專利名稱:一種黑色素瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體及其用途和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及黑色素瘤相關(guān)抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體及其用途。
背景技術(shù)：
惡性黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，發(fā)生在頭頸者約占全身的20％，主要發(fā)生于皮膚與腔、竇粘膜。人惡性黑色素瘤通常始于有害的黑痣，這些黑痣在輻射刺激后生長，形成破壞性的轉(zhuǎn)移黑色素瘤。黑色素瘤極易向全身擴散，在臨床上難以控制?；瘜W治療和放射性治療通常對黑色素瘤不起作用。
目前，黑色素瘤免疫組織化學檢測通常使用的抗體是HMB-45、抗S-100和NKI/C3(參見Smoller BR，PATHOLOGYState of the Art Reviews，2371-383，1994)。
HMB-45是一種已知的抗人黑色素細胞的單克隆抗體，它能識別前黑色素小體球蛋白，能夠與黑色素瘤相關(guān)抗原gp-100反應(yīng)。HMB-45還能作用于黑色素瘤、連接痣、紡錘狀細胞和上皮細胞痣、先天痣等。然而，由于HMB-45缺乏高度的敏感性(其敏感性介于67％-93％之間)，在進行檢測時會遺留一定量的黑色素瘤不易被檢測出(參見Wick MR et al.，J Cutan Pathol 1988；15201-207；Ordonez NG et al.，Am.J.Clin.Pathol.1988；90385-390)。
S-100蛋白的抗體比HMB-45具有更高的敏感性(參見Nakajima T et al.，Cancer 1982；50912-918；Kindblom LG et al.，Acta.Pathol.Macrobial.Immunol.Scand.1984；92219-230)，但是它的特異性很差?？筍-100抗體可能附著到良性細胞上，如唾液腺和汗腺、骨骼肌和心肌、組織細胞、Schwann細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突細胞(參見Stefansson K etal.，Nature 1982，29563-64；Stefansson K et al.，BrainRes.1982，234309-317)以及這些細胞產(chǎn)生的腫瘤(參見Tabuchi K et al.，Ac taNeurochir Wien 1982，65239-251)?？筍-100抗體還能附著到許多非黑色素瘤惡性腫瘤組織上(Drier JK et al.，Arch.Pathol.Lab.Med.，1987，111447-452)。
NKI/C3抗體也能作用于許多良性的或惡性的腫瘤，這種非特異性活性使NKI/C3抗體在黑色素瘤檢測上的使用受到了很大的限制。
KBA.62抗體對于黑色素瘤的敏感性與HMB-45相似，但是它能夠附著到鱗狀細胞癌和基底細胞癌上，缺乏特異性(參見Cohen Knafo Eet al.，J Clin Pathol1984；37367-372)。
由此可見，雖然在國內(nèi)外已經(jīng)建立了許多針對黑色素瘤的單克隆抗體，但是這些單克隆抗體的特異性及中和能力均不夠理想。因此，需要建立可以用于臨床治療的單克隆抗體以及人源化的高親和力的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種黑色素瘤特異性的單克隆抗體SM5-1，它對應(yīng)的抗原分子量為220-240KD。將石蠟包埋的黑色素瘤(初級黑色素瘤和轉(zhuǎn)移瘤)和皮膚痣試樣進行免疫組織化學染色，結(jié)果顯示SM5-1能夠作用于所有的痣和惡性黑色素瘤。另一方面，SM5-1不與非活化的表皮黑素細胞、非黑素腫瘤細胞、角化細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和外周神經(jīng)細胞作用。這些結(jié)果表明SM5-1對于黑色素瘤是高度敏感和特異性的。
本發(fā)明的單克隆抗體已經(jīng)在美國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，保藏號為ATCC No.HB-12588。
本發(fā)明還涉及一種分離的、純化的或合成的抗原，能夠特異性結(jié)合SM5-1的抗體。本發(fā)明所述的抗原存在于所有人黑色素瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中，包括但不限于痣、初級黑色素瘤細胞和轉(zhuǎn)移黑色素瘤細胞。另外，用SM5-1檢測發(fā)現(xiàn)，該抗原在正常非活化的人黑色素細胞中是不存在的，在其它腫瘤細胞中也不存在。
本發(fā)明的抗原可用于制備一種黑色素瘤疫苗，能夠引起黑色素瘤的特異性免疫應(yīng)答，從而預(yù)防和治療黑色素瘤?？蓪⒑谏亓隹乖尤氲揭环N佐劑形成藥物組合物。使用的佐劑包括但不限于弗羅依德氏完全和不完全佐劑、礦物膠、表面活化底物。
如本發(fā)明所用，“分離的”限定的是一種從天然狀態(tài)(如細胞，胞外物質(zhì))分離的或合成的多肽(抗原或抗體)，已經(jīng)從正常的天然環(huán)境中脫離開來。該分離的多肽是獨特的，區(qū)別于純化的、天然分離的多肽?！凹兓摹毕薅ǖ氖且环N不是完全純的多肽，比天然狀態(tài)相對純。
本發(fā)明還涉及一種能夠識別SM5-1抗體識別抗原的親合分子。這些親合分子包括但不限于抗體、肽和其它能夠特異性結(jié)合抗原的聚合物，其中優(yōu)選的親合分子是單克隆抗體。本發(fā)明中不同的單克隆抗體可以識別不同的抗原決定簇。本發(fā)明中優(yōu)選的單克隆抗體是純化的、分離的。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的單克隆抗體具備的條件是(1)能夠識別痣、初級黑色素瘤細胞和轉(zhuǎn)移黑色素瘤細胞抗原；(2)不能識別正常的非活化黑色素瘤細胞抗原(即不能與其任何一種抗原結(jié)合)；(3)不能識別其它的任何腫瘤細胞(即不能與其任何一種抗原結(jié)合)。
本發(fā)明所述的抗體可以是任何一種免疫球蛋白，比如IgA、IgG、IgD、IgE、IgM及其亞類，此外也可以是完整的抗體或抗體片段，包括但不限于FAB、F(ab)2’、Fv。
另外本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的抗體具有相同結(jié)合特異性的抗體衍生物，這些衍生物在其抗原結(jié)合非關(guān)鍵區(qū)域上有所變更。
本發(fā)明的單克隆抗體也可以與其他的分子連接，特別是標記物和毒素，包括但不限于酶(如過氧化物酶)、毒素(如蓖麻蛋白或霍亂毒素)、熒光素和放射性標記物。
單克隆抗體可以由本技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的細胞融合技術(shù)獲得?？贵w分泌細胞系也可以由融合技術(shù)以外的其它技術(shù)獲得，比如用致癌的DNA、病毒直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞。不同來源的抗原被用于激發(fā)正常的B淋巴細胞系，之后轉(zhuǎn)變?yōu)闊o限增殖細胞系。比如，與SM5-1抗體發(fā)生免疫沉淀的抗原可作為免疫原刺激哺乳動物(如小鼠、大鼠、倉鼠等)。收集被抗原刺激的淋巴細胞，應(yīng)用本技術(shù)領(lǐng)域：
公知的技術(shù)融合到無限增殖細胞，或者轉(zhuǎn)化入無限增殖細胞系?？梢酝ㄟ^選擇能夠與抗原發(fā)生強反應(yīng)的克隆篩選抗黑色素瘤細胞抗體產(chǎn)物；也可以通過選擇與SM5-1競爭性結(jié)合黑色素瘤細胞和/或其分離的或純化的抗原的克隆來篩選抗黑色素瘤細胞抗體產(chǎn)物。
本發(fā)明涉及的細胞系優(yōu)選的是雜交瘤細胞系，另一種優(yōu)選方式是無限增殖細胞系。
本發(fā)明中的單克隆抗體和其他親和分子可用于分離黑色素瘤抗原(參見Harlow and Lane，“免疫純化”，第511-552頁)。
本發(fā)明中的單克隆抗體和其他親和分子還可用于分離黑色素瘤細胞。因而本發(fā)明還提供一種大量生產(chǎn)富含人黑色素瘤細胞的細胞群的方法，包括選擇一種預(yù)計包含黑色素瘤細胞的組織細胞懸浮液，將細胞懸浮液與能夠識別SM5-1抗體識別抗原的單克隆抗體(或其它親和分子)共懸浮，然后從細胞懸浮液中分離結(jié)合了抗體的細胞。
人的黑色素瘤細胞和表達其它SM5-1識別抗原的細胞可以使用本發(fā)明的抗體，通過間接免疫技術(shù)從其它細胞中分離，所用的技術(shù)包括熒光激活細胞分離(FACS)技術(shù)和其它本技術(shù)領(lǐng)域：
公知的技術(shù)，比如將結(jié)合到細胞的抗體進行標記，用細胞分離設(shè)備分離帶有標記的細胞。
另外，抗黑色素瘤抗體或其它親和分子可以附著到固體支持物上，這些固體支持物是本技術(shù)領(lǐng)域：
公知的，包括但不限于瓊脂糖珠、磁化珠、多聚苯乙烯、中空纖維膜和塑料有蓋培養(yǎng)皿。可以結(jié)合到抗體上的細胞附著到固體支持物，因而從上清中得以分離出來。
本發(fā)明的單克隆抗體和其它親和分子可用于篩選病人組織中的黑色素瘤樣品，包括活組織檢查樣品、血液和其它體液樣品?？墒褂妹庖呓M織化學染色技術(shù)進行活組織樣品的黑色素瘤檢測。組織樣品可保存于福爾馬林或其它標準的防腐劑中，脫水并且包埋于石蠟，可將樣品進行切片，固定在玻片上。切片試樣也可以直接用冰凍組織制備。
除了活組織檢查樣品，本發(fā)明的單克隆抗體特異性黑色素瘤抗原也可以在組織樣品中進行檢測，采用的方法是本技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的免疫學方法，根據(jù)生物樣品的不同來源制備不同的待測試樣。采用的分析技術(shù)可參見Harlowand Lane，免疫測定(471-510)和免疫印跡(552-612)。
本發(fā)明可用的標記物包括但不限于放射核素、酶、熒光素-猝滅劑復(fù)合物、化學發(fā)光素、磁性微粒、輻射不透性染料。這些標記物可通過許多共價結(jié)合連接基團或功能基團直接結(jié)合到單克隆抗體上。使用一些已知技術(shù)將抗原-抗體復(fù)合物固定到固體支持物(如微?；蛉萜鞅?上，另外還采用ELISA、RIA、EIA(參見Frye et al.，1987)等技術(shù)進行測定。
本發(fā)明還涉及測定試劑盒，可以使用測定試劑盒進行包含單克隆抗體或其它親和分子的黑色素瘤相關(guān)抗原的定量和定性分析。
在外科手術(shù)、化療、放療之前、之中和之后，可使用本發(fā)明的抗體和/或其他親和分子檢測體液(如血清)中黑色素瘤抗原水平，以測定出體內(nèi)出現(xiàn)的腫瘤跡象及位置。
身患黑色素瘤的病人患次級腫瘤(比如肺癌)的可能性是非常高的(參見Swerdlow AJ et al.Int.J.Cancer 1995；61773-779)，因此對于黑色素瘤的分析和鑒定非常重要。由于SM5-1能夠識別轉(zhuǎn)移黑色素瘤，其對于黑色素瘤及轉(zhuǎn)移瘤的分析和鑒定是非常有用的。并且通過使用SM5-1可以正確地檢測黑色素瘤的起源。
本發(fā)明還涉及SM5-1單克隆抗體的重組蛋白，它們含有經(jīng)過人源化改造的氨基酸序列，適合于在人體中高表達。
本發(fā)明的重組SM5-1可用多種方法制備而得，既可以如本發(fā)明所述由重組SM5-1編碼核酸表達而得，也可以通過全化學合成獲得。有關(guān)蛋白質(zhì)或肽的制備在現(xiàn)有文獻中多有記載，這些方法都適用于本發(fā)明重組SM5-1的制備。此外，蛋白質(zhì)的鑒定也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在現(xiàn)有文獻中多有記載。因此，根據(jù)本發(fā)明給定的氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)獲得本發(fā)明的重組SM5-1。
編碼SM5-1重組蛋白的重組核酸可用多種方法獲得，其中包括，以公開的天然序列為模板進行定點誘變；或根據(jù)本發(fā)明給定的序列進行全合成。這些都已是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。而且，核苷酸序列的鑒定也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在現(xiàn)有文獻中多有記載。因此，根據(jù)本發(fā)明給定的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)制備得到本發(fā)明的編碼SM5-1的重組核酸。
本發(fā)明還提供一種載體，其中含有本發(fā)明的重組核酸。在本領(lǐng)域中，通過適當?shù)目寺〖夹g(shù)，將目的核酸片段插入合適的載體以實現(xiàn)保存、擴增和/或表達等目的，已是一般常規(guī)技術(shù)。合適載體的選擇取決于克隆目的，載體容留，與宿主細胞的相容性，酶切位點等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難根據(jù)具體情況做出適當選擇?？捎靡员景l(fā)明的載體例如但不限于pUC18、pUC19、pUC57、pBluescript sk+/sk-。
本發(fā)明還提供含有重組SM5-1編碼核酸的宿主細胞，例如大腸桿菌。對于大腸桿菌的基因工程操作在本領(lǐng)域內(nèi)已相當成熟。例如，按照標準技術(shù)，通過常規(guī)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、微注射等多種方法都可將目的核酸導(dǎo)入宿主細胞，并結(jié)合常規(guī)篩檢方法，可獲得良好的再現(xiàn)性。
基于SM5-1對黑色素瘤細胞系的致死作用，本發(fā)明的單克隆抗體和其它親和分子或重組蛋白可用于被動免疫黑色素瘤病人。因此，本發(fā)明還提供了一種包含一個或多個本發(fā)明的抗體或親和分子的藥物組合物。將藥物組合物選擇性地與藥物載體、佐劑等結(jié)合，通過適當?shù)慕o藥途徑施加于黑色素瘤患者。
如本發(fā)明所用，“藥物載體”是指當分子本體和組合物適當?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本發(fā)明所指的“藥學上可接受的載體”應(yīng)當與本發(fā)明的單克隆抗體相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果?？勺鳛樗帉W上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以采用灌注和其它治療方式。
作為一種優(yōu)選的方式是，被動免疫的抗體的單位劑量介于1-200mg范圍，該單位劑量也可以多次地施加給黑色素瘤患者。單克隆抗體可以直接施加于黑色素瘤位置(參見Irie et al.，1986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838694-8698)，也可以整體施加給患者(尤其是發(fā)生了轉(zhuǎn)移的)。本發(fā)明的抗體可以單獨施用于患者，也可以與毒素、放射劑或其它治療手段共同使用。
黑色素瘤抗原可以包被在抗原遞呈細胞(APC)上，也可以轉(zhuǎn)染或脈沖進入APC，制備能刺激抗黑色素瘤細胞免疫應(yīng)答或能預(yù)防黑色素瘤的細胞疫苗。這里的APC包括但不限于樹突細胞、B細胞和巨噬細胞。也可將分離的黑色素瘤細胞與APC細胞融合來制備細胞疫苗?？梢杂眉毎蜃舆M行處理，以擴增細胞疫苗，該技術(shù)可參見PCT公開號為WO 97/16238的專利。
黑色素瘤抗原的抗體可以自身作為抗原產(chǎn)生單克隆個體遺傳型特異性的抗體，抗個體遺傳型多克隆或單克隆抗體可用于檢測黑色素瘤抗原宿主上黑色素瘤抗體的存在與否，其中黑色素瘤抗原的抗體和被分析的體液(如血液、血清、尿液)必須來源于同一個體。抗個體遺傳型單克隆抗體可用于測定人體液中黑色素瘤抗原水平?？箓€體遺傳型單克隆抗體可以由任何宿主，比如嚙齒動物生產(chǎn)，優(yōu)選的是大鼠或小鼠?？箓€體遺傳型單克隆抗體也可以是人源化的或人類抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體還可用于篩選黑色素瘤抗原?？梢允褂貌溉閯游锛毎矔r表達載體構(gòu)建黑色素瘤A2058細胞株的cDNA文庫并轉(zhuǎn)染COS細胞，以黑色素瘤單抗SM5-1為探針對上述表達文庫進行多輪篩選，并對篩選得到的陽性克隆進行序列分析和鑒定，獲得相應(yīng)的黑色素瘤抗原。



圖1為結(jié)合了單克隆抗體SM5-1的黑色素瘤免疫組織化學染色圖。其中圖1A為痣細胞同源染色圖，非活化的基礎(chǔ)黑素細胞沒有被染色。
圖1B為黑色素瘤原位染色圖。
圖1C為黑色素瘤的表面分布染色圖。
圖1D為黑色素瘤轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的染色圖。
具體實施方式
1.SM5-1抗體的制備從患者的初級黑色素瘤中采集黑色素瘤細胞系SMMU-1(參見Guo et al.，1994，Cancer Res.54561-1565)，將之免疫小鼠。接著小鼠用環(huán)磷酰胺處理去除活化的B細胞。將小鼠免疫從同一病人體內(nèi)采集的轉(zhuǎn)移黑色素瘤細胞系SMMU-2，用小鼠的脾細胞制備雜交瘤，雜交瘤的制備所涉及的技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域：
的常規(guī)技術(shù)(參見Kohler G et al.，Eur.J.Immunol.1976；6511-519)。
2.組織標本的免疫組織染色SM5-1試樣可以是冰凍的或包埋于石蠟的。收集SM5-1雜交瘤的上清，使用鏈酶抗生物素-生物素標記(LSAB)的方法進行免疫組織化學染色。簡要地說，將樣品與主要抗體共培養(yǎng)10分鐘，接著與生物素化的連接抗體、過氧化物酶標記的鏈酶抗生物素和底物色原體溶液共培養(yǎng)。所有步驟中使用的SM5-1上清是經(jīng)過稀釋(1∶50)的。
黑色素瘤樣品也用HMB-45(1∶50稀釋)和S-100蛋白的單克隆抗體(1∶20稀釋)染色。還選擇了許多人黑色素瘤的樣品進行試驗，包括初級黑色素瘤和黑色素瘤轉(zhuǎn)移瘤(皮膚、淋巴結(jié)等)。
準備相關(guān)組織，用緩沖的10％甲醛固定后，用石蠟包埋，然后用常規(guī)的組織學技術(shù)進行研究。
SM5-1對于非黑色素瘤樣品和良性組織的反應(yīng)活性列在表2和表3中。
HMB-45的染色方式是細胞質(zhì)顆粒染色，而SM5-1的染色可以是細胞質(zhì)，也可以是細胞膜，因此兩種抗體識別的是細胞上不同的抗原。結(jié)果顯示，對于黑色素瘤的反應(yīng)，SM5-1比HMB-45具有更高的敏感性，比抗S-100抗體具有更高的特異性。
3.SM5-1能夠識別惡性黑色素瘤和痣的抗原表1中顯示了226個黑色素瘤和16個痣針對于SM5-1、HMB-45和抗S-100的免疫組織化學分析。不管是什么組織類型，所有的被試初級黑色素瘤和痣對于SM5-1的反應(yīng)是陽性的，染色效果很強，并且涉及絕大多數(shù)的腫瘤細胞。采用細胞質(zhì)和細胞膜的染色方式。初級黑色素瘤和轉(zhuǎn)移瘤的染色強度和染色方式是相同的。
HMB-45能夠檢測到所有的初級黑色素瘤和痣，然而，83％的轉(zhuǎn)移黑色素瘤HMB-45不能被染色。所有的HMB-45陰性黑色素瘤能被SM5-1染色。另外還發(fā)現(xiàn)，在被SM5-1和HMB-45共同染色的組織樣品中，SM5-1和HMB-45的抗原決定簇存在于不同類型的腫瘤中，這表明SM5-1和HMB-45的抗原決定簇是不同的，而且它們表達在黑色素瘤組織樣品的不同群體中。
4.SM5-1對黑色素瘤細胞系的致死作用在PRIM1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑色素瘤A2058細胞株至106細胞/毫升。在96孔板的每個孔中加入20ul上述細胞懸浮液和不同量的SM5-1單抗(0，1，5，10，20，50，100ul；單抗溶于FCS PRIM1640培養(yǎng)基，濃度為1ug/ul)，每孔加入PRIM1640培養(yǎng)基至500ul。每個處理3次重復(fù)。在37度5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后進行MTT反應(yīng)，然后在顯微鏡下檢查存活細胞數(shù)或者經(jīng)過MTT反應(yīng)后在酶標儀上讀取570nm處的光吸收。
(1)細胞計數(shù)。從上述樣品中取出0.2毫升進行細胞計數(shù)，結(jié)果以存活細胞百分數(shù)表示，具體數(shù)據(jù)如下SM5-1加入量 0 1 5 10 20 50 100(ul)細胞存活數(shù) 100.0 87.8 68.8 53.2 42.6 32.6 22.6
上述結(jié)果說明，SM5-1具有明顯的殺傷黑色素瘤細胞的作用。(2)MTT檢測取經(jīng)過SM5-1處理的細胞0.2毫升，加入1/10體積濃度為5mg/ml的MTT溶液，37度培養(yǎng)30分鐘后在酶標儀上讀取570nm處的光吸收。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過SM5-1處理的細胞比未經(jīng)處理的對照光吸收明顯降低。這說明SM5-1處理可導(dǎo)致黑色素瘤細胞的大量死亡。SM5-1加入量 0 1 5 10 20 50 100(ul)光吸收 100.0 96.3 84.9 66.2 47.7 33.6 20.1從上述兩個檢測結(jié)果可以看出，SM5-1具有明顯的殺傷黑色素瘤細胞的作用，因此有可能在臨床上用于治療黑色素瘤。
5.SM5-1與黑色素瘤冰凍切片的作用36個黑色素瘤樣品(包括17個初級黑色素瘤和19個轉(zhuǎn)移瘤)分成2組，一組用石蠟包埋，另一組進行瞬間包埋(組織放于液氮中，用顯微鏡用薄片切片機(5μm)切割)，然后在低溫下用SM5-1(1∶51稀釋)染色。結(jié)果顯示，所有的冰凍切片與石蠟包埋的方式取得的SM5-1染色效果是相似的。
6.SM5-1不能染色于非黑色素惡性腫瘤和人的正常組織為了檢測SM5-1是否與其它惡性黑色素瘤發(fā)生交叉反應(yīng)，本發(fā)明還對許多非黑色素瘤樣品進行石蠟包埋，檢測它們對于SM5-1的染色情況。被測試的腫瘤組織包括皮膚、腦、胃腸等，結(jié)果見表2，所有的待測樣品染色結(jié)果都呈陰性。
在人正常組織中，除了能夠與血漿細胞、外分泌腺分泌物、一些肌成纖維細胞和血管周圍樹突細胞發(fā)生微弱反應(yīng)以外，大多數(shù)的正常細胞并不能與SM5-1反應(yīng)。
7.SM5-1重組蛋白的制備1)從抗體庫中篩選SM5-1的抗體可變區(qū)基因按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法構(gòu)建人源抗體庫。
將復(fù)蘇的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培養(yǎng)16小時。
12000rpm高速離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一個無菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆?。其滴度?yīng)在2×1011以上。以純化的黑色素瘤抗原為抗原，包被2 5毫升細胞培養(yǎng)瓶。在包被后的細胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體顆粒，37℃溫育1小時。然后，倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。在培養(yǎng)瓶中加入1毫升對數(shù)期的TG1細胞，37℃溫育震蕩培養(yǎng)16小時。
重復(fù)上段所述步驟共4次。
將上述獲得的細胞稀釋至100000細胞/毫升，然后在加入0.1％氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上進行培養(yǎng)以獲得單克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進行培養(yǎng)，每孔一個克隆，共作960個克隆(10塊96孔板)。將上述深孔板在96孔板離心機上5000RPM離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4度備用。
取96孔板10塊，每孔中加入SM5-1(10微克/毫升)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37℃溫育1小時后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。加入1微升HRP標記的羊抗M13單抗，37℃溫育30分鐘后用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃溫育顯色20分鐘后在讀板機上讀取595納米處的光吸收。根據(jù)光吸收讀數(shù)確定顯色反應(yīng)強的孔，這些孔相對應(yīng)的克隆即為親和力較強的抗體可變區(qū)克隆。
通過上述過程共篩選出415個陽性克隆，根據(jù)讀數(shù)確定其中5個親和力最強的克隆。將這5個克隆分別接種在100毫升LB培養(yǎng)基中，在37℃260rpm條件下震蕩培養(yǎng)9小時后加入終濃度為1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時。然后分離純化重組SM5-1抗體蛋白。抽提純化的重組SM5-1蛋白質(zhì)用于親和力研究，找出具有最高表達量和最高親和力的陽性克隆，用于后續(xù)的研究。
將上述陽性克隆的菌株在100毫升LB培養(yǎng)基中擴增，用Promega公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。
用XbaI和NheI酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取350bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為重鏈可變區(qū)編碼序列。
用HindIII和Bsi WI酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取320bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區(qū)編碼序列。
然后首先將上述重鏈可變區(qū)編碼序列插入到表達載體pMG18-3K(參見DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State University Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)的Xba I/NheI位點中，再用Hind III和Bsi WI將上述抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列插入到插入有重鏈可變區(qū)編碼序列的pMG18-3K的HindIII/Bsi WI位點中，構(gòu)建成人源化抗SM5-1抗體基因的表達載體。
2)CHO細胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選上述步驟3)中構(gòu)建的帶有抗體基因的表達載體在大腸桿菌DH5α菌株接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進行擴增，用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提純化質(zhì)粒DNA。將上述純化的質(zhì)粒DNA采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒轉(zhuǎn)染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉(zhuǎn)化的CHO細胞在選擇培養(yǎng)基上進行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進行極度稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進行3次，進行單克隆化。
挑出的單克隆細胞系在RPMI 1641培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對上清進行Western印跡實驗，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達強度，挑選出10個表達較強的克隆作為候選細胞株(見表1)。
上述單抗的純化采用Protein A(Pharmacia公司)親和層析柱從細胞培養(yǎng)上清中直接分離純化，并用SDA-PAGE電泳證明，所得產(chǎn)物純度大于90％。以上親和層析的產(chǎn)物再次經(jīng)過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。將這些樣品用于以下的進一步分析與研究。
3)抗體基因在CHO細胞中表達強度的研究將上述篩選得到的高表達候選克隆培養(yǎng)于10cm的組織培養(yǎng)皿中，采用ELISA法測量抗體的表達量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經(jīng)2％BSA于37℃封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標準品(人IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進行結(jié)合反應(yīng)，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測A450值。測得上述10個候選克隆的表達量如下表1抗體基因在CHO細胞中表達強度細胞株編 3 5 4 5 6 3 4 4 5 6號 E9 D7 C6 H8 A6 B4 D8 F6 G7 G2表達量 1 1 3 3 4 3 3 1 2 1(ug/毫升) 16.7 28.9 66.7 43.2 08.6 72.1 32.1 76.4 31.4 46.9從上表可以看出，編號為4C6、5H8、6A6和3B4的細胞株的表達水平具有很高的表達水平(340-410毫克/毫升)，已經(jīng)遠遠超出了國內(nèi)外單抗類的表達水平(50-100mg/毫升)。
8.黑色素瘤抗原的篩選(1)構(gòu)建黑色素瘤細胞株A2058的cDNA文庫。
黑色素瘤A2058細胞用Trizol試劑提取總RNA，用Oligo(T)纖維柱層析法分離mRNA，用隨機引物將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，補平后與BstXI酶切位點的接頭相連，經(jīng)BstXI酶切后克隆到哺乳動物瞬時表達載體pCDM8(Invitrogen)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3，構(gòu)成cDNA文庫。
(2)文庫的表達和篩選。
將COS-7細胞鋪到20個10cm的培養(yǎng)皿中，用以上構(gòu)建的cDNA文庫按lipofectin法進行轉(zhuǎn)染，12小時后細胞用胰酶消化后重新鋪于新的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染72小時，收集細胞重懸于含單抗SM5-1的PBS/10mM EDTA/5％FBS液中，冰浴1小時，細胞經(jīng)洗滌后重懸于PBS/EDTA/0.5％FBS液中，將細胞分別鋪到10個用羊抗鼠IgG二抗包被的分篩皿中，室溫靜置2小時后用PBS/EDTA/5％FBS液輕輕洗滌(將未與抗體結(jié)合的細胞去掉)，然后收集吸附在分篩皿上的細胞，采用Hirt法回收細胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/p3進行擴增重新構(gòu)成一個新的cDNA文庫。
將COS-7細胞鋪到6個10cm的塑料培養(yǎng)皿中，用以上構(gòu)建的新cDNA庫lipofectin法進行轉(zhuǎn)染，按照第一輪中的方法進行第二輪篩選，然后又得到一個新cDNA庫。
經(jīng)過4輪轉(zhuǎn)染、表達、分篩和質(zhì)?；厥?，將最后一次用Hirt法回收的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3后鋪板，隨機挑取多個單克隆擴增、抽提質(zhì)粒，并分別用Lipofectin法轉(zhuǎn)染COS-7細胞，轉(zhuǎn)染進行12小時，細胞用胰酶消化后重新鋪于新的塑料皿中，轉(zhuǎn)染72小時后加入單抗SM5-1，并用FITC標記的羊抗人IgG二抗染色，最后在熒光顯微鏡下觀察，鑒定出陽性克隆，同時用空載體轉(zhuǎn)染的COS-7細胞作對照。(3)序列分析和陽性克隆的鑒定將得到的陽性克隆進行測序，并與國際基因庫資料比較，確定為新基因。以cDNA序列推導(dǎo)出抗原的氨基酸序列分析其功能區(qū)域。
用Western Blot法進行陽性克隆的鑒定。將COS-7細胞、不表達抗原基因的COS-7細胞(經(jīng)空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得)、表達抗原基因的COS-7細胞(經(jīng)陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得)和黑色素瘤細胞株A2058用高濃度SDS分別提取以上細胞膜蛋白，進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜經(jīng)BSA封閉后依次加入SM5-1單抗、HRP標記的羊抗鼠IgG，最后用DAB顯色，分析抗原基因的表達及抗原分子量大小。
用流式細胞儀分析抗原基因在哺乳動物細胞中的表達。將COS-7細胞鋪到塑料皿中，用含10μg質(zhì)粒按Lipofectin法進行轉(zhuǎn)染，同時用空載體轉(zhuǎn)染細胞作為對照。轉(zhuǎn)染12小時時，用胰酶消化COS-7細胞并將其轉(zhuǎn)移到一個新的塑料皿中，轉(zhuǎn)染進行72小時時，收集細胞，洗滌后分別重懸于含黑色素瘤單抗SM5-1、A103和T311的PBS/EDTA/5％FBS液中，冰浴1小時。收集細胞，洗滌后重懸于含F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG二抗的PBS/EDTA/5％FBS液中，冰浴1小時，PBS/EDTA洗滌轉(zhuǎn)染細胞后用流式細胞儀進行分析。表1SM5-1、HMB-45和抗S-100與良性和惡性黑色素瘤的反應(yīng)免疫組織化學染色黑色素瘤 SM5-1 NMB-45 抗S-100(陽性/待測樣品) (陽性/待測樣品) (陽性/待測樣品)痣


黑色素瘤


表2SM5-1與非黑色素瘤(石蠟包埋切片)的反應(yīng)活性腫瘤型 SM5-1免疫組織化學染色(陽性/待測樣品)皮膚降突性皮膚纖維肉瘤 0/2梅克爾細胞瘤 0/1汗腺瘤 0/3sqnamous細胞瘤 0/4腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤 0/1星細胞瘤 0/4少突細胞瘤 0/1腦膜瘤 0/3成膠質(zhì)細胞瘤 0/2神經(jīng)膜瘤 0/1胃腸道食道癌 0/2胃癌 0/2結(jié)腸癌 0/2胰腺癌 0/2其它支器官癌 0/1甲狀腺癌 0/1胸腺癌 0/1前列腺癌 0/1卵巢癌 0/1腎癌 0/1平滑肌肉瘤 0/2M.paget 0/1血管平滑肌瘤 0/1血管肉瘤 0/3porocarcinoma 0/1膀胱上皮癌 0/1骨肉瘤 0/2總合 0/46表3SM5-1與正常組織、正常細胞、良性瘤的反應(yīng)活性組織或瘤 SM5-1免疫化學染色陰性腎小球 -----纖毛上皮組織 -----Beaker細胞 -----Sebacious腺 -----肝組織 -----正常黑素細胞 -----角化細胞 -----胰島細胞 -----外周神經(jīng) -----嗜中性粒細胞 -----平滑肌細胞 -----胃黏膜 -----室管膜細胞瘤 -----瘢痕瘤 -----活化的黑素細胞 -----微弱陽性活化的巨噬細胞 +肌成纖維細胞 +血漿細胞 +外分泌腺汗腺分泌物 +甲狀腺分泌物 +
權(quán)利要求
1.一種能夠特異性結(jié)合人黑色素瘤細胞抗原的單克隆抗體，其中抗原(a)能夠被ATCC保藏號HB-12588的雜交瘤產(chǎn)生的抗體結(jié)合；(b)存在于人黑素細胞的膜和細胞質(zhì)中；(c)不存在于正常非活化的人黑色素細胞和非黑色素細胞腫瘤細胞。
2.如權(quán)利要求
1的單克隆抗體，該抗體與ATCC保藏號HB-12588的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體相似。
3.如權(quán)利要求
1的單克隆抗體，該抗體是由ATCC保藏號HB-12588的雜交瘤產(chǎn)生的。
4.一種雜交瘤，能夠生產(chǎn)權(quán)利要求
1的單克隆抗體。
5.一種雜交瘤，能夠生產(chǎn)權(quán)利要求
2的單克隆抗體。
6.一種雜交瘤，能夠生產(chǎn)權(quán)利要求
3的單克隆抗體。
7.一種分離的、純化的抗原，其特征在于(a)能夠特異性結(jié)合到ATCC保藏號HB-12588的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體上，(b)存在于人黑色素瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中，(c)不存在于正常非活化的人黑素細胞和非黑素細胞腫瘤細胞。
8.一種檢測黑色素瘤存在與否的方法，涉及(1)將樣品與抗原特異性抗體結(jié)合，其中的抗原(a)能夠被ATCC保藏號HB-12588雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合，(b)存在于人黑素細胞的膜和細胞質(zhì)，(c)不存在于正常非活化的人黑素細胞和非黑素細胞腫瘤細胞；(2)檢測形成的免疫化合物，判斷黑色素瘤細胞存在與否。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中的組織樣品是石蠟包埋的或冰凍的樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中的單克隆抗體或單克隆抗體的第二抗體結(jié)合到一個可檢測信號標記物上。
11.一種利用權(quán)利要求
1或2或3的單克隆抗體篩選抗原基因的方法，其特征在于，用哺乳動物細胞瞬時表達載體構(gòu)建黑色素瘤細胞株的cDNA文庫并轉(zhuǎn)染宿主細胞，以黑色素瘤單克隆抗體為探針對表達文庫進行篩選，獲得陽性克隆。
12.如權(quán)利要求
11的方法，其特征在于，用哺乳動物細胞瞬時表達載體構(gòu)建黑色素瘤A2058細胞株的cDNA文庫并轉(zhuǎn)染COS-7細胞。
13.一種權(quán)利要求
1的單克隆抗體的重組蛋白，其特征在于，含有經(jīng)過人源化改造的氨基酸序列，能夠在人體內(nèi)高表達。
14.一種治療黑色素瘤的藥物組合物，其特征在于，它含有藥學上有效量的權(quán)利要求
1或2或3所述的人單克隆抗體或權(quán)利要求
13所述的重組蛋白以及藥學上可接受的載體。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種新發(fā)現(xiàn)的能夠識別黑色素瘤的特異性抗原的單克隆抗體，本發(fā)明還公開了該單克隆抗體在黑色素瘤細胞的分離、黑色素瘤的檢測中的作用，本發(fā)明還涉及包含該單克隆抗體的藥物組合物，其對于黑色素瘤的免疫治療也是非常有用的，本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的重組蛋白。
文檔編號C12P21/02GKCN1443778SQ02111030
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月13日
發(fā)明者馬菁, 王皓, 劉慶法 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan