本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及基于外泌體的治療藥物，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體及其在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中，是細胞主動分泌的大小均一，直徑為40-100nm，密度1.10-1.18g/ml的囊泡樣小體。1996年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)b細胞可以通過釋放能表達主要組織相容性復(fù)合體(mhc)分子的外泌體促進t細胞增殖和抑制腫瘤生長。外泌體包含多種蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，表明蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)可以裝載到外泌體上。外泌體可廣泛分布于不同體液，在體內(nèi)有較長的半衰期。此外，外泌體可以穿透細胞膜釋放mrna到靶細胞，使受體細胞翻譯轉(zhuǎn)染的mrna。目前，外泌體已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床治療。

肝癌發(fā)生于肝臟，可分為原發(fā)性肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌。在原發(fā)性肝癌中，肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)最為多見(常簡稱為肝癌)，約占95％，其次是膽管細胞癌(cholangiocarcinoma)。肝癌是全球第五常見的癌癥，亦是我國癌癥中的第二號殺手，全球50％以上的肝癌發(fā)生在我國。罹患肝癌的高危險群以35-65歲的中年人為主，尤其以男性患者較多，比率是女性的2-4倍。高達80％-90％的肝癌患者同時有肝硬化。慢性乙、丙型肝炎病毒是最主要的病因(約80％)，其次是酒精、藥物、攝食含有黃曲毒素的食物等。肝癌是高侵襲性的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，導(dǎo)致大多數(shù)患者就診較晚。

肝癌的治療包括外科手術(shù)治療、放射治療和藥物化療。由于肝癌對放射治療敏感性差，而常規(guī)化療藥物(如阿霉素、氟尿嘧啶、順鉑、干擾素等)的治療不僅毒副作用嚴重，而且通常也不能明顯緩解疾病或延長生命，因此目前肝癌的治療仍以手術(shù)切除為主。但由于肝癌發(fā)病隱匿，早期診斷較困難，腫瘤細胞生長迅速，能進行手術(shù)治療的患者不到30％，而且即使行手術(shù)以后復(fù)發(fā)率也很高，使得肝癌患者的預(yù)后極差。除可切除的小型肝癌患者的5年存活率達到80-90％外，不能手術(shù)肝癌患者自癥狀發(fā)作后的平均存活時間只有3-4個月。

目前，肝癌治療藥物遠未滿足臨床需求，同時這一市場也蘊含著巨大的潛在價值。目前，小分子酪氨酸激酶抑制劑憑借其出色的療效和安全性成為中國肝癌藥物市場的主導(dǎo)藥物。由于全球有超過50％的肝癌發(fā)生在中國，因此，中國的抗肝癌藥物蘊藏著很大的市場潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體及其在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，以用于制備治療肝癌的藥物。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：

一種具有抗肝癌作用的外泌體，由臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體經(jīng)化合物負載制備而成，所述化合物為具有如下通式結(jié)構(gòu)的吡啶并咪唑類有機化合物；

其中，r2為-och2ch3或-oh；

r1為-ch2-或-ch(ch3)2-或-ch2ch2ch2-；

所述負載指將所述化合物導(dǎo)入外泌體內(nèi)。

優(yōu)選地，所述化合物選自下列化合物：

優(yōu)選地，通過電轉(zhuǎn)染法或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將化合物導(dǎo)入外泌體內(nèi)制備化合物負載的外泌體。

上述外泌體在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。

一種藥物制劑，含有上述外泌體和一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體或賦形劑，通過藥學(xué)上可以接受的制劑工藝制備而成。

本發(fā)明的突出優(yōu)點：

實驗結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體體內(nèi)、體外均可以抑制肝癌細胞的增殖，但是抑制作用較弱，但臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體經(jīng)化合物cp1-6負載后，體內(nèi)、體外對肝癌細胞增殖的抑制作用則顯著提高，藥效優(yōu)異，可以用于制備治療肝癌的藥物。

附圖說明

圖1為各組腫瘤細胞增殖抑制率(％)，其中l(wèi)代表低濃度，h代表高濃度；

圖2為cp1-6負載外泌體組和對照組終末移植瘤大小比較；

圖3為cp1-6負載外泌體的體內(nèi)抑瘤率(％)。

具體實施方式

下面就結(jié)合實施例具體介紹本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實驗過程的描述無法做到非常詳細，凡是實驗中未詳細描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。

一、實驗材料

編號cp1-6的吡啶并咪唑類有機化合物均為已知化合物，由本公司合成人員參照文獻和有機合成常規(guī)方法合成，并經(jīng)質(zhì)譜和核磁確證。

dmem/f12培養(yǎng)基、rpmi1640培養(yǎng)基、高糖dmem培養(yǎng)基、α-mem培養(yǎng)基和新生牛血清購自gibco公司；人肝癌smmc-7721由南京醫(yī)科大學(xué)提供。balb/c裸鼠，雄性，4-6周齡，體質(zhì)量18-22g，由南京大學(xué)動物實驗中心提供。

外泌體快速提取試劑(exoquick)購自sbi公司。

二、實驗方法

1、人臍帶間充質(zhì)干細胞分離和鑒定

經(jīng)江蘇省婦幼保健院倫理委員會批準、產(chǎn)婦知情同意后取足月剖宮產(chǎn)臍帶10-15cm，無菌條件下放入盛有pbs溶液的廣口瓶中，4℃冰箱保存。超凈臺紫外線照射30分鐘后，取出臍帶，用含1％青、鏈霉素的pbs液反復(fù)沖洗后去除臍動靜脈及臍帶外膜，用眼科剪將臍帶剪碎至約1mm×1mm×1mm的小塊。將組織塊轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，加入適量0.1％ⅱ型膠原酶，采用酶消化法分離、提取所需細胞。臺盼蘭(0.4％)常溫染色3min后，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細胞，調(diào)整細胞濃度以1×10¹⁰/m²的密度種植于25cm²細胞培養(yǎng)瓶以dmem/f12培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)置于37℃、5％co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后半量換液，72h后全量換液，以后每3-4d換液1次，直至細胞基本鋪滿瓶底后再傳代培養(yǎng)。

2、外泌體(exosomes)的分離和鑒定

收集第4-6代人臍帶mscs培養(yǎng)上清液，按照exoquick試劑盒說明書進行外泌體的提取。具體的步驟如下：將培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移到高速離心管中，在4℃下離心去掉細胞碎片。取上清移到新的高速離心管中，按照細胞上清液：試劑＝2:1的比例加入試劑，使用渦旋儀充分混勻之后，放畳在4℃冰箱中孵育過夜。次日，離心棄去上清，pbs緩沖液重懸即得exosomes懸液，置-20℃冰箱保存。westernblot證實上述exosomes表達外泌體特異標志cd9、cd63和cd81。

3、外泌體負載方法

將編號cp1-6的吡啶并咪唑類有機化合物分別與等質(zhì)量的外泌體混合，通過電轉(zhuǎn)的方法制備化合物負載外泌體。電擊條件為電壓420v，電容150μf，于4mm電轉(zhuǎn)杯進行電轉(zhuǎn)。隨后用倒置離心超濾膜過濾，去除未轉(zhuǎn)染進外泌體內(nèi)的游離化合物。

也可以通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將化合物導(dǎo)入外泌體實現(xiàn)對外泌體的負載。

4、外泌體對人體肝癌細胞smmc-7721的抑制活性(體外活性)

在細胞對數(shù)生長期，將人肝癌smmc-7721細胞懸液調(diào)成5×10⁷cells/l接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，即每孔細胞約為5000個，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱12h后按如下分組方法進行加藥，每孔加入藥物后終體積為150μl/well(不足體積以不含血清rpmi1640培養(yǎng)液補齊)，每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入10μlcck-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標儀檢測吸光度值a(測定波長450nm，參比波長655nm)，計算各組增殖抑制率，該實驗重復(fù)3次。增殖抑制率(％)＝(1-a實驗組/a對照組)×100％。

分組方法如下，其中：純外泌體組和負載外泌體組的濃度均以純外泌體的質(zhì)量和每孔終體積計；對照組為不含血清的rpmi1640培養(yǎng)液。

純外泌體組：低濃度5μg/ml；高濃度20μg/ml；

cp1-6化合物組：低濃度5μg/ml；高濃度20μg/ml；

cp1-6負載外泌體組：低濃度5μg/ml；高濃度20μg/ml。

5、外泌體對裸鼠肝癌移植瘤的抑制活性(體內(nèi)活性)

將實驗裸鼠于獨立通氣籠盒spf條件下適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。1周后在裸鼠腋窩皮下接種0.1ml的smmc-7721細胞懸液(含5×10⁶個對數(shù)生長期的細胞)。當(dāng)腫瘤體積生長至100mm³左右(約12d)的時候開始分組腹腔給藥。分組如下，每組各8只均腹腔注射給藥，連用14d。

對照組：生理鹽水+1％dmso；

cp1-6負載外泌體組：15mg/(kg·d)。

抑瘤率(％)＝(1-負載外泌體組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100％。

6、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，spss13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析分析組間差異的顯著性，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、實驗結(jié)果

1、外泌體對肝癌細胞的體外抑制活性

與對照組比，cp1-6化合物低濃度和高濃度組的細胞增殖均未受明顯抑制(抑制率≤4.1％，p＞0.05)，證明編號cp1-6的化合物本身對肝癌細胞無明顯抑制作用；與對照組比，純外泌體組低濃度和高濃度對smmc-7721細胞增殖具有一定的抑制作用，但抑制率較低；與對照組和純外泌體組比，cp1-6負載外泌體組低濃度和高濃度對smmc-7721細胞增殖具有顯著的抑制作用(p＜0.05)。各組的腫瘤細胞增殖抑制率如圖1所示。

2、外泌體對肝癌移植瘤的體內(nèi)抑制活性

裸鼠皮下接種人肝癌細胞smmc-7721第5天后，在種植部位皮下觸及小結(jié)節(jié)，第12天后腫瘤結(jié)節(jié)增長至約100mm³大小，致瘤成功率為100％。外泌體干預(yù)過程中，各組移植瘤裸鼠沒有出現(xiàn)藥物引起的死亡，干預(yù)前各組移植瘤裸鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，干預(yù)后各組移植瘤裸鼠體質(zhì)量差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比，cp1-6負載外泌體組腫瘤生長速度顯著降低，腫瘤體積顯著減小(p＜0.05)。給藥結(jié)束第二天處死裸鼠，取出移植瘤測定終末體積，圖2和表1為cp1-6負載外泌體組和對照組終末移植瘤大小，圖3為各組抑瘤率(％)。

表1cp1-6負載外泌體組和對照組終末移植瘤體積(cm³)

實驗結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體體內(nèi)、體外均可以抑制肝癌細胞的增殖，但是抑制作用較弱，但臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體經(jīng)化合物cp1-6負載后，體內(nèi)、體外對肝癌細胞增殖的抑制作用則顯著提高，藥效優(yōu)異，可以用于制備治療肝癌的藥物。

上述實施例是對本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，不應(yīng)將本發(fā)明的保護范圍局限于上述具體的實施例。