本發(fā)明涉及酪酸梭菌在制備預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病制劑中的應(yīng)用，具體是用酪酸梭菌預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病，減少氣流受限、改善肺部功能。
背景技術(shù)：
：慢性阻塞性肺疾病(copd)是一種氣流受限呈不完全可逆和進(jìn)行性發(fā)展?fàn)顟B(tài)的氣道阻塞性肺部疾病。目前，copd是世界上第四位的主要死亡原因，而在我國(guó)已居疾病負(fù)擔(dān)序列的第一位。copd病死率及致殘率較高，據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究項(xiàng)目估計(jì)，2020年copd將占全球死因的第3位。copd屬嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，目前已經(jīng)被行業(yè)列入重大疾病慢病管理體系內(nèi)。目前臨床常用治療copd的藥物包括糖皮質(zhì)激素、β2-受體激動(dòng)劑等。β2-受體激動(dòng)劑可擴(kuò)張支氣管、緩解氣流受限，不能對(duì)氣道病變進(jìn)行有效的遏制。糖皮質(zhì)激素是臨床治療copd的首選藥物，但長(zhǎng)期或較高劑量應(yīng)用激素會(huì)導(dǎo)致藥效低、副作用大。目前copd緩解期的治療仍缺乏行之有效的策略，肺功能的惡化仍然無(wú)法避免。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌能夠有效預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病，安全沒(méi)有任何毒副作用，效果優(yōu)于雙歧桿菌，且未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，特申請(qǐng)此發(fā)明專利。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的制劑，該制劑由酪酸梭菌制成。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過(guò)下述步驟實(shí)施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實(shí)現(xiàn)的制備工藝均可以：采取可能含酪酸梭菌的樣品，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶?jī)?nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速?gòu)闹腥?克樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個(gè)稀釋梯度，分別涂布于酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落分別接種于液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后進(jìn)行菌種鑒定和毒性試驗(yàn)，將鑒定為酪酸梭菌的干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1l，蛋白胨40.0g，na2hpo45.0g，k2hpo41.0g，nacl2.0g，mgso40.1g，葡萄糖2.0g，瓊脂25.0g，調(diào)ph7.6，116℃滅菌20分鐘，待其冷至50℃左右，加入卵黃液50.0ml，加入終濃度為200μg/ml的硫酸多粘菌素b，加入終濃度200μg/ml的新霉素，充分混勻后，分注于平皿中。酪酸梭菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1l，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖5.0g，nacl5.0g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，醋酸鈉3.0g，瓊脂0.5g，調(diào)ph6.6-7.0，121℃，滅菌15分鐘。為進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過(guò)酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無(wú)毒性的酪酸梭菌，本發(fā)明所述酪酸梭菌并不局限于為說(shuō)明本發(fā)明所述的菌，只要無(wú)毒性的酪酸梭菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所述酪酸梭菌優(yōu)選但不限于酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303。本發(fā)明實(shí)施說(shuō)明中優(yōu)選使用的酪酸梭菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)：1、為說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的酪酸梭菌為酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察：長(zhǎng)3.0-6.0微米，寬0.6-1.2微米，直桿或梭狀菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，孢子欠端生。平板形態(tài)：菌落圓形，邊緣不整齊，稍凸，不透明，顏色淡黃，表面無(wú)光澤。3、生理生化鑒定硫化氫:-；吲哚:-；明膠液化:-；氨:-；硝酸鹽還原:-；卵磷脂酶反應(yīng):-；脲酶:-；v-p試驗(yàn):-；接觸酶:-；是否需氧:厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定阿拉伯糖:+；鼠李糖:+；纖維二糖:+；d-山梨醇:-；d-果糖:+；可溶性淀粉:+；d-半乳糖:+；蔗糖:+；葡萄糖:+；海藻糖:+；菊糖:+；木糖:+；乳糖:+；葡萄糖酸鹽(鈉):+；d(+)甘露糖:+；麥芽糖:+；d-甘露醇:+；甘油:+；d(+)棉籽糖:+；核糖:+；松三糖:+；蜜二糖:+。本發(fā)明所述的酪酸梭菌指活的生物個(gè)體。本發(fā)明是以有效劑量按上述方法分離的酪酸梭菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。本發(fā)明所述酪酸梭菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的酪酸梭菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的酪酸梭菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。本發(fā)明所述制劑包括酪酸梭菌單獨(dú)應(yīng)用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，尤其包括酪酸梭菌單獨(dú)應(yīng)用或與雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明所述雙歧桿菌指活的生物個(gè)體。本發(fā)明所述雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用的制劑中，固體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上；或液體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。由于本發(fā)明首次公開(kāi)了酪酸梭菌作為主要活性成份制成制劑在預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病中的應(yīng)用，因此含上述酪酸梭菌的制劑在預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病制劑中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的酪酸梭菌在制成任何一種劑型時(shí)，均具有預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的作用。如果其組份中含有酪酸梭菌成份制備成制劑，在其包裝或說(shuō)明書等標(biāo)識(shí)上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的酪酸梭菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。具體實(shí)施方式制備例說(shuō)明：上述已經(jīng)對(duì)酪酸梭菌制劑的制備進(jìn)行說(shuō)明，這里通過(guò)酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303為例進(jìn)行具體說(shuō)明，其他酪酸梭菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本實(shí)施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本實(shí)施很容易掌握，在此不再一一敘述說(shuō)明。制備方法并不局限于本發(fā)明實(shí)施例所述，公知的能夠達(dá)到制備目的的方法均可以，實(shí)施例的制備說(shuō)明只是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。制備實(shí)施例1酪酸梭菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取人的糞便樣品，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶?jī)?nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速?gòu)闹腥?克樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個(gè)稀釋梯度，分別涂布于酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落分別接種于液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)生理生化鑒定為酪酸梭菌，為酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303。酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303菌粉制備，將酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303接種到酪酸梭菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，厭氧37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109cfu/g以上。2毒性試驗(yàn)2.1動(dòng)物及分組取30只spf級(jí)別大鼠，6-8周齡，體重14-18g，隨機(jī)分入酪酸梭菌cgmcc0313.1組、丁酸梭菌cgmcc2303組和未給藥組，每組10只。2.2制備菌液將上述不同的酪酸梭菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為1×109cfu/ml的菌液。2.3方法各酪酸梭菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各酪酸梭菌組每天灌服酪酸梭菌菌液0.5ml，未給藥組每天灌服純化水0.5ml，飼喂14天，觀察體重及毒性反應(yīng)。2.4結(jié)果各組大鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常，無(wú)眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無(wú)死亡情況，未見(jiàn)中毒反應(yīng)。3制備成粉劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)無(wú)毒性，就可將酪酸梭菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)酪酸梭菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于1×107cfu/g，然后裝袋。應(yīng)用效果實(shí)施例說(shuō)明：本發(fā)明以酪酸梭菌df96101保藏編號(hào)cgmcc0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號(hào)cgmcc2303為代表說(shuō)明酪酸梭菌的應(yīng)用效果，菌粉由青島東海藥業(yè)有限公司提供。本發(fā)明中使用的雙歧桿菌來(lái)自于市場(chǎng)銷售產(chǎn)品，公眾能夠購(gòu)買到的雙歧桿菌活菌均可。應(yīng)用效果實(shí)施例1：酪酸梭菌在治療慢性阻塞性肺疾病中的應(yīng)用1模型組制備：1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10周齡健康雄性wistar大鼠，體重(250±20)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)一周：按晝夜節(jié)律采光12h，控制溫度、濕度，自由攝取食物和水，每日定時(shí)更換飼料，通風(fēng)良好，排除其它應(yīng)激因素干擾。1.2制備方式采用熏煙加氣管注入脂多糖(lps)的方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型。第1、14天氣管內(nèi)注入脂多糖(lps)0.1ml(200ug)/只，并360°旋轉(zhuǎn)大鼠5次以上，使lps均勻分布于兩肺。第2-13天、15-28天每日上午在72l密閉箱內(nèi)熏5％香煙(注射器反復(fù)注入香煙煙霧)0.5h。1.3模型組制備結(jié)果造模成功。2藥物治療實(shí)驗(yàn)：2.1實(shí)驗(yàn)方法選取10周齡的健康雄性wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n＝10)、酪酸梭菌(df96101)治療組(n＝10)、酪酸梭菌(qa-08)治療組(n＝10)、雙歧桿菌治療組(n＝10)、模型對(duì)照組(n＝10)。所有對(duì)象均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致。正常對(duì)照組不做任何處理，各治療組和模型對(duì)照組按1.2所述方式建立大鼠copd模型，并于模型建立的第8天起，酪酸梭菌(df96101、qa-08)和雙歧桿菌治療組使用含菌數(shù)為1×106cfu/ml(用0.9％生理鹽水調(diào)制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組灌服0.9％生理鹽水0.5ml，直至第28天結(jié)束。2.2檢測(cè)所有對(duì)象均在第29天行肺功能檢測(cè)。數(shù)據(jù)使用spss21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀察酪酸梭菌對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影響，并與雙歧桿菌進(jìn)行比較。3結(jié)果與正常對(duì)照組相比較，慢性阻塞性肺疾病模型大鼠0.3秒用力呼氣容積(fev0.3)、0.3秒用力呼氣容積/用力肺活量(fev0.3/fvc)、峰流速(pef)均顯著減少(p＜0.01)，提示大鼠氣道不完全堵塞，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與慢性阻塞性肺疾病模型大鼠相比，酪酸梭菌df96101和qa-08治療后，大鼠fev0.3、fev0.3/fvc、pef均增加(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與雙歧桿菌治療組大鼠相比，酪酸梭菌df96101和qa-08治療組大鼠fev0.3、fev0.3/fvc、pef均增加(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酪酸梭菌df96101治療組和qa-08治療組之間，大鼠fev0.3、fev0.3/fvc、pef均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。酪酸梭菌對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺功能有顯著改善作用，能顯著改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的氣流受限癥狀，并顯著高于雙歧桿菌治療組。見(jiàn)表1。表1不同組別大鼠肺功能變化統(tǒng)計(jì)分析組別例數(shù)fev0.3(ml)fev0.3/fvc(％)pef(ml/s)正常對(duì)照組102.51±0.2686.76±9.1225.82±1.35模型對(duì)照組101.62±0.2456.62±7.3621.58±1.32雙歧桿菌治療組101.82±0.2160.67±8.8622.51±1.24酪酸梭菌(df96101)治療組102.15±0.2570.54±7.3124.03±1.28酪酸梭菌(qa-08)治療組102.28±0.2772.02±9.0324.19±1.314討論慢性阻塞性肺疾病模型組和正常對(duì)照組相比大鼠的fev0.3、fev0.3/fvc、pef均顯著減小(p＜0.01)，氣道不完全堵塞。而經(jīng)酪酸梭菌治療后，大鼠的fev0.3、fev0.3/fvc、pef均顯著增加(p＜0.05)，氣流受限顯著改善，且療效顯著好于雙歧桿菌治療組。表明酪酸梭菌干預(yù)能顯著減少慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的氣流受限癥狀、改善肺部功能。酪酸梭菌制劑能夠有效預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病，明顯改善慢性阻塞性肺疾病癥狀，抑制慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展進(jìn)程，且無(wú)任何毒副作用，應(yīng)用依從性好，是預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病的新方法、新突破。本發(fā)明在實(shí)施過(guò)程中所使用的酪酸梭菌菌種已分別于1997年7月28日和2007年12月26日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)保藏，共兩個(gè)下述菌種，但本發(fā)明所述的酪酸梭菌并不局限于這兩種微生物菌種。(1)分類命名：酪酸梭菌clostridiumbutyricum，保存編號(hào)cgmccno.0313.1。(2)分類命名：丁酸梭菌clostridiumbutyricum，保存編號(hào)cgmccno.2303。上述兩個(gè)菌種經(jīng)該微生物中心檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為存活。當(dāng)前第1頁(yè)12