本發(fā)明涉及了一種黃酮類化合物及其制備方法，尤其是涉及了一種桑黃抗癌活性黃酮類化合物pbf-3及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

廣泛存在于動(dòng)植物體中的黃酮類化合物有黃酮、黃酮醇等多種類型，不同的黃酮類化合物類型存在于不同的動(dòng)植物種類及部位。天然黃酮類化合物除對(duì)所存在的動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抵御異物侵入起著十分重要作用外，還具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、解熱、保肝等廣泛的藥理作用，并且毒副作用小，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中，深受國(guó)內(nèi)外研究者高度關(guān)注。

桑黃(phellinusbaumii)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥寶庫中一種藥用真菌子實(shí)體，因寄生于桑樹而得名。桑黃具有抗癌、抗炎癥、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝等多種藥理作用，其中抗癌效果最為顯著，有“森林黃金”的美譽(yù)。但桑黃的抗癌機(jī)理還不清楚，這阻害了桑黃藥用水平提高及藥用范圍擴(kuò)大。分離純化制備桑黃抗癌活性成分，對(duì)于推進(jìn)桑黃藥用開發(fā)具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃抗癌活性黃酮類化合物pbf-3及其制備方法與應(yīng)用，是采用回流提取、乙酸乙酯萃取、x-5大孔樹脂柱分離純化的方法，制備桑黃抗癌活性黃酮類化合物pbf-3。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一、一種桑黃抗癌活性黃酮類化合物pbf-3的制備方法：

1)將桑黃子實(shí)體處理獲得桑黃子實(shí)體粉；

2)取桑黃子實(shí)體粉加入乙醇溶液并進(jìn)行超聲處理；

3)超聲處理后的溶液依次進(jìn)行水浴回流和抽濾處理，然后離心處理后收集上清液；

4)上清液濃縮后萃取，再濃縮回收得到粗黃酮類化合物液；

5)用乙醇溶液將粗黃酮類化合物液進(jìn)行稀釋，離心取上清液后，過濾膜再上x-5大孔樹脂柱吸附處理；

6)用乙醇溶液洗脫后收集洗脫峰的洗脫液，冷凍干燥后得到均一的黃酮類化合物組分，取名pbf-3。

所述步驟2)、5)和6)中的乙醇溶液均為含有85％質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇的水溶液。

本發(fā)明方法的工藝條件具體為：

1)桑黃子實(shí)體于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，過80～100目篩，得到桑黃子實(shí)體粉；

2)取桑黃子實(shí)體粉，按w：v為1:40加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液，混勻后，在30℃下用超聲波清洗儀以500w功率53khz頻率的超聲波磁場(chǎng)作用30min；

3)于100℃水浴中回流提取3次，每次1.5～2.0h，集中收集三次的提取液，三次提取液經(jīng)過合并后用抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾處理，棄掉濾渣，將濾液用高速離心機(jī)于10000rpm下離心5min，棄掉沉淀，收集上清液；

4)上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并回收溶劑，得到粗黃酮類化合物液；

5)用分光光度法測(cè)定粗黃酮類化合物液中黃酮類化合物含量，根據(jù)測(cè)定的含量用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液進(jìn)行稀釋，使得黃酮類化合物質(zhì)量濃度調(diào)整為1.3～1.5mg/ml溶液，再將溶液在8000rpm下離心10min，取上清液，過0.45μm濾膜，上x-5大孔樹脂柱吸附，用蒸餾水沖洗直到流出液為無色；

6)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液于1.6～2.0ml/min流速下洗脫，用自動(dòng)收集器收集，根據(jù)分光光度法測(cè)定結(jié)果收集具有黃酮類化合物的洗脫峰的洗脫液，-50℃下真空干燥，得到均一的黃酮類化合物組分pbf-3。

所述步驟4)中的乙酸乙酯體積是濃縮后溶液體積的2倍。

二、由上述方法制備而成的桑黃抗癌活性黃酮類化合物在抗癌中的應(yīng)用。

所述抗癌中的應(yīng)用是針對(duì)人宮頸癌細(xì)胞hela和人胃癌細(xì)胞sgc-7901，具體是抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

本發(fā)明具有的有益效果是：

本發(fā)明分離純化制備的桑黃抗癌活性黃酮類化合物pbf-3，純度均一，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞hela和人胃癌細(xì)胞sgc-7901的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)正常細(xì)胞人胚胎腎細(xì)胞hek293和小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7生長(zhǎng)均無不良影響，可用于抗癌產(chǎn)品的開發(fā)，這對(duì)于提升桑黃藥用價(jià)值，具有積極的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1的pbf-3對(duì)人宮頸癌細(xì)胞hela和人胃癌細(xì)胞sgc-7901生長(zhǎng)的抑制圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施之前，先將桑黃子實(shí)體于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，過80～100目篩，得到桑黃子實(shí)體粉，用于以下各個(gè)實(shí)施例。

本發(fā)明實(shí)施例采用mtt法檢測(cè)pbf-3對(duì)人宮頸癌細(xì)胞hela和人胃癌細(xì)胞sgc-7901的生長(zhǎng)情況，來驗(yàn)證本發(fā)明制備產(chǎn)物是否具有其技術(shù)效果。

實(shí)施例1：

取過80目篩的桑黃子實(shí)體粉，按1：40料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液，混勻后，在30℃下用超聲波清洗儀以500w功率53khz頻率的超聲波磁場(chǎng)作用30min。

于100℃水浴中回流提取3次，提取液用乙酸乙酯，每次1.5h，集中收集三次的提取液，三次提取液經(jīng)過合并后用抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾處理，棄掉濾渣，將濾液用高速離心機(jī)于10000rpm下離心5min，棄掉沉淀，收集上清液。

上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并回收溶劑，得到粗黃酮類化合物液。

用分光光度法測(cè)定粗黃酮類化合物液中黃酮類化合物含量為2.78mg/ml，粗黃酮類化合物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液調(diào)整質(zhì)量濃度為1.5mg/ml，再將溶液在8000rpm下離心10min，取上清液，過0.45μm濾膜，上x-5大孔樹脂柱吸附，用蒸餾水沖洗直到流出液為無色。

再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液于1.8ml/min流速洗脫，自動(dòng)收集器收集，減壓濃縮，用分光光度法測(cè)定，收集具有黃酮類化合物的洗脫峰的洗脫液，-50℃下真空干燥，得到黃酮類化合物pbf-3，pbf-3純度均一。

針對(duì)兩種癌細(xì)胞，本實(shí)施例得到的黃酮類化合物pbf-3分別配成0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml不同濃度(如圖1中，相比常用抗癌藥物氟尿嘧啶5-fu能夠達(dá)到相等的抑制作用)下對(duì)sgc-7901和hela的生長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并增加常用抗癌藥物氟尿嘧啶5-fu作為陽性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，本實(shí)施例得到的黃酮類化合物pbf-3在濃度0.3mg/ml時(shí)對(duì)hela和sgc-7901的抑制率分別為93.85％和95.92％(如圖1所示)，對(duì)正常細(xì)胞人胚胎腎細(xì)胞hek293和小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7生長(zhǎng)無不良影響，相比常用抗癌藥物氟尿嘧啶5-fu能夠達(dá)到相等的抑制作用。

實(shí)施例2：

取過100目篩的桑黃子實(shí)體粉，按1：40料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液，混勻后，在30℃下用超聲波清洗儀以500w功率53khz頻率的超聲波磁場(chǎng)作用30min。

于100℃水浴中回流提取3次，提取液用乙酸乙酯，每次2.0h，集中收集三次的提取液，三次提取液經(jīng)過合并后用抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾處理，棄掉濾渣，將濾液用高速離心機(jī)于10000rpm下離心5min，棄掉沉淀，收集上清液。

上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并回收溶劑，得到粗黃酮類化合物液。

用分光光度法測(cè)定粗黃酮類化合物液中黃酮類化合物含量為2.71mg/ml，粗黃酮類化合物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液調(diào)整質(zhì)量濃度為1.4mg/ml，再將溶液在8000rpm下離心10min，取上清液，過0.45μm濾膜，上x-5大孔樹脂柱吸附，用蒸餾水沖洗直到流出液為無色。

再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液于1.6ml/min流速洗脫，自動(dòng)收集器收集，減壓濃縮，用分光光度法測(cè)定，收集具有黃酮類化合物的洗脫峰的洗脫液，-50℃下真空干燥，得到黃酮類化合物pbf-3。

本實(shí)施例的pbf-3純度均一，在濃度0.3mg/ml時(shí)對(duì)hela和sgc-7901的抑制率分別為94.05％和95.12％(與實(shí)施例1中的圖1相似)，對(duì)正常細(xì)胞人胚胎腎細(xì)胞hek293和小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7生長(zhǎng)均無不良影響，相比常用抗癌藥物氟尿嘧啶5-fu能夠達(dá)到相等的抑制作用。

實(shí)施例3：

取過90目篩的桑黃子實(shí)體粉，按1：40料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液，混勻后，在30℃下用超聲波清洗儀以500w功率53khz頻率的超聲波磁場(chǎng)作用30min。

于100℃水浴中回流提取3次，提取液用乙酸乙酯，每次1.8h，集中收集三次的提取液，三次提取液經(jīng)過合并后用抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾處理，棄掉濾渣，將濾液用高速離心機(jī)于10000rpm下離心5min，棄掉沉淀，收集上清液。

上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙酸乙酯萃取3次，收集并合并三次萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并回收溶劑，得到粗黃酮類化合物液。

用分光光度法測(cè)定粗黃酮類化合物液中黃酮類化合物含量為2.75mg/ml，粗黃酮類化合物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液調(diào)整質(zhì)量濃度為1.3mg/ml，再將溶液在8000rpm下離心10min，取上清液，過0.45μm濾膜，上x-5大孔樹脂柱吸附，用蒸餾水沖洗直到流出液為無色。

再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85％的乙醇溶液于2.0ml/min流速洗脫，自動(dòng)收集器收集，減壓濃縮，用分光光度法測(cè)定，收集具有黃酮類化合物的洗脫峰的洗脫液，-50℃下真空干燥，得到黃酮類化合物pbf-3。

本實(shí)施例的pbf-3純度均一，在濃度0.3mg/ml時(shí)對(duì)hela和sgc-7901的抑制率分別為95.01％和96.02％(與實(shí)施例1中的圖1相似)，對(duì)正常細(xì)胞人胚胎腎細(xì)胞hek293和小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7生長(zhǎng)均無不良影響，相比常用抗癌藥物氟尿嘧啶5-fu能夠達(dá)到相等的抑制作用。