一、技術領域
本發(fā)明屬于中藥提取物的技術領域，特別涉及用于抗病毒的中藥提取物及其制備方法。
二、技術背景
野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(eupatoriumlindleyanumdc.)的地上干燥部分，味苦，性平，有清肺止咳、化痰平喘、降血壓、血脂之功效。野馬追全草所含化學成分有：黃酮類化合物、生物堿、揮發(fā)油、香豆素和倍半萜類酯等。野馬追有明顯的抗?jié)?、解痙、抗炎及降血脂等系列的生物活性。最新研究發(fā)現(xiàn)，野馬追中有鎮(zhèn)痛、抗病毒等作用。因此，為全面充分開發(fā)利用這一資源，制備野馬追提取物有重要的意義。
現(xiàn)有制備抗病毒中藥組合物的方法，如2015年03月25日授權公開的公開號為cn103211997b的“一種抗菌抗病毒的中藥組合物及其制備方法”專利，公開的方法是：蘇葉、白芷、蔓荊子等為原材料，將所有藥材混合研磨成粉末，制成中藥制劑。該方法的主要缺點是：①直接采用原生藥材磨粉制劑，特別容易造成重金屬超標，危害身體健康；②藥材全部用于中藥制劑卻未經(jīng)提取純化，有效成分含量低，效果甚微，若用藥量提高，則會造成服用不方便并容易造成諸多副作用。
三、
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有抗病毒的中藥提取物及其制備方法的不足之處，提供一種以野馬追為原料來分離目標中藥提取物的制備方法，具有制備工藝簡單有效，未使用有毒有害的有機溶劑，制備成本低，設備簡單易得，無“三廢”排放等特點。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種用于抗病毒的中藥提取物及其制備方法，以野馬追為原料，經(jīng)醇提、雙重過柱洗脫、濃縮干燥得目標提取物。其具體的方法步驟如下：
(1)乙醇提取
以野馬追為原料，先將野馬追加入粉碎機中，進行粉碎，再用100～200目的篩網(wǎng)過篩，然后按照過篩后的野馬追粉的質量(g)∶體積分數(shù)為50～80％的乙醇溶液的體積(ml)之比為1∶8～12的比例，在野馬追粉中加入乙醇溶液，攪拌均勻，一同加入回流提取器中，進行第一次回流提取，20～40分鐘后，過濾，收集第一次提取上清液，再同法進行第二次回流提取，合并第一次、第二次提取上清液，即制備出提取液，備用。
(2)回收乙醇
第(1)步完成后，將第(1)步合并的提取上清液，泵入旋轉蒸發(fā)儀中，減壓回收乙醇至無乙醇味為止，收集去乙醇提取液，用于下一步的處理，回收的乙醇可重復利用。
(3)膜過濾
第(2)步完成后，按照第(2)步收集的去乙醇提取液∶純凈水的體積比為1∶8～12的比例，在去乙醇提取液中加入純凈水，先利用震蕩器充分混合均勻，再泵入微孔濾膜過濾器中，控制濾膜的孔徑為0.22～0.45μm，在0.1～0.3mpa的壓力下，進行膜過濾，收集濾過液備用。
(4)聚酰胺樹脂分離
第(3)步完成后，將聚酰胺樹脂按照徑高比為1∶6～10的比例，進行濕法裝玻璃柱a，裝柱完成后，將第(3)步收集的濾過液泵入玻璃柱a中，同時收集過柱液，收集完成后，再用2～3倍濾過液量的純凈水進行洗脫，同時收集玻璃柱a水洗液，純凈水洗脫完成后，合并收集的過柱液和水洗液為a水洗脫液，備用。再用6～8倍濾過液量的體積分數(shù)為70～80％的乙醇溶液進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱a乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得副產(chǎn)物，副產(chǎn)物總黃酮含量約為82～89％。
(5)制備目標提取物
再將大孔樹脂(d101、da-201、wld-3)按照徑高比為1∶8～12的比例，進行濕法裝玻璃柱b，將合并收集的a水洗脫液泵入玻璃柱b中，進行吸附，吸附完成后，用10～12倍水洗脫液量的純凈水進行沖洗，去除未吸附的物質，沖洗完成后，然后再用8～10倍水洗脫液量的體積分數(shù)為60～70％的乙醇溶液，進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱b乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得目標提取物。
本發(fā)明采用上述技術方案后，主要有以下效果：
1、本發(fā)明制備的目標提取物有效成分含量高，抗病毒作用強；生產(chǎn)過程中還得到高價值副產(chǎn)物，提高經(jīng)濟價值的同時還降低生產(chǎn)成本。
2、本發(fā)明在生產(chǎn)過程中，主要使用乙醇、純凈水等無毒物質，避免引用有毒的有機試劑等，并且乙醇使用后，還回收利用。這不但在生產(chǎn)過程中安全無污染，無“三廢”排放，還充分利用資源，保護環(huán)境利于可持續(xù)發(fā)展，進一步降低生產(chǎn)成本。
3、本發(fā)明在生產(chǎn)過程中，不涉及昂貴的設備及儀器，因而生產(chǎn)設備簡單，操作簡便且易于控制，因此生產(chǎn)安全又降低生產(chǎn)成本。
采用本發(fā)明方法制備出的產(chǎn)品，可廣泛應用于醫(yī)藥、保健等行業(yè)中，且具有非常廣闊的市場前景，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和良好的社會效益。
四、具體實施方式
下面結合具體實施方式，進一步說明本發(fā)明。
實施例1
一種用于抗病毒的中藥提取物及其制備方法，具體方法步驟如下：
(1)乙醇提取
以野馬追為原料，先將野馬追加入粉碎機中，進行粉碎，再用100目的篩網(wǎng)過篩，然后按照過篩后的野馬追粉的質量(g)∶體積分數(shù)為50％的乙醇溶液的體積(ml)之比為1∶8的比例，在野馬追粉中加入乙醇溶液，攪拌均勻，一同加入回流提取器中，進行第一次回流提取，20分鐘后，過濾，收集第一次提取上清液，再同法進行第二次回流提取，合并第一次、第二次提取上清液，即制備出提取液，備用。
(2)回收乙醇
第(1)步完成后，將第(1)步合并的提取上清液，泵入旋轉蒸發(fā)儀中，減壓回收乙醇至無乙醇味為止，收集去乙醇提取液，用于下一步的處理，回收的乙醇可重復利用。
(3)膜過濾
第(2)步完成后，按照第(2)步收集的去乙醇提取液∶純凈水的體積比為1∶8的比例，在去乙醇提取液中加入純凈水，先利用震蕩器充分混合均勻，再泵入微孔濾膜過濾器中，控制濾膜的孔徑為0.22μm，在0.1mpa的壓力下，進行膜過濾，收集濾過液備用。
(4)聚酰胺樹脂分離
第(3)步完成后，將聚酰胺樹脂按照徑高比為1∶6的比例，進行濕法裝玻璃柱a，裝柱完成后，將第(3)步收集的濾過液泵入玻璃柱a中，同時收集過柱液，收集完成后，再用2倍濾過液量的純凈水進行洗脫，同時收集玻璃柱a水洗液，純凈水洗脫完成后，合并收集的過柱液和水洗液為a水洗脫液，備用。再用6倍濾過液量的體積分數(shù)為70％的乙醇溶液進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱a乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得副產(chǎn)物，副產(chǎn)物總黃酮含量約為82％。
(5)制備目標提取物
再將大孔樹脂(d101)按照徑高比為1∶8的比例，進行濕法裝玻璃柱b，將合并收集的a水洗脫液泵入玻璃柱b中，進行吸附，吸附完成后，用10倍水洗脫液量的純凈水進行沖洗，去除未吸附的物質，沖洗完成后，然后再用8倍水洗脫液量的體積分數(shù)為60％的乙醇溶液，進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱b乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得目標提取物。實施例2
一種用于抗病毒的中藥提取物及其制備方法，具體方法步驟如下：
(1)乙醇提取
以野馬追為原料，先將野馬追加入粉碎機中，進行粉碎，再用150目的篩網(wǎng)過篩，然后按照過篩后的野馬追粉的質量(g)∶體積分數(shù)為65％的乙醇溶液的體積(ml)之比為1∶10的比例，在野馬追粉中加入乙醇溶液，攪拌均勻，一同加入回流提取器中，進行第一次回流提取，30分鐘后，過濾，收集第一次提取上清液，再同法進行第二次回流提取，合并第一次、第二次提取上清液，即制備出提取液，備用。
(2)回收乙醇
第(1)步完成后，將第(1)步合并的提取上清液，泵入旋轉蒸發(fā)儀中，減壓回收乙醇至無乙醇味為止，收集去乙醇提取液，用于下一步的處理，回收的乙醇可重復利用。
(3)膜過濾
第(2)步完成后，按照第(2)步收集的去乙醇提取液∶純凈水的體積比為1∶10的比例，在去乙醇提取液中加入純凈水，先利用震蕩器充分混合均勻，再泵入微孔濾膜過濾器中，控制濾膜的孔徑為0.3μm，在0.2mpa的壓力下，進行膜過濾，收集濾過液備用。
(4)聚酰胺樹脂分離
第(3)步完成后，將聚酰胺樹脂按照徑高比為1∶8的比例，進行濕法裝玻璃柱a，裝柱完成后，將第(3)步收集的濾過液泵入玻璃柱a中，同時收集過柱液，收集完成后，再用2.5倍濾過液量的純凈水進行洗脫，同時收集玻璃柱a水洗液，純凈水洗脫完成后，合并收集的過柱液和水洗液為a水洗脫液，備用。再用7倍濾過液量的體積分數(shù)為75％的乙醇溶液進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱a乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得副產(chǎn)物，副產(chǎn)物總黃酮含量約為85％。
(5)制備目標提取物
再將大孔樹脂(da-201)按照徑高比為1∶10的比例，進行濕法裝玻璃柱b，將合并收集的a水洗脫液泵入玻璃柱b中，進行吸附，吸附完成后，用11倍水洗脫液量的純凈水進行沖洗，去除未吸附的物質，沖洗完成后，然后再用9倍水洗脫液量的體積分數(shù)為65％的乙醇溶液，進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱b乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得目標提取物。
實施例3
一種用于抗病毒的中藥提取物及其制備方法，具體方法步驟如下：
(1)乙醇提取
以野馬追為原料，先將野馬追加入粉碎機中，進行粉碎，再用200目的篩網(wǎng)過篩，然后按照過篩后的野馬追粉的質量(g)∶體積分數(shù)為80％的乙醇溶液的體積(ml)之比為1∶12的比例，在野馬追粉中加入乙醇溶液，攪拌均勻，一同加入回流提取器中，進行第一次回流提取，40分鐘后，過濾，收集第一次提取上清液，再同法進行第二次回流提取，合并第一次、第二次提取上清液，即制備出提取液，備用。
(2)回收乙醇
第(1)步完成后，將第(1)步合并的提取上清液，泵入旋轉蒸發(fā)儀中，減壓回收乙醇至無乙醇味為止，收集去乙醇提取液，用于下一步的處理，回收的乙醇可重復利用。
(3)膜過濾
第(2)步完成后，按照第(2)步收集的去乙醇提取液∶純凈水的體積比為1∶12的比例，在去乙醇提取液中加入純凈水，先利用震蕩器充分混合均勻，再泵入微孔濾膜過濾器中，控制濾膜的孔徑為0.45μm，在0.3mpa的壓力下，進行膜過濾，收集濾過液備用。
(4)聚酰胺樹脂分離
第(3)步完成后，將聚酰胺樹脂按照徑高比為1∶10的比例，進行濕法裝玻璃柱a，裝柱完成后，將第(3)步收集的濾過液泵入玻璃柱a中，同時收集過柱液，收集完成后，再用3倍濾過液量的純凈水進行洗脫，同時收集玻璃柱a水洗液，純凈水洗脫完成后，合并收集的過柱液和水洗液為a水洗脫液，備用。再用8倍濾過液量的體積分數(shù)為80％的乙醇溶液進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱a乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得副產(chǎn)物，副產(chǎn)物總黃酮含量約為89％。
(5)制備目標提取物
再將大孔樹脂(wld-3)按照徑高比為1∶12的比例，進行濕法裝玻璃柱b，將合并收集的a水洗脫液泵入玻璃柱b中，進行吸附，吸附完成后，用12倍水洗脫液量的純凈水進行沖洗，去除未吸附的物質，沖洗完成后，然后再用10倍水洗脫液量的體積分數(shù)為70％的乙醇溶液，進行洗脫，洗脫完成后，收集玻璃柱b乙醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮干燥得目標提取物。
以下僅以上述實施例1作試驗，通過試驗例來驗證本發(fā)明的功效。其中，給藥劑量均以生藥量計。將野馬追目標提取物按照0.1g/ml配置稀釋液，備用。
以下實驗為野馬追目標提取物抗i型單純皰疹病毒的實驗研究。
1、野馬追目標提取物對2bs細胞的毒性測定
采用細胞形態(tài)變化(cpe)法。2bs細胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，100μl/孔，37℃、5％co2培養(yǎng)24h。加入驗證藥物和陽性對照藥物，每濃度接種4孔，每孔100μl。野馬追目標提取物稀釋液倍比稀釋6個濃度。分別為500、250、125、62、31、15μg/ml，陽性對照藥物無環(huán)鳥苷倍比稀釋6個濃度，分別為2000、1000、500、250、125μg/ml。設正常細胞組作為對照。同時置37℃、5％co2培養(yǎng)5～7d。每24h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，記錄細胞破壞情況。以25％以下破壞為(+)，26％～50％破壞為(++)，51％～75％為(+++)，76％～100(++++)。用reed-muench法計算半數(shù)中毒濃度(td50)。
在2bs細胞培養(yǎng)內測定hsv-i病毒半數(shù)感染濃度(tcid50)采用病毒cpe法。2bs細胞以40萬/ml濃度100μl接種于96孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)24h。分別加入hsv-i病毒，10倍稀釋8個濃度，每濃度4孔，每孔100μl。設正常細胞組作為對照，37℃培養(yǎng)5～7d。觀察細胞形態(tài)變化，記錄實驗結果，計算hsv-i的tcid50。
2、野馬追目標提取物在細胞培養(yǎng)內對hsv-i病毒的抑制作用。
采用病毒cpe法進行。2bs細胞以40萬/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)24h。分別加入hsv-i病毒的10～100tcid50的病毒液，每孔100μl，37℃吸附1h，棄掉病毒液，加入野馬追目標提取物稀釋液，選用毒性實驗結果的最大無毒濃度(td0)。藥液250.0～0.5μg/ml，二倍稀釋8個濃度，每濃度4孔，每孔100μl，無環(huán)鳥苷為1000.0～0.5μg/ml二倍稀釋8個濃度。每濃度4孔，每孔100μl。同時設病毒對照和正常細胞對照，37℃、5％co2培養(yǎng)5～7d。每24h倒置顯微鏡下觀察病毒cpe，至病毒對照細胞病變出現(xiàn)“+++～++++”時結束實驗。實驗重復3次，計算藥物半數(shù)有效濃度(ic50)、最小有效濃度(mic)，并根據(jù)公式ti＝td0/mic計算治療指數(shù)ti。
實驗結果如下：野馬追目標提取物稀釋液對細胞的毒性作用，所測的td0為300μg/ml，td50為400μg/ml；無環(huán)鳥苷的td0為900μg/ml，td50為1150μg/ml(均為3次實驗結果的均值)。在2bs細胞培養(yǎng)內測定hsv-i的tcid為1×10-7。ic50為0.78μg/ml，mic為1.35μg/ml，ti為222。無環(huán)鳥苷的ic50為2.4μg/ml，mic為4.9μg/ml，ti為183(數(shù)據(jù)為3批實驗結果的平均值)。
對于藥物的評價需要考慮其藥效與毒力的相對關系，這個相對關系可用ti表示。從以上實驗結果可以看出野馬追的ti值為222，表現(xiàn)出很強的直接殺滅、阻斷感染、抑制hsv-i增殖的作用。其他實施例的實驗具有相當?shù)男Ч?，在此不重復?/p>
最后需要說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制技術方案，盡管申請人參照較佳的實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，那些對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本技術方案的宗旨和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。