符合下列定義的是新型化合物R4、R5、R6、R7和R10各自代表氫、甲基、乙基、丙基或丁基，R8和R9代表氫，r為整數(shù)10-400，m為0、1、2或3，n為0在一組適宜的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氫、甲基、乙基、丙基、或丁基，R8和R9代表氫，r為整數(shù)40-200，m為3
n為0;
在另一組適宜的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氫，R8和R9代表氫，r為整數(shù)80-120，m為3，n為0;
在另一組優(yōu)選的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氫、甲基、乙基、丙基或丁基，R8和R9代表氫r為整數(shù)10-120，m為2，n為0;
在另一組適宜的化合物中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氫、甲基、乙基、丙基或丁基，R8和R9代表氫，r為整數(shù)10-400，m為1，n為0;
在更為適宜的化合物中R4、R5和R10各自代表氫、甲基、乙基、丙基或丁基，R6、R7、R8和R9各自代表氫，
r為整數(shù)10-400，m和n為0。
我們發(fā)現(xiàn)，通式(Ⅰ)所示同多肽及其鹽的L立體異構(gòu)體能夠非常有效地防治腫瘤和病毒感染。
于體內(nèi)和體外研究了本發(fā)明方法制備的同多肽的生物活性。下文將闡述它們所具備的活性?？鼓[瘤效果是根據(jù)動(dòng)物腫瘤菌株試驗(yàn)測(cè)定的。對(duì)植物病毒作試驗(yàn)確定了其抗病毒活性。
在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，分子量為5500-25600的同-L-賴(lài)氨酸的活性驚人，其中又以分子量為10，200-15400的同-L-賴(lài)氨酸為最佳。
在這兩種測(cè)定過(guò)程中，以物質(zhì)SZTP-14最為有效。其特征在于Z-保護(hù)聚合物的粘度 (ηsp)/(C) ＝31.92cm3/g，ZCO216.8%(計(jì)算值)，16.3%(實(shí)測(cè)值)。
這種游離聚合物以HBr鹽的形式被提供。
Br含量37.7%(計(jì)算值)，36.8%(實(shí)測(cè)值)。
A254＝0(即無(wú)紫外線吸收)。
通過(guò)借助乙醚由醇中沉淀出來(lái)使其被提純。
〔α)20D＝32.4°(C＝2，水)分子量為12700±200。
抗腫瘤活性的測(cè)定測(cè)定對(duì)細(xì)胞增生能夠產(chǎn)生影響的化合物的效果一般是采用細(xì)胞培養(yǎng)物于玻璃試管內(nèi)進(jìn)行，也可以采用可移植的動(dòng)植腫瘤于體內(nèi)進(jìn)行。此，試驗(yàn)是采用我們的化合物作用于人類(lèi)紅白血病細(xì)胞線(K-562，KarolinsKa Institut，StocKholm)和四個(gè)可移植的小鼠腫瘤(L1210淋巴性白血病，由腫瘤衍生的P380巨噬細(xì)胞，歐利希氏癌，路易斯氏肺瘤)?？梢罁?jù)動(dòng)物患L1210和P380腫瘤及歐利希氏癌殘存的多少來(lái)說(shuō)明效果好壞?？稍诮?jīng)過(guò)處理和未被處理的小鼠肺部和肝部觀察到LLT轉(zhuǎn)移的數(shù)目及大小?？赏ㄟ^(guò)注射由50mg本發(fā)明化合物與10ml生理鹽水所組成的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
被測(cè)定的化合物包括SZTP本發(fā)明方法制備的聚異-L-賴(lài)氨酸SZTP-14聚異-L-賴(lài)氨酸的HBr鹽，以游離堿為基準(zhǔn)計(jì)的分子量12700±200，多分散性3.7(數(shù)均/重均)SZTP-15聚異-L-賴(lài)氨酸HBr鹽，以游離堿為基準(zhǔn)計(jì)的分子量11600±200SZTP-16聚異-L-賴(lài)氨酸HBr鹽，以游離堿為基準(zhǔn)計(jì)的分子量13400±200SZTP-17聚異-L-賴(lài)氨酸HBr鹽，以游離堿為基準(zhǔn)計(jì)的分子量14500±200SZTO本發(fā)明方法制備的聚異-L-鳥(niǎo)氨酸SZTO-18聚異-L-鳥(niǎo)氨酸HBr鹽，以游離堿為基準(zhǔn)計(jì)的分子量為8900±200H-17Hull等人方法制備的聚異賴(lài)氨酸K-17按照Kushawa等人的方法制備的聚異賴(lài)氨酸A-3α-聚賴(lài)氨酸。
對(duì)腫瘤細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)的評(píng)述與對(duì)照物相比，本發(fā)明制備的化合物于玻璃試管內(nèi)的劑量隨著腫瘤細(xì)胞數(shù)目的減少而降低，若劑量少，其效果是細(xì)胞數(shù)目保持不變，若劑量加大，則細(xì)胞被殺死。H-17和K-17無(wú)效力，而α-聚賴(lài)氨酸(A-3)只能使細(xì)胞數(shù)目不增加。
按照我們所進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，用SZTP處理動(dòng)物可使殘存的數(shù)目增加。而用SZTP處理歐利希氏瘤，則在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)無(wú)腫瘤細(xì)胞存在，僅僅于處理停止后方能觀察到腫瘤細(xì)胞增生。
當(dāng)腫瘤細(xì)胞被接種于脾內(nèi)時(shí)，用SZTP進(jìn)行處理可完全避免腫瘤細(xì)胞向肝部轉(zhuǎn)移，而當(dāng)腫瘤細(xì)胞被接種于肌肉時(shí)，向肺部轉(zhuǎn)移的數(shù)目及大小均有所減小。
因此，事實(shí)證明，本發(fā)明制備的聚異賴(lài)氨酸和聚異鳥(niǎo)氨酸可用作腫瘤細(xì)胞增生抑制劑。其中聚異賴(lài)氨酸的抑制效果強(qiáng)得令人吃驚。可以依據(jù)動(dòng)物的殘存數(shù)目，將這一效果與已知最好的細(xì)胞抑制劑的效果相比較，很顯然，本發(fā)明化合物的抗轉(zhuǎn)移效果出人意料的好。本發(fā)明化合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于迄今所用的細(xì)胞抑制劑的毒性。
舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的生物檢測(cè)結(jié)果表明治療指數(shù)(最大允許劑量/最小有效劑量)高于10，而對(duì)于最好的已知細(xì)胞抑制劑來(lái)說(shuō)，這一數(shù)值一般低于10。
對(duì)于雄性和雌性來(lái)說(shuō)，其各自的生物反應(yīng)沒(méi)有差異，這是本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
下文中我們將用數(shù)據(jù)描述抗腫瘤效果。
體外實(shí)驗(yàn)表1a-1c所示數(shù)據(jù)為由各種方法制備的聚異賴(lài)氨酸，本發(fā)明方法制備的聚異鳥(niǎo)氨酸及α-聚賴(lài)氨酸對(duì)K-562細(xì)胞增生所產(chǎn)生的效果。
實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下細(xì)胞K-562人體紅白血病細(xì)胞線(KarolinsKaInstitule，StocKholm)，細(xì)胞數(shù)目在含有5-6ml培養(yǎng)基的玻璃試管中，為5×104/ml，探子數(shù)目每一劑3個(gè)試管，培養(yǎng)基添加有10%胎牛血清(流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室，Irvine，蘇格蘭)的ParKersM-199，溫度氣體環(huán)境37℃，5%CO2和95%空氣。
處理用細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋后歷時(shí)24小時(shí)。
劑量1-10-100μg/l，估評(píng)于培養(yǎng)物稀釋后，于24、48、72和96小時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用BueKer容器，實(shí)驗(yàn)次數(shù)每種化合物進(jìn)行2次。
表1a說(shuō)明采用SZTP-14、SZTP-15、SZTP-16、SZTP-17和SZTP-18，其中尤其是SZTP-14進(jìn)行處理對(duì)細(xì)胞增生可產(chǎn)生明顯的、其效果依賴(lài)于劑量的抑制作用。值得注意的是既使?jié)舛葹?μg/ml，也能夠產(chǎn)生良好的抗增生效果。
表1b表明，與此相反，H-17和K-17對(duì)K-562細(xì)胞增生不能構(gòu)成影響。
表1c說(shuō)明，與對(duì)照物相比，α-聚賴(lài)氨酸能夠使細(xì)胞數(shù)目保持不變，但是，既使加大劑量(100μg/ml)也不能使細(xì)胞數(shù)目增加。
表中給出的數(shù)據(jù)代表給定時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)目。每一劑于某一時(shí)刻分3個(gè)試管計(jì)數(shù)細(xì)胞，并且有3個(gè)試管作為對(duì)照物之用。
表1a對(duì)本發(fā)明制備的化合物(SZTP-14～18)對(duì)玻璃試管內(nèi)K-562細(xì)胞線所產(chǎn)生的效果。
處理1-10-100μg/ml，于用培養(yǎng)物稀釋后歷時(shí)24小時(shí)。
表1a細(xì)胞數(shù)×103/ml營(yíng)養(yǎng)液SZTP-14 48h72h96h100/ug/ml00010/ug/ml90901501108012070801401/ug/ml80170180100180190100120150對(duì)照物130220260120230230110220230SZTP-15100/ug/ml40101050201020102010/ug/ml801001606012011050100140
表1a(續(xù))48h72h96h1/ug/ml120150200100140190120120210對(duì)照物140210270120190250150190280SZTP-16100/ug/ml10016016012012014010014014010/ug/ml1201602201201602401401802401/ug/ml140180260120210280140240250對(duì)照物140220280130200260140200270SZTP-17100/ug/ml110180200120190210110200200
表1a(續(xù))48h72h96h10/ug/ml1202002601202002601201902801/ug/ml150260280130210280130210260對(duì)照物140250280150220280130220260SZTP-18100/ug/ml1001601801001301809013016010/ug/ml1201802201201602301201902301/ug/ml140200280140210260130220280對(duì)照物140220280150230280140230270
表1bH-17和K-17對(duì)玻璃試管內(nèi)K-562細(xì)胞增生所產(chǎn)生的效果。
處理1-10-100ug/ml，干用培養(yǎng)物稀釋后歷時(shí)24小時(shí)。
表1b細(xì)胞數(shù)×103/ml營(yíng)養(yǎng)液48h72h96hH-17100/ug/ml12523028011031027012021028010/ug/ml1202202901302402801252102201/ug/ml130240290120240290120220270K-17100/ug/ml120220280110210290120220270
表1b(續(xù))48h72h96h10/ug/ml1252402901352402901202102701/ug/ml140240290120220280120230280對(duì)照物120210290130200280120220285表1cA-3對(duì)玻璃試管內(nèi)K-562細(xì)胞增生的作用效果。
處理1-10-100ug/ml，于用培養(yǎng)物稀釋后歷時(shí)24小時(shí)。
表1c細(xì)胞數(shù)×103/ml營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)48h72h96h100/ug/ml11011010012011010012012011010/ug/ml1301201201201101101201201101/ug/ml110110100120110110120120110對(duì)照物120250300120240290125240290體內(nèi)檢測(cè)a)L1210腫瘤，采用SZTP-14進(jìn)行檢測(cè)腫瘤來(lái)源Chester Bcaty Institute，London，動(dòng)物種類(lèi)DBA/2imbred，ownbneed，動(dòng)物體重及性別20-23g，雌性，每組5只，
腫瘤細(xì)胞數(shù)目每只動(dòng)物的腹膜內(nèi)有105個(gè)，處理于腹膜內(nèi)，劑量為50mg/Kg，于腫瘤接種后歷時(shí)24小時(shí)，一日一次，共進(jìn)行8天。
對(duì)照物組向腹膜內(nèi)施用0.2ml生理鹽水，估評(píng)依據(jù)殘存的動(dòng)物。
結(jié)果如表2所示，經(jīng)過(guò)處理后，殘存的動(dòng)物數(shù)目超過(guò)對(duì)照物。腫瘤接種十天后，對(duì)照組未留下一只成活的小鼠，而此時(shí)，所有經(jīng)過(guò)處理的動(dòng)物都活下來(lái)了。腫瘤接種后，首先得到處理的動(dòng)物活了13天，最后得到處理的活了15天。
表2每天以50mg/Kg劑量處理用L1210腫瘤接種的DBA/2小鼠所產(chǎn)生的效果。
接種后的天數(shù)成活對(duì)照物處理后成活的小鼠93510-511-512-513-414-315--
b)P-388腹水腫瘤，用SZTP-14處理，動(dòng)物品種BDF/1雜種，ownbreed動(dòng)物體重及性別20-23g，雄，每組5只，細(xì)胞數(shù)目2.8×106細(xì)胞/每只動(dòng)物腹膜內(nèi)，處理腹膜內(nèi)用量每天為10mg/Kg，腫瘤接種后24小時(shí)開(kāi)始，對(duì)照組每天于腹膜內(nèi)施用0.2ml生理鹽水，估評(píng)依據(jù)動(dòng)物的殘存數(shù)目，結(jié)果表3表示的是殘存動(dòng)物數(shù)目，所有得到處理的小鼠均比對(duì)照組活得長(zhǎng)。
表3每天以10mg/Kg的劑量用SZTP-14處理用P-388腹水腫瘤接種的BDF/1小鼠所產(chǎn)生的效果。
接種后的天數(shù)成活對(duì)照物處理后的成活小鼠94510-511-512-513-514-515-416-217-118--
c)歐利希氏腹水腫瘤，用SZTP-14處理動(dòng)物品種Swiss，nonimbred，ownbreed，動(dòng)物體重及性別20g，每組有5只雄性和5只雌性動(dòng)物，腫瘤細(xì)胞數(shù)目106/每只動(dòng)物，處理每天向腹膜內(nèi)施用的劑量為50mg/Kg和75mg/Kg自腫瘤接種后24小時(shí)開(kāi)始，處理20天，對(duì)照組向腹膜施用0.2ml生理鹽水溶液。
估評(píng)每天測(cè)量活下來(lái)的動(dòng)物的體重，于腫瘤接種55天后，殺死活下來(lái)的動(dòng)物，解剖后，測(cè)量腹水量，記錄腹腔內(nèi)偶然形成的固體腫瘤數(shù)目。
結(jié)果表4表示的是腫瘤接種第16天后小鼠的體重?cái)?shù)據(jù)，對(duì)照組動(dòng)物死于第17天至第22天之間。超出的重量表明有腫瘤腹水形成。所有得到處理的動(dòng)物(每組除了一只外)均活到腫瘤接種后的第55天。然后殺死這些動(dòng)物。表5表示的是腹腔內(nèi)固體腫瘤及腹水?dāng)?shù)量。這說(shuō)明沒(méi)有未患腫瘤的動(dòng)物，不過(guò)于最后一只對(duì)照組小鼠死后的第33天，在20只經(jīng)過(guò)處理的小鼠中仍有16只成活的小鼠。
表4用劑量為50mg/Kg和75mg/Kg的SZTP-14以腹膜內(nèi)處理的方式作用于歐利希氏腹水腫瘤接種的雄性或雌性Swiss小鼠。腫瘤接種前的體重20g，0死于腫瘤;十死于其它原因。
表4腫瘤接種對(duì)照物♀ 對(duì)照物
75mg/kg♀后的天數(shù)1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3.4.5.1.2. 3.4.5.
16. 43 37 41 46 404034403541 17 2224212217. 443942464140 35 035 42 17 2324252218. 454243474942 35 035 43182324212419.043435000360044192324212420.0460420042004616212320 2121.0460430047004718232525 2222.00000000051192526252424.0000000000192426242525.202426242626.2024272425.527.212528252628.212528252629.212528252633.222528252634.222528252642.232627252850.242727252855.262902732
表4(續(xù))
<p>表5采用劑量為50mg/Kg和75mg/Kg的SZTP-14進(jìn)行處理，于腫瘤接種后的第55天殺死Swiss小鼠。腹腔內(nèi)腹水及固體腫瘤數(shù)量。
處理75mg/Kg75mg/Kg50mg/Kg50mg/Kg♀
♀
腹水--0-416-0--5240-1-40腹腔內(nèi)的固體腫瘤++0+++++0+++++0++++00動(dòng)物早夭+腹腔內(nèi)的固體腫瘤用SZTP-14抑制腫瘤轉(zhuǎn)移a)將路易斯氏肺腫瘤(LLT)接種于脾內(nèi)動(dòng)物品種Inbred C57B1，LATI，Godollo，牙利，動(dòng)物體重及性別20-23g，雌(6只對(duì)照物，4只得到處理)腫瘤細(xì)胞數(shù)目5×106個(gè)接種于脾內(nèi)的LLT細(xì)胞，
處理于腫瘤接種后24小時(shí)開(kāi)始以75mg/Kg的劑量處理8天，估評(píng)于腫瘤接種后第9天殺死動(dòng)物并記錄肝轉(zhuǎn)移數(shù)目，結(jié)果表6表示的是轉(zhuǎn)移數(shù)目，采用SZTP-14進(jìn)行處理后，未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移發(fā)生。
表6采用SZTP-14處理(劑量為75mg/Kg，腹膜內(nèi)施用8天)用LLT于脾內(nèi)接種的雌性C57小鼠對(duì)肝轉(zhuǎn)移數(shù)目產(chǎn)生的影響。
肝轉(zhuǎn)移數(shù)目對(duì)照物312063363856(X＝40.66;S＝16.02;n＝6)SZTP-140000(n＝4)b)將路易斯氏肺腫瘤(LLT)接種于腿肌肉之中動(dòng)物品種C57B1 inbred LATI，GOdollo，匈牙利動(dòng)物體重和性別20-22g，雌動(dòng)物數(shù)目每組5只腫瘤細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/每只的劑量以肌內(nèi)注射的方式施用于右大腿肌肉之中。于腫瘤接種十天后，摘除右下肢。于腫瘤接種后11天至17天之間進(jìn)行下述處理向腹膜內(nèi)施用50mg/Kg SZTP-14。每天向?qū)φ战M動(dòng)物的腹膜內(nèi)施用0.2ml生理鹽水溶液。
估評(píng)于腫瘤接種后第十八天殺死動(dòng)物，于立體顯微鏡下確定肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目及平均體積。
結(jié)果表7所示為肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及平均體積。SZTP-14處理能夠明顯地降低肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及平均體積。
表7采用SZTP-14對(duì)經(jīng)過(guò)路易斯氏肺腫瘤接種的C57B1小鼠進(jìn)行處理(每日劑量為50mg/Kg，腹膜內(nèi)用藥，于腫瘤接種后第11天和第17天之間)，對(duì)肺轉(zhuǎn)移數(shù)目及平均體積所產(chǎn)生的效果。
治療平均轉(zhuǎn)移數(shù)目平均轉(zhuǎn)移體積對(duì)照物63.13±27.5349.45±29.07SZTP-1426.29±18.8720.10±35.38抗病毒活性抑制煙草花葉病毒的產(chǎn)生完好的煙草(Nicotianatabacumcv.Samsun)易于受煙草花葉病毒(TMV)感染，可使用機(jī)械方式進(jìn)行接種。金剛沙粉粒經(jīng)為500目)可用作磨擦劑。接種物中含200ugTM得到提純的煙草花葉病毒(TMVU1品種)，于0.1MSorensen磷酸鹽緩沖液中，pH＝7.2)。接種3小時(shí)后，將SZTP-14溶液噴施于完好的煙葉上。連續(xù)進(jìn)行
3天，于接種后二星期檢查癥狀。于接種后第14天從所有接過(guò)種的植物的葉子中選取葉子樣品，也就是說(shuō)選取不同高度、各種齡期的各類(lèi)葉子。
由一克冷凍的樣品中測(cè)定病毒濃度。葉子樣品于4ml磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2)中被均化，然后被置于Eppendorf離心機(jī)中被離心分離(轉(zhuǎn)速約為10000轉(zhuǎn)/分，進(jìn)行5分鐘)。采用15ul上清液進(jìn)行定量測(cè)定。采用特殊的抗TMV(U1)血清(1μl免疫球蛋白/1cm)通過(guò)火箭免疫電泳估算病毒含量。可使用巴比妥酸鈉緩沖劑(0.2M，pH＝8.6)作為電泳緩沖劑。采用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，由沉淀峰值的高度計(jì)算病毒含量。
表8抗病毒效果的估評(píng)實(shí)例處理SZTP-14病毒含量200mg/l11mg/ml20mg/l24.6mg/ml2mg/l29.3mg/ml對(duì)照物51.3mg/ml以游離堿和無(wú)毒鹽形式存在的本發(fā)明同多肽可作為有效組分用于藥物制劑之中。為此，它們可與常用于制藥業(yè)的載體及助劑混合從而轉(zhuǎn)變?yōu)樗幱卯a(chǎn)物。此外，通過(guò)將它們與用于植物保護(hù)的助劑混合可使本發(fā)明化合物以游離堿和鹽的形式被使用，使植物的抗病毒感染能力增強(qiáng)。
可用作藥物的鹽有如酸加成鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、富馬草鹽、葡糖酸鹽、酒石酸鹽、馬來(lái)酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、乳酸鹽、藻酸鹽等。
其中活性劑為本發(fā)明化合物的藥物可以是注射用溶液、片劑、糖衣藥丸、栓劑、懸浮液、口服液、粉劑等。
本發(fā)明化合物的藥用有效量取決于施藥方式及患者狀況。一般地，用藥劑量為0.02-20mg/體重Kg/天，每天2-4次。口服用藥的劑量可以大些。
適宜的藥劑形式為注射溶液，可以采用靜脈、皮下或肌內(nèi)注射的方式給藥。為了制備注射液，可以使用等滲壓NaCl溶液，必要的話，還可同時(shí)使用磷酸鹽緩沖液，抗壞血酸穩(wěn)定劑等。
可以固體和液體醫(yī)用制劑的形式施用活性物質(zhì)。若以液體形式施用，可使用增甜劑和/或增香劑。
適宜的固體口服單位有如片、糖衣藥丸和膠囊。在制藥時(shí)，是將活性劑與常用藥物載體混合，并將該混合物壓制成片劑，轉(zhuǎn)變成糖衣藥丸和填充至膠囊之中。常用的填充和添加劑可用作載體，例如乳糖、硬脂酸鎂、滑石、硬脂酸、蔗糖、明膠、瓊脂、果膠、黃蓍膠、硅膠、玉米淀粉、藻酸等。為了制造栓劑，適宜選用可可脂。
最好是通過(guò)將本發(fā)明化合物與常用的助劑如潤(rùn)濕材料和固體載體(以高嶺土為佳)轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w或液體制劑(以與其它活性物質(zhì)組合使用為佳)對(duì)植物進(jìn)行處理。由如此制得的制劑可得到本發(fā)明化合物濃度為1-50ppm的溶液或懸浮液，并以已知方式被施用于植物，
用量以0.5-5g/公頃為佳。
下列實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但并不構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1聚-L-賴(lài)氨酸HBr鹽a)Nα-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯HCl將10g Nα-芐氧羰基-(Nε-叔丁氧羰基)-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯溶于40ml三氟乙酸并加入等量的2NHCl/EtOAc。于室溫下放置1小時(shí)之后，使溶液于真空下蒸發(fā)掉一半體積，然后加入醚使溶液產(chǎn)生結(jié)晶。
產(chǎn)率8.3g(96.06%);熔點(diǎn)83-86℃;TLCRf＝0.68(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)。
b)Nα-芐氧羰基-N-(N′α-芐氧羰基-N′ε-叔丁氧羰基-L-賴(lài)氨酰)-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯將7.69g(20mmol)Nα-芐氧羰基-(Nε-叔丁氧羰基)-L-賴(lài)氨酸溶于無(wú)水乙腈之中。然后先后滴加2.8ml(20mmol)三乙胺和2.8ml氯甲酸異丁酯，同時(shí)進(jìn)行劇烈攪拌。活化(20分鐘)后加入9g步驟a)的鹽，然后滴加由2.8ml三乙胺與5ml乙腈所組成的冷溶液。于-10℃下繼續(xù)攪拌2小時(shí)，用300ml 0.5M HCl稀釋該混合物。收集固體產(chǎn)物，干燥并用乙酸乙酯與石油醚的1∶1混合物進(jìn)行重結(jié)晶處理。產(chǎn)率12.9g(89.02%)，熔點(diǎn)128-131℃，分析結(jié)果-ONP含量99.8%。TLCRf＝0.64(EtOAc∶環(huán)己烷＝3∶1)，Rf＝0.91(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)，HPLCtr＝8.8分鐘(K′＝2.2);
柱子ODS-Hypersil-6(125×4mm);洗提劑MeOH-CH3CN0.02M NaOAc緩沖液(pH＝4)＝40∶30∶30(V/V);流速1ml/分鐘;檢測(cè)UV254nm。
c)Nα-芐氧羰基-Nε-(N′α-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸)-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯·氫氯酸鹽按照步驟a)，由10.5g Nα-芐氧羰基-N-(Nα-芐氧羰基-N′ε-叔丁氧羰基-L-賴(lài)氨酰)-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯制備10.25g鹽，熔點(diǎn)109-113℃，TLCRf＝0.70(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)。
d)Nε-叔丁氧羰基-三(Nα-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸)-對(duì)硝基苯酯將5.71g(15mmol)Nα-芐氧羰基-(Nε-叔丁氧羰基)-L-賴(lài)氨酸按照步驟b)用三乙胺、氯甲酸異丁酯/乙腈轉(zhuǎn)化為混合酐。在三乙胺存在下，加入10.5g Nα-芐氧羰基-Nε(N′α-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酰)-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯氫氯酸鹽。這樣可獲得13.9g產(chǎn)物(85.4%)。用乙腈及乙醚進(jìn)行重結(jié)晶處理，熔點(diǎn)為145-150℃。分析結(jié)果ONP含量99.6%;TLCRf＝0.98(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1);HPLCtr＝18.2分鐘(K′＝8.1);柱子ODS-Hypersil-6(125×4mm);洗提劑MeOH-CH2CN-0.02M NaOAc緩沖液(pH＝4)＝40∶30∶30;流速1ml/分鐘;檢測(cè)UV254nm。
e)三-(Nα-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸)-對(duì)硝基苯酯鹽酸鹽按照步驟a)處理12.2g步驟d)制備的酯。這樣可獲得12.1g(95.4%)鹽;熔點(diǎn)108-125℃，TLCRf＝0.71(正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1)。
f)聚-ε-Nα-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸在4.5ml三乙胺存在下，于60ml二甲基亞砜中，23g(24mmol)三-(Nα-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸)-對(duì)硝基苯酯。鹽酸鹽經(jīng)縮合形成凝膠。通過(guò)將其傾入5%Na2CO3水溶液分離出聚合物。
產(chǎn)率16.8g(89.6%)。分析結(jié)果ZCO216.8%(計(jì)算值)，16.3%(實(shí)測(cè)值)〔ηsp〕/C＝31.96cm3/g(C＝4.95g/l，二氯乙酸)。
g)聚-ε-L-賴(lài)氨酸氫溴酸鹽將16g得到保護(hù)的步驟f)得到的聚合物溶于100ml三氟乙酸并加入100ml4NHBr/AcOH。加入乙醚使目的產(chǎn)物沉析。
產(chǎn)率14.7g(91.6%)。分析結(jié)果Br37.7%(計(jì)算值)，36.8%(實(shí)測(cè)值);A254nm＝0。紙色譜法Wl 23×62，洗提劑∶正丁醇∶乙酸∶吡啶∶水＝30∶6∶24∶20?？偖a(chǎn)率36.82%(以得到保護(hù)的胺為起始物);18.85%(以游離賴(lài)氨酸為起始物)MW＝5500-20300D。
h)目的產(chǎn)物粗品的提純將250g步驟g)獲得的聚合物溶于水中，然后用SephadexG-50(細(xì))柱進(jìn)行色譜法提純。洗提劑蒸餾水，0.9%NaCl溶液或0.1NHCl溶液。于UV220nm下檢測(cè)餾分(1ml)。
i)目的產(chǎn)物粗品的提純將2g步驟g)中制備的聚-ε-L-賴(lài)氨酸氫溴酸鹽溶于2ml水中，然后加入20ml乙醇。通過(guò)添加80ml乙醚使聚合物沉析。于5℃下靜置24小時(shí)后，經(jīng)過(guò)濾、洗滌和干燥。產(chǎn)率1.26g(83%)(以得到保護(hù)的三肽為起始物計(jì)為57.7%)如此得到的就是SZTP-14，MW-12700D〔α〕20D＝32.4°(C＝2，H2O)，多分散性＝3.7。
可采用相似方法制備下列物質(zhì)SZTP-15 MW＝116000±200 〔α〕20D＝31.9°SZTP-16 MW＝13400±200 〔α〕20D＝32.6°SZSP-17 MW＝14500±200 〔α〕20D＝32.1°實(shí)施例2聚-ε-L-賴(lài)氨酸·鹽酸鹽將1g實(shí)施例1制得的聚合物溶于40ml2MNaCl溶液中，所得到的溶液透析出2MNaCl溶液，隨后透析出水。采用凍干法可得到0.85g聚合物。
實(shí)施例3
聚-ε-L-賴(lài)氨酸(游離堿)用Dowex 1-OH陰離子交換樹(shù)脂制備離子交換柱(40ml)。以1cm3/分鐘的流速采用色譜法提純由1g實(shí)施例1制備的聚合物與20ml水所組成的溶液。分析餾分，收集后冷凍干燥。分離得到0.65g聚合物。
實(shí)施例4聚-ε-D-賴(lài)氨酸氫溴酸鹽以10g Nα-芐氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-D-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯為起始物完成實(shí)施例1所述步驟。這樣可制得1.3g聚合物。MW＝8900〔α〕20D＝-48.08°(C＝0.92，水)。
實(shí)施例5聚-δ-L-鳥(niǎo)氨酸按照實(shí)施例1所述方法，以10g Nα-芐氧羰基-(Nδ-叔丁氧羰基)-L-鳥(niǎo)氨酸-對(duì)硝基苯酯為起始物，可獲得7.9g Nα-芐氧羰基-L-鳥(niǎo)氨酸-對(duì)硝基苯酯-鹽酸鹽，其熔點(diǎn)為87-90℃。該鹽與Nα-芐氧羰基-(Nδ-叔丁氧羰基)-L-鳥(niǎo)氨酸按照步驟b)的方式偶合，形成Nα-Z-Nδ(N′α-Z-N′δ-叔丁氧羰基-L-鳥(niǎo)氨酰)-L-鳥(niǎo)氨酸-對(duì)硝基苯酯二肽(12.1g);熔點(diǎn)為133-136℃。重復(fù)步驟1a)，由二肽(11.99g;熔點(diǎn)115-119℃)制備N(xiāo)α-Z-Nδ-(N′α-Z-L-鳥(niǎo)氨酰)-L-烏氨酸-對(duì)硝基苯酯鹽酸鹽，按照步驟1b)經(jīng)偶合獲取Nδ-BOC-三(Nδ-Z-L-鳥(niǎo)氨酸)-對(duì)硝基苯酯(14.8g，熔點(diǎn)150-153℃)，依照步驟(e)制備三(Nα-Z-L-鳥(niǎo)氨酸)-對(duì)硝基苯酯鹽，熔點(diǎn)115-130℃。按照步驟if)使上述產(chǎn)物縮聚，得到15.4gδ-聚-Nα-芐氧羰基-L-鳥(niǎo)氨酸(87.6%)。采用步驟1g)方法，分離該產(chǎn)物，得到13.1g(93%)聚-δ-1-鳥(niǎo)氨酸-氫溴酸鹽。
實(shí)施例6聚-δ-D-鳥(niǎo)氨酸氫溴酸鹽采用實(shí)施例5所述的方法，以1g Nα-芐氧羰基-Nδ-叔丁氧羰基)-D-鳥(niǎo)氨酸-對(duì)硝基苯酯為起始物，可制得1.2g(89%)聚-δ-D-鳥(niǎo)氨酸氫溴酸鹽。
實(shí)施例7聚-γ-L-(α，γ-二氨基丁酸)按照實(shí)施例1所示方法，由9.8g Nα-芐氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-α、γ-二氨基丁酸對(duì)硝基苯酯制備6.9g Nα-芐氧羰基-L-α，γ-二氨基丁酸對(duì)硝基苯酯氫氯酸鹽，熔點(diǎn)為67-70℃。采用步驟1b)的方法使該鹽與Nα-芐氧羰基-Nγ-叔丁氧羰基-L-α，γ-二氨基丁酸偶合，轉(zhuǎn)化為Nα-Z，Nγ-(N′α-Z-N′γ-叔丁氧羰基-α，γ-二氨基)-丁酸-對(duì)硝基苯酯二肽(10.8g，熔點(diǎn)125-127℃)。重復(fù)步驟1a)，由二肽(熔點(diǎn)為108-112℃)合成10.35g Nα-Z-Nγ-(N′α-Z-L-α，γ-二氨基丁酰基)-L-α，γ-二氨基丁酸-硝基苯酯鹽酸鹽。采用步驟1b)的方法，可由該鹽經(jīng)偶合獲得13.7g Nγ-BOC-三(Nα-Z-L-α，γ-二氨基丁酸)-對(duì)硝基苯酯，其熔點(diǎn)為
143-145℃。采用步驟1e)的方法，可由該產(chǎn)物制備10.5g三(Nα-Z-L-α，γ-二氨基丁酸)-對(duì)硝基苯酯鹽，其熔點(diǎn)為105-110℃。按照步驟1f)的方法，該產(chǎn)物于二甲基亞砜中進(jìn)行縮聚可產(chǎn)生7.8g(86.5%)聚-γ-Nα-芐氧羰基-L-α，γ-二氨基丙酸。采用步驟(g)所述方法處理得到保護(hù)的聚合物，得到6.2g(90.5%)聚-γ-L-α，γ-二氨基丁酸氫溴酸鹽。
實(shí)施例8聚-β-L-(α，β-二氨基丙酸)采用實(shí)施例1所述方法，由9.6g Nα-芐氧羰基-Nβ-叔丁氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸對(duì)硝基苯酯(熔點(diǎn)為65-67℃)制備7.1g Nα-芐氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸對(duì)硝基苯酯鹽酸鹽，采用步驟1b的方法，可使該鹽與Nα-芐氧羰基-Nβ-叔丁氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸偶合產(chǎn)生11.0gNα-Z-Nγ-(N′α-叔丁氧羰基)-α，β-二氨基丙酰基)-α，β-二氨基丙酸對(duì)硝基苯酯二肽，其熔點(diǎn)為119-122℃。重復(fù)步驟1a)，由二肽制備10.85g Nα-Z-Nβ-(N′α-Z-L-α，β-二氨基丁酸)-L-α，β-二氨基丙酸-對(duì)硝基苯酯鹽酸鹽。產(chǎn)率10.85g，熔點(diǎn)102-105℃。按照步驟1b)的方法，由該鹽經(jīng)偶合可得到12.6gNβ-BOC-三-(Nα-Z-L-α，β-二氨基丙酸)-對(duì)硝基苯酯，其熔點(diǎn)為138-140℃。采用步驟1e)的方法，可用此產(chǎn)物制取12.4g三(Nα-Z-L-α，β-二氨基-丙酸)-對(duì)硝基苯酯鹽，其熔點(diǎn)為102-106℃。采用步驟1f)的方法使該化合物于二甲基亞砜中進(jìn)行縮聚，可獲得8.7g(90.2%)聚-β-Nα-芐氧羰基-L-α，β-二氨基丙酸。如步驟1g)所述處理得到保護(hù)的聚合物，得到5.6g(88.7%)聚-β-L-α，β-二氨基丙酸氫溴酸鹽。
實(shí)施例9注射溶液將500mg聚-L-賴(lài)氨酸·HBr溶于10ml生理鹽(NaCl)水。過(guò)濾消毒后，根據(jù)患者的狀況，以1-100mg/Kg/天的劑量使用。
實(shí)施例10片劑的制備片劑由下列組分制備10g聚異-L-賴(lài)氨酸·HCl60乳糖16g蔗糖20g玉米淀粉2g硬酯酸鎂2g藻酸將這些材料均勻混合后壓制成100片。
實(shí)施例11增強(qiáng)植物抗病毒感染能力的方法配制由5g聚異-L-賴(lài)氨酸與100ml水所組成的溶液。借助于NaOH溶液將該溶液的pH值調(diào)至7.0-7.2，此后加入1mlTween20。該溶液被施用于面積為1公頃、生長(zhǎng)著有待保護(hù)的芽后植物的土地之中。
權(quán)利要求
1.通式(Ⅰ)所示的化合物及其鹽、外消旋體和旋光異構(gòu)體
式中R4、R5、R6、R7和R10各自代表氫原子或C1-4烷基，R8和R9各自代表氫原子，γ為10-100的整數(shù)，m為0，1，2或3，n為0。
2.通式(Ⅰ)所示的化合物及其鹽、外消旋體和旋光異構(gòu)體，其中R4、R5、R6、R7和R10各自為氫原子，γ為10-400，m為0，1，2或3，n為0。
3.平均分子量為5500-25600的聚異賴(lài)氨酸。
4.平均分子量為4400-13500的聚異烏氨酸。
5.具備抗腫瘤和抗病毒效果的藥物制劑，其中含有用作活性劑的通式(Ⅰ)化合物(式中R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10代表氫，γ為整數(shù)400-200，m為0，1，2或3，n為0和具備L-構(gòu)型的氨基)和與之混合的，常用于制藥業(yè)的載體和/或添加劑。
6.按照權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其中活性試劑為其平均分子量為5500-22500的聚異賴(lài)氨酸。
7.一種通過(guò)單體偶合及如此制得的齊聚物經(jīng)縮聚反應(yīng)制備通式(Ⅰ)所示聚異二氨基羧酸及其鹽、外消旋體和旋光異構(gòu)體的方法。式中R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10可以相同或不同，代表氫原子或C1-4烷基，γ為整數(shù)10-400，m為整數(shù)0-10，n為整數(shù)0-10其特征在于通式(Ⅱ)所示的單體或齊聚物與通式(Ⅲ)所示的單體偶合，脫除所形成的通式(Ⅳ)所示化合物中的R2保護(hù)基，若S≤9，該化合物與單體(Ⅲ)反應(yīng)或以已知方式進(jìn)行縮聚反應(yīng)，必要的話，當(dāng)所獲得的化合物(Ⅰ)以游離堿的形式存在時(shí)，它會(huì)轉(zhuǎn)變化鹽，或者當(dāng)其為鹽時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閴A或另一種鹽
式中q為整數(shù)1-9，R1為氨基保護(hù)基，在齊聚物中所有R1均相同，R3為適用于進(jìn)行保護(hù)和同時(shí)進(jìn)行活化的羧基的活性酯保護(hù)基，R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、m和n如上所定義，對(duì)于齊聚物來(lái)說(shuō)，這些取代基可以相同或不同，
式中R2為不同于R1的氨基保護(hù)基，它可于R1基團(tuán)旁邊有選擇地被脫除，x為羧基活化基團(tuán)，條件是基團(tuán)-COX比COOR3基團(tuán)的活性更強(qiáng)，R1、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、m和n如上所述，
式中取代基與上述相同，S為整數(shù)2-10
8.按照權(quán)利要求7所述制備式Ⅰ所示聚異二氨基羧酸(其中R4、R5、R6、R7、R10和γ如權(quán)利要求1所定義，m＝3n＝0的方法，其中式(Ⅱ)所示的單體或齊聚物(R1、R3、R4、R5、R6、R7、R10和q如權(quán)利要求1所定義，m和n如上所定義)與通式Ⅲ所示的單體(R1、R2、R4、R5、R6R7、R10和x如權(quán)利要求1所定義，m和n如上所定義)反應(yīng)，脫除所形成的通式(Ⅳ)所示化合物(其中取代基與上述相同，s取值如權(quán)利要求1所述)中的R2保護(hù)基，必要的話，當(dāng)s≤9時(shí)，使所獲得的產(chǎn)物與單體(Ⅲ)反應(yīng)或以已知方式進(jìn)行縮聚反應(yīng)。
9.按照權(quán)利要求7所述制備通式(Ⅰ)所示聚異二氨基羧酸(其中R4、R1、R3、R5、R6、R7、R10和q如權(quán)利要求1所定義，m和n如上所定義)及其鹽的方法，其中式(Ⅱ)所示的單體或齊聚物(其中R1、R3、R4、R5、R6、R7、R10和q如權(quán)利要求1所述，m和n如上所定義)與式(Ⅲ)所示單體(其中R1、R2R4、R5、R6、R7、R10和x如權(quán)利要求所定義，m和n如上所述)反應(yīng)，脫除所形成的通式(Ⅳ)所示化合物(其中取代基與上述相同，s取值如權(quán)利要求1所述)中的R2保護(hù)基，必要的話，當(dāng)s≤9時(shí)，所獲得的產(chǎn)物與單體Ⅲ反應(yīng)或以已知方式進(jìn)行縮聚反應(yīng)。
10.按照權(quán)利要求7所述制備聚異-L-賴(lài)氨酸及其鹽的方法，其中Nα-Z-L-賴(lài)氨酸-對(duì)硝基苯酯·氫氯酸鹽和Nα-Z-Nε-BOC-L-賴(lài)氨酸被用作原料，它們可與異丁基氯甲酸酯反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌萧?br> 11.按照權(quán)利要求7所述制備聚異-L-烏氨酸及其鹽的方法，其中Nα-Z-L-多氨酸-對(duì)硝基苯酯氫氯酸鹽和Nα-Z-Nβ-BOC-L-烏氨酸為原料，它們可與異丁基氯甲酸鹽反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為混合酐。
12.按照權(quán)利要求7所述制備聚異-D-烏氨酸及其鹽的方法，其中Nα-Z-D-烏氨酸-對(duì)硝基苯酯·氫氯酸鹽和Nα-Z-Nβ-BOC-D-烏氨酸被用作原料，通過(guò)與異丁基氯甲酸酯反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化為混合醉。
13.治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)癌癥的方法，其中藥物所含活性組分為權(quán)利要求1所述的化合物，該藥物以有效劑量被使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)所示的新型同多肽及其鹽、對(duì)映體和旋光異構(gòu)體。此外還涉及這些化合物的制備方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1033633SQ8810725
公開(kāi)日1989年7月5日 申請(qǐng)日期1988年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月21日
發(fā)明者吉拉·索克恩, 厄恩·泰伊克, 貝拉·索恩德, 卡羅利·萊平斯, 里查德·加布詹澤 申請(qǐng)人:匈牙利科學(xué)院組織分析研究所, 匈牙利科學(xué)院植物保護(hù)研究所