本發(fā)明屬于納米材料及放射增敏藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種包含多鎢酸釓的納米材料用作增敏劑的用途，尤其涉及一種基于殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米材料用作增敏劑的用途。

背景技術(shù)：

放射治療(rt)作為臨床上治療癌癥最為廣泛的方法之一，其主要原理是利用穿透力非常強(qiáng)的高強(qiáng)度電離輻射(x射線或γ射線)來抑制腫瘤增殖。在放射治療過程中，離子輻射與組織內(nèi)部的水或氧氣發(fā)生作用，產(chǎn)生大量的具有細(xì)胞毒性的活性氧物質(zhì)(ros)來誘導(dǎo)細(xì)胞dna雙鏈產(chǎn)生損傷。因此，為了在放射治療期間增強(qiáng)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，足夠活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生是很有必要的，通過與dna雙鏈發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致dna雙鏈損傷，從而極大地阻止雙鏈已損壞的dna自我修復(fù)。然而，放射治療仍然面臨不能有效根除乏氧腫瘤這一難題。其中關(guān)鍵的困難之一在于細(xì)胞內(nèi)存在大量的還原型谷胱甘肽(gsh)，顯著降低了活性氧物質(zhì)的有效產(chǎn)生并削弱了放射治療效果。而另一個(gè)關(guān)鍵的限制條件是腫瘤在快速增值過程中氧氣的耗盡導(dǎo)致腫瘤局部乏氧，從而導(dǎo)致乏氧細(xì)胞的放射依耐性，增加dna自我修復(fù)的幾率并顯著降低了放射治療作用。并且，在放射治療過程中采用的是高能量電離輻射(x射線或γ射線)，這些高能量輻射可能超過正常細(xì)胞的耐受性，從而導(dǎo)致對(duì)正常組織的不可避免的損傷作用。因此，為了有效地提高放射治療效率并最大程度地增強(qiáng)腫瘤消除，開發(fā)一種可以同時(shí)在腫瘤局部集中吸收大量的輻射劑量和消耗谷胱甘肽，以及通過其他方式有效抑制dna自我修復(fù)來共同增強(qiáng)乏氧腫瘤的放射治療效果，這種通過多種增敏方式達(dá)到良好的治療效果的理想的、新穎的放射增敏系統(tǒng)是非常具有吸引力的。

近年來，大量的研究工作致力于開發(fā)基于傳統(tǒng)的納米藥物的放射敏化劑作為外在的放射增敏方式，比如：基于金屬的納米顆粒、量子點(diǎn)、超順磁氧化鐵以及基于非金屬的納米顆粒等等。為了使輻射集中在腫瘤局部并有效地提高放射治療的治療效果，這些傳統(tǒng)的納米藥物放射增敏劑可以在高能輻射下通過散射出x射線/光子，康普頓電子，正負(fù)電子對(duì)以及俄歇電子等，產(chǎn)生放射化學(xué)(自由基或電離)用于乏氧腫瘤的治療。然而，這些傳統(tǒng)放射增敏劑的腎清除率以及生物可降解性低，導(dǎo)致放射增敏劑在體內(nèi)的長期積累，從而在生物體內(nèi)產(chǎn)生潛在的不可避免的毒副作用。并且，這些放射增敏劑不能夠消除細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽，從而導(dǎo)致ros的產(chǎn)生大大減少。

除了致力于許多外在的敏化方式，近年來許多來自于生物本身性質(zhì)的內(nèi)在的增敏策略也已開展，用于增強(qiáng)乏氧腫瘤的放射治療效果。根據(jù)以前的相關(guān)報(bào)道，乏氧誘導(dǎo)因子-1a(hif-1a)作為乏氧細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在乏氧條件下能夠與多聚聚合酶-1(parp-1)相互作用，被認(rèn)為是一種在腫瘤生長過程中對(duì)乏氧狀態(tài)的主要適應(yīng)性應(yīng)激的強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)劑。與此同時(shí)，以前的相關(guān)研究還證明：降低hif-1a在乏氧細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可以促進(jìn)多聚聚合酶的降解，抑制已損傷的雙鏈dna(dsb)的自我重建，并且可以上調(diào)半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。因此，hif-1asirna已被廣泛應(yīng)用于介導(dǎo)靶向乏氧腫瘤，用于下調(diào)乏氧細(xì)胞內(nèi)hif-1a的表達(dá)，從而克服乏氧腫瘤的放射依耐性并抑制在放射治療過程中已斷裂的雙鏈dna的自我修復(fù)。然而，迄今為止，很少有相關(guān)報(bào)道涉及納米材料是否可以同時(shí)通過外在的增敏方式和內(nèi)在的增敏方式協(xié)同配合使用，以同時(shí)達(dá)到改善放射增敏效果，因而這方面的研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種包含多鎢酸釓的納米材料作為增敏劑的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)多鎢酸釓在作為增敏劑的一個(gè)新的特性，從而實(shí)現(xiàn)外在增敏和內(nèi)在增敏的協(xié)同配合，來改善實(shí)際應(yīng)用中的放射增敏效果。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種包含多鎢酸釓的納米材料作為增敏劑的用途，所述納米材料中的多鎢酸釓與谷胱甘肽發(fā)生氧化還原反應(yīng)，降低谷胱甘肽的含量。

本發(fā)明的包含多鎢酸釓的納米材料中的多鎢酸釓不僅能夠降低谷胱甘肽的水平，還可以很好的實(shí)現(xiàn)放射增敏效果。

本發(fā)明通過向老鼠腫瘤部位采取原位注入方式，然后對(duì)腫瘤進(jìn)行局部x射線照射進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤具有一定的抑制作用。

本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)多鎢酸釓可以與谷胱甘肽(比如人體內(nèi)的)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，降低谷胱甘肽的含量和水平，從而在作為增敏劑用于疾病治療時(shí)，可以通過降低谷胱甘肽在細(xì)胞內(nèi)的水平，從而減少了谷胱甘肽對(duì)活性氧物質(zhì)的消耗，產(chǎn)生更多更有效的活性氧物質(zhì)，使dna雙鏈損傷更為嚴(yán)重，產(chǎn)生內(nèi)在增敏的效果。而且，還可以在x射線的作用下提高射線殺傷作用，達(dá)到外在增敏的效果，從而達(dá)到內(nèi)在增敏和外在增敏的協(xié)同效果。

本發(fā)明所述“包含多鎢酸釓的納米材料”指：可以是多鎢酸釓納米材料，也可以是多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

優(yōu)選地，所述納米材料為多鎢酸釓納米材料。

本發(fā)明中，多鎢酸釓屬于多金屬氧酸鹽中的一種晶體物質(zhì)。

作為本發(fā)明所述包含多鎢酸釓的納米材料的優(yōu)選技術(shù)方案，所述納米材料為多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

優(yōu)選地，所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料包括多鎢酸釓以及修飾多鎢酸釓的修飾物。

優(yōu)選地，所述修飾物包括殼聚糖(chitosan)、脂質(zhì)體或水溶液帶正電荷的高分子聚合物中的任意一種或至少兩種的組合，但并不限于上述列舉的修飾物，其他本領(lǐng)域常用的帶正電的修飾物也可用于本發(fā)明。

優(yōu)選地，所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料包括多鎢酸釓以及修改多鎢酸釓的殼聚糖，而且，多鎢酸釓作為內(nèi)核，具有良好生物相容性和可降解性的生物高分子殼聚糖修飾在多鎢酸釓的外層。

作為本發(fā)明所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料的優(yōu)選技術(shù)方案，所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料中還包含帶負(fù)電的物質(zhì)，所述帶負(fù)電的物質(zhì)優(yōu)選為小干擾rna(smallinterferingrna，sirna)，進(jìn)一步優(yōu)選為乏氧誘導(dǎo)因子-1α(簡稱hif-1α)表達(dá)的小干擾rna。

本發(fā)明中，將乏氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的小干擾rna簡稱為hif-1αsirna。

本發(fā)明中的小干擾rna是一種可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的小干擾rna。本發(fā)明中的hif-1αsirna主要針對(duì)乏氧腫瘤細(xì)胞內(nèi)乏氧誘導(dǎo)因子1α(hif-1α)的調(diào)節(jié)，可下調(diào)hif-1α在乏氧細(xì)胞中的表達(dá)。

優(yōu)選地，所述小干擾rna負(fù)載在修飾有殼聚糖的多鎢酸釓的表面。

優(yōu)選地，所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料的粒徑為30nm～40nm，例如30nm、33nm、35nm、36nm、38nm或40nm等。

優(yōu)選地，所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料的水合粒徑為40nm～60nm，例如40nm、42nm、43nm、45nm、48nm、50nm、51nm、53nm、55nm、58nm或60nm等。

優(yōu)選地，由多鎢酸釓和殼聚糖構(gòu)成的多鎢酸釓復(fù)合納米材料的水體系的電勢(shì)為+30mv～+60mv，例如+30mv、+32mv、+34mv、+35mv、+37mv、+38mv、+39mv、+41mv、+43mv、+45mv、+47mv、+50mv、+53mv、+55mv、+58mv或+60mv等。

優(yōu)選地，由多鎢酸釓、殼聚糖和小干擾rna構(gòu)成的多鎢酸釓復(fù)合納米材料的水體系的電勢(shì)為+10mv～+30mv，例如+10mv、+12mv、+14mv、+15mv、+17mv、+18mv、+20mv、+22mv、+23mv、+25mv、+27mv、+28mv或+30mv等。

優(yōu)選地，所述殼聚糖的平均分子量為100kd～300kd(即100000-300000)，例如100kd,120kd,150kd,180kd,200kd,210kd,220kd,250kd,255kd,260kd,270kd,280kd或300kd等，考慮殼聚糖與多鎢酸釓晶體復(fù)合之后得到的復(fù)合材料納米尺寸的問題，優(yōu)選平均分子量為100kd-200kd，這樣合成出來的復(fù)合的納米材料尺寸不至于特別大而導(dǎo)致難以被細(xì)胞攝取的問題。

本發(fā)明進(jìn)一步向復(fù)合材料中引入小干擾rna后，再對(duì)老鼠腫瘤部位進(jìn)行x射線照射，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長抑制得更為明顯，而且腫瘤沒有發(fā)生復(fù)發(fā)現(xiàn)象，說明與單一的放射治療或者單一的基因治療相比，引入rna之后得到的復(fù)合材料作為放射增敏劑能夠達(dá)到更加優(yōu)良的放射治療與基因治療的協(xié)同治療效果。

本發(fā)明還提供了如上所述的多鎢酸釓復(fù)合納米材料的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)利用離子凝膠法，使多鎢酸釓和殼聚糖反應(yīng)，制備得到殼聚糖修飾的多鎢酸釓，即由多鎢酸釓和殼聚糖構(gòu)成的多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

本發(fā)明中，使用多鎢酸釓和殼聚糖發(fā)生離子凝膠反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)復(fù)合，從而得到納米級(jí)別的多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

優(yōu)選地，步驟(1)制備殼聚糖修飾的多鎢酸釓的過程為：

(a)將殼聚糖溶解在醋酸中，得到殼聚糖的醋酸溶液；

(b)使用多鎢酸釓晶體和水，配制多鎢酸釓的水溶液；

(c)將多鎢酸釓的水溶液與殼聚糖的醋酸溶液混合，形成懸浮液，除雜，得到殼聚糖修飾的多鎢酸釓。

優(yōu)選地，步驟(a)所述醋酸的質(zhì)量濃度為0.1％～5％，例如0.1％、0.5％、0.8％、1.0％、1.3％、1.6％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.7％、3.0％、3.2％、3.5％、3.7％、3.9％、4.2％、4.4％、4.7％或5.0％等，為了使殼聚糖完全溶解并且不至于醋酸太過量，優(yōu)選0.1％～3％。

優(yōu)選地，步驟(c)所述殼聚糖的醋酸溶液中的殼聚糖與多鎢酸釓的水溶液中的多鎢酸釓的質(zhì)量比為5～20，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等，為了為了使殼聚糖修飾的多鎢酸釓能夠形成形貌均一、尺寸大小合適的復(fù)合納米材料，利于細(xì)胞的攝取，該質(zhì)量比優(yōu)選為7～15。

優(yōu)選地，步驟(c)所述混合的過程為：將多鎢酸釓的水溶液滴加到殼聚糖的醋酸溶液中。

優(yōu)選地，步驟(c)所述混合的過程中伴有攪拌。

優(yōu)選地，步驟(c)所述除雜的過程為：對(duì)懸浮液進(jìn)行離心，然后將離心產(chǎn)物分散到超純水中，于透析袋中進(jìn)行透析。

優(yōu)選地，所述離心的轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心的時(shí)間優(yōu)選為30min。

優(yōu)選地，所述透析袋的分子量為2.0dka，透析的時(shí)間優(yōu)選為1天。

作為本發(fā)明所述方法的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(b)所述多鎢酸釓晶體通過簡單環(huán)保的重結(jié)晶法合成，更優(yōu)選通過如下方法制備得到：

ⅰ.將鎢酸鹽溶于超純水中形成均勻透明的水溶液a；

ⅱ.在攪拌的作用下，用酸性化合物調(diào)節(jié)上述水溶液a的ph值為6.50～8.50，得到溶液b；

ⅲ.在攪拌作用下，將釓鹽水溶液加入上述溶液b中形成水溶液c；

ⅳ.對(duì)上述水溶液c加熱，攪拌，直至得到均勻透明的水溶液d；

ⅴ.最后冷卻，待析出多鎢酸釓晶體。

此優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟ⅱ和步驟ⅲ的攪拌獨(dú)立地可以是磁力攪拌。

此優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟ⅱ和步驟ⅲ的攪拌都在室溫(15℃～35)下進(jìn)行。

本發(fā)明提供了采用經(jīng)典的簡單環(huán)保的重結(jié)晶方法合成多鎢酸釓的方法，通過該方法制備得到的多鎢酸釓溶液中不僅含有鎢酸鈉(na2wo4·2h2o)，還含有少量的nacl，優(yōu)選地，可以通過再一次重結(jié)晶方法獲得更純更大的多鎢酸釓晶體。

優(yōu)選地，步驟ⅰ所述鎢酸鹽為鎢酸鈉。

優(yōu)選地，所述鎢酸鈉的化學(xué)組成為na2wo4·2h2o。

優(yōu)選地，步驟ⅰ所述水溶液a中的鎢酸鹽的濃度為300mg/ml～500mg/ml，例如：300mg/ml、310mg/ml、320mg/ml、330mg/ml、350mg/ml、370mg/ml、390mg/ml、410mg/ml、430mg/ml、450mg/ml、480mg/ml或500mg/ml等。

優(yōu)選地，步驟ⅱ所述酸性化合物包括鹽酸、醋酸和硝酸等，優(yōu)選為冰醋酸。

此優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟ⅱ調(diào)節(jié)水溶液a的ph值為6.50-8.50，例如6.50、6.55、6.60、6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15、7.20、7.25、7.30、7.35、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65、7.70、7.75、7.80、7.85、7.90、7.95、8.00、8.05、8.10、8.15、8.20、8.25、8.30、8.35、8.40、8.45或8.50等。

優(yōu)選地，步驟ⅲ所述釓鹽水溶液中的釓鹽為氯化釓。

優(yōu)選地，所述氯化釓的化學(xué)組成為gdcl6·6h2o。

優(yōu)選地，步驟ⅲ所述釓鹽水溶液中的釓鹽的濃度為300g/mol～600g/mol，例如300g/mol、320g/mol、330g/mol、350g/mol、360g/mol、380g/mol、400g/mol、420g/mol、440g/mol、460g/mol、490g/mol、510g/mol、530g/mol、550g/mol、570g/mol、590g/mol或600g/mol等。

優(yōu)選地，步驟ⅳ所述加熱的溫度為70℃～90℃，例如70℃、72℃、75℃、77℃、79℃、80℃、82℃、84℃、85℃、87℃或90℃等。

作為本發(fā)明所述方法的優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法還包括在步驟(1)得到殼聚糖修飾的多鎢酸釓之后，進(jìn)行如下步驟(2)：

利用正負(fù)電荷相互作用，將帶負(fù)電的物質(zhì)負(fù)載在殼聚糖修飾的多鎢酸釓的表面，從而得到由多鎢酸釓、殼聚糖和帶負(fù)電的物質(zhì)構(gòu)成的多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

作為本發(fā)明所述方法的優(yōu)選技術(shù)方案，所述帶負(fù)電的物質(zhì)包括小干擾rna，優(yōu)選為乏氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的小干擾rna。本發(fā)明中的小干擾rna是一種可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的小干擾rna。本發(fā)明中的hif-1αsirna主要針對(duì)乏氧腫瘤細(xì)胞內(nèi)乏氧誘導(dǎo)因子1α(hif-1α)的調(diào)節(jié)，可下調(diào)hif-1α在乏氧細(xì)胞中的表達(dá)。

優(yōu)選地，步驟(2)所述負(fù)載的過程為：配制殼聚糖修飾的多鎢酸釓的水溶液，然后與帶負(fù)電的物質(zhì)混合，震蕩，然后靜置。

本發(fā)明的殼聚糖修飾的多鎢酸釓的表面能夠負(fù)載大量帶負(fù)電的物質(zhì)(比如帶負(fù)電的小干擾rna)，所述殼聚糖修飾的多鎢酸釓的水溶液中的殼聚糖修飾的多鎢酸釓與帶負(fù)電的物質(zhì)的質(zhì)量比優(yōu)選為0.1～500，例如0.1、1、10、30、50、80、100、120、150、180、210、230、240、260、280、300、310、330、350、370、390、400、420、450、460、480、490或500等。

優(yōu)選地，所述殼聚糖修飾的多鎢酸釓的水溶液中的殼聚糖修飾的多鎢酸釓與小干擾rna的質(zhì)量比優(yōu)選為0.1～500，為了使帶負(fù)電荷的小干擾rna能夠全部載上，并成功釋放，該質(zhì)量比優(yōu)選為0.1～300，進(jìn)一步優(yōu)選為1～210。

優(yōu)選地，殼聚糖修飾的多鎢酸釓的水溶液與帶負(fù)電的物質(zhì)混合的過程在無核酸酶水溶液中進(jìn)行。

作為本發(fā)明所述方法的更進(jìn)一步優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法包括以下步驟：

(1)制備多鎢酸釓晶體：

ⅰ.將na2wo4·2h2o溶于超純水中形成均勻透明的水溶液a；

ⅱ.在15℃～35℃磁力攪拌的作用下，用冰醋酸調(diào)節(jié)上述水溶液a的ph值為6.50-8.50，得到溶液b；

ⅲ.在15℃～35℃磁力攪拌作用下，將gdcl6·6h2o水溶液加入上述溶液b中形成水溶液c；

ⅴ.最后冷卻，待析出多鎢酸釓晶體；

(2)制備殼聚糖修飾的多鎢酸釓：

(a)將殼聚糖溶解在冰醋酸中，得到殼聚糖的冰醋酸溶液；

(b)使用步驟(1)得到的多鎢酸釓晶體和水，配制多鎢酸釓的水溶液；

(c)將多鎢酸釓的水溶液與殼聚糖的冰醋酸溶液混合，形成懸浮液，然后將懸浮液在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心30min，再將離心產(chǎn)物置于分子量為2.0dka的透析袋中透析1天，得到殼聚糖修飾的多鎢酸釓；

(3)將小干擾rna與殼聚糖修飾的多鎢酸釓的水溶液在無核酸酶水溶液中混合均勻，震蕩，然后在15℃～35℃的溫度下靜置30min，得到多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

本發(fā)明還提供了如上所述的包含多鎢酸釓的納米材料作為載體的用途。

本發(fā)明還提供了如上所述的包含多鎢酸釓的納米材料用于腫瘤治療的用途。

更進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了如上所述的多鎢酸釓復(fù)合納米材料作為放射增敏劑在腫瘤放射治療與基因治療的協(xié)同治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明的多鎢酸釓復(fù)合納米材料具有腫瘤多模式成像(mri/ct)及作為放射增敏劑的放射治療、基因治療的功能，并且這些功能能夠?qū)崿F(xiàn)協(xié)同治療效果。

本發(fā)明所述的“增敏劑”，又稱為放射增敏劑或放射增敏藥物。

與現(xiàn)存的放射增敏劑相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)在本發(fā)明中，包含多鎢酸釓的納米材料中，一方面，多鎢酸釓能夠吸收大量的高能量x射線產(chǎn)生俄歇電子或康普頓電子，利用這些電子可以與有機(jī)體環(huán)境(如生物體細(xì)胞)中的水或氧氣反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)(ros)，從而對(duì)細(xì)胞dna雙鏈產(chǎn)生損傷作用，達(dá)到放射治療的效果；另一方面，多鎢酸釓還能夠和細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽發(fā)生氧化還原反應(yīng)，降低谷胱甘肽在細(xì)胞內(nèi)的含量水平，從而減少了谷胱甘肽對(duì)活性氧物質(zhì)的消耗，產(chǎn)生更多更有效的活性氧物質(zhì)，使dna雙鏈損傷更為嚴(yán)重，達(dá)到增強(qiáng)的放射治療效果。

(2)本發(fā)明進(jìn)一步采用殼聚糖對(duì)多鎢酸釓進(jìn)行修飾，并負(fù)載小干擾rna，可以通過介導(dǎo)小干擾rna進(jìn)入腫瘤部位，使乏氧腫瘤細(xì)胞內(nèi)hif-1α的表達(dá)降低，因此阻止了雙鏈損傷的dna的自我修復(fù)，最終達(dá)到多鎢酸釓放射治療效果、多鎢酸釓基因治療效果以及降低細(xì)胞內(nèi)hif-1α表達(dá)這三方面作用協(xié)同治療的作用，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)在增敏和外在增敏的同時(shí)增敏作用，達(dá)到非常好的放射治療效果。

(3)在本發(fā)明中，利用高分子化合物殼聚糖修飾在多鎢酸釓晶體表面，一方面可以形成形貌均一的基于多鎢酸釓復(fù)合納米材料同時(shí)提高材料的生物相容性，另一方面使用殼聚糖修飾多鎢酸釓形成的復(fù)合納米載體的表面帶有非常多的正電荷，有利于帶負(fù)電荷的小干擾rna的負(fù)載，成功實(shí)現(xiàn)小干擾rna在乏氧腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染和釋放。

(4)在本發(fā)明中，所采用的高分子化合物殼聚糖是一種高分子化合物，具有很好的生物可降解性，可以在體內(nèi)發(fā)生降解，減少對(duì)生物體的毒副作用，并且降解之后剩余的多鎢酸釓晶體尺寸非常小，可以很快通過腎臟排出體外，從而減少了納米材料長期蓄積在生物體內(nèi)所帶來的潛在的毒副作用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為實(shí)施例1步驟2)的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的掃描電鏡圖；

圖3為實(shí)施例1步驟2)的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的透射電鏡圖；

圖4為實(shí)施例1步驟2)的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的x射線能譜圖；

圖5為實(shí)施例1步驟2)的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的紅外光譜圖，其中g(shù)dw10@cs表示殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體；

圖6為實(shí)施例1的殼聚糖、多鎢酸釓晶體以及殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的熱重分析圖，其中，cs代表殼聚糖；gdw10代表多鎢酸釓晶體；gdw10@cs代表殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體；

圖7為實(shí)施例1制備得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體負(fù)載小干擾rna前后的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，sirna代表小干擾rna；gdw10@cs-sirna代表負(fù)載之后的產(chǎn)品，且復(fù)合納米載體與小干擾rna的質(zhì)量比分別為1:5、1:10、1:20、1:40、1:50和1:100；

圖8為空白、x射線、多鎢酸釓gdw10、多鎢酸釓加x射線、多鎢酸釓加x射線和谷胱甘肽在x射線照射下的熒光增強(qiáng)圖對(duì)比圖，其中g(shù)sh代表谷胱甘肽，gdw10代表多鎢酸釓晶體；

圖9為單純過氧化氫、單純多鎢酸釓、單純x射線、多鎢酸釓加x射線對(duì)谷胱甘肽含量的影響圖，其中g(shù)sh代表谷胱甘肽，gdw10代表多鎢酸釓晶體；

圖10為不同濃度的實(shí)施例1制備得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體對(duì)乏氧條件下人源肝癌細(xì)胞bel-7402細(xì)胞活力的影響圖，濃度分別為0，6.25μ

g/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml；

圖11a為不加入放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料的對(duì)照組的乏氧bel-7402細(xì)胞的殺傷效果圖；圖11b為加入實(shí)施例1的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料聯(lián)合放療、基因治療處理組對(duì)乏氧bel-7402細(xì)胞的殺傷效果圖；

圖12a-圖12f為對(duì)帶有bel-7402腫瘤的裸鼠瘤內(nèi)注入不同種處理后聯(lián)合放療和基因治療的抑瘤情況結(jié)果圖，其中圖12a-圖12f依次分別代表i-vi組，且i對(duì)應(yīng)pbs緩沖溶液；ii對(duì)應(yīng)殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體；iii對(duì)應(yīng)x射線；iv對(duì)應(yīng)放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料；v對(duì)應(yīng)殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體加x射線；vi對(duì)應(yīng)放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料加x射線；

圖13a和圖13b為不加入放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料的對(duì)照組的老鼠肝臟在不同倍率的病理切片圖，圖13a中的兩個(gè)箭頭表示轉(zhuǎn)移至肝臟的癌細(xì)胞，圖13b中的標(biāo)注虛線圈表示轉(zhuǎn)移至肺部的癌細(xì)胞；

圖13c和圖13d為采取實(shí)施例1的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料與放療處理之后的老鼠的肝臟在不同倍率的病理切片圖；

圖14為使用不同濃度的實(shí)施例1中得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體進(jìn)行測試得到的磁共振成像和計(jì)算機(jī)斷層掃描雙模式成像圖，濃度分別為0，6.25mg/ml，12.5mg/ml，25mg/ml和50mg/ml。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

本發(fā)明中測定所述的殼聚糖修飾的多鎢酸釓負(fù)載小干擾rna的能力，所采用的測定方法為大家熟知的瓊脂糖凝膠電泳法。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種多鎢酸釓復(fù)合納米材料，所述多鎢酸釓復(fù)合納米材料由多鎢酸釓、殼聚糖以及小干擾rna構(gòu)成。

制備方法：

1)多鎢酸釓晶體(命名為gdw10)的合成

在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)過程中，首先稱取8.3gna2wo4·2h2o溶于20ml超純水中形成均勻透明的水溶液，隨后在磁力攪拌的作用下，將乙酸慢慢滴入上述溶液中，將上述溶液ph值調(diào)節(jié)至7.40-7.50。然后在室溫和磁力攪拌的作用下，將2ml濃度為477.95gmol^-1的gdcl6·6h2o逐滴加入上述溶液，然后將整個(gè)溶液體系置于加熱臺(tái)上加熱至85℃，待溶液徹底變?yōu)槌吻逋该髦?，使之冷卻至室溫，隨后晶體析出。為了使得到的多鎢酸釓晶體純度更大，采取再一次重結(jié)晶方法，棄去上清液，將析出的晶體重新溶解在等體積的超純水中，加熱至完全溶解，形成澄清透明的水溶液，然后使之冷卻至室溫，待晶體再一次析出。

2)高分子化合物殼聚糖修飾的多鎢酸釓的制備

首先，將殼聚糖(chitosan，簡稱為cs)溶解在1wt％的醋酸溶液中以形成質(zhì)量濃度為1％的殼聚糖的醋酸溶液，隨后稱取上述制備得到的多鎢酸釓晶體10mg溶解在10ml超純水中，形成濃度為1mg/ml的多鎢酸釓水溶液。然后在室溫持續(xù)的磁力攪拌作用下，將多鎢酸釓水溶液逐滴加入至殼聚糖的醋酸溶液中，以形成穩(wěn)定的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體(命名為gdw10@cs)懸浮液。其中，加入殼聚糖與多鎢酸釓的物質(zhì)的量之比為10。隨后，為了獲得純度更高的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體，將形成的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體以轉(zhuǎn)速為12000rpm離心30min，以除去未反應(yīng)的游離的殼聚糖水溶液。最后將得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體重新分散在超純水中，置于分子量為2.0dka的透析袋在超純水中透析1天，以除去雜質(zhì)離子，最后置于4℃冰箱中待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

制備得到的高分子化合物殼聚糖修飾的多鎢酸釓可以作為載體。

得到的高分子化合物殼聚糖修飾的多鎢酸釓也可以稱作“殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體”。

3)多鎢酸釓復(fù)合納米材料的制備

為了得到由多鎢酸釓、殼聚糖和小干擾rna構(gòu)成的多鎢酸釓復(fù)合納米材料(命名為gdw10@cssirna)，首先按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的hif-1αsirna量和不同濃度的gdw10水溶液在無核酸酶水溶液中混合均勻，充分震蕩之后，在室溫下靜置30分鐘形成放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料。

得到的多鎢酸釓復(fù)合納米材料由多鎢酸釓、殼聚糖和小干擾rna構(gòu)成。

得到的多鎢酸釓復(fù)合納米材料可以作為放射增敏劑。

得到的多鎢酸釓復(fù)合納米材料也可以稱作“放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料”。

本實(shí)施例中得到的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，包括多鎢酸釓和殼聚糖，以及殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米材料表面負(fù)載的小干擾rna。

利用掃描電子顯微鏡(hitachihigh_technologies,japan,s-4800)對(duì)本實(shí)施例步驟2)得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體是形貌均一呈球形的納米顆粒。

利用透射電子顯微鏡(feitecnaig2f20)對(duì)本實(shí)施例步驟2)得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體形貌均一且粒徑處在30-40nm之間。

利用x射線能譜(hitachihigh_technologies,japan,s-4800)對(duì)本實(shí)施例步驟2)得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體進(jìn)行表征，結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體中含有大量的c、n、w、o、gd元素，說明殼聚糖成功修飾在多鎢酸釓化合物上。

利用紅外譜儀(nicoletin10,thermofisher)對(duì)本實(shí)施例步驟2)得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體進(jìn)行表征，結(jié)果如圖5所示，1639cm^-1和1423cm^-1是殼聚糖的特征吸收峰；1076cm^-1、931cm^-1、842cm^-1和783cm^-1是多鎢酸釓的特征吸收峰，可以看出殼聚糖和多鎢酸釓的特征峰都出現(xiàn)在殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體紅外譜圖中。

由此可以得出，制備的高分子化合物殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體包括高分子化合物殼聚糖和多鎢酸釓晶體。

利用熱重分析儀(perkin,elmer,diamondtg/dta)對(duì)本實(shí)施例的殼聚糖、多鎢酸釓晶體以及步驟2)得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體進(jìn)行表征，結(jié)果如圖6所示，高分子化合物殼聚糖占整個(gè)殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.3％，多鎢酸釓占整個(gè)殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.7％。

殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的負(fù)載小干擾rna能力評(píng)價(jià)：

本實(shí)施例步驟3)可以說明高分子化合物殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體可以通過正負(fù)電荷相互作用成功負(fù)載小干擾rna，通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)可以判斷復(fù)合納米載體負(fù)載小干擾rna的負(fù)載能力。

更具體地說明，為了負(fù)載小干擾rna，將實(shí)施例1中得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體與小干擾rna復(fù)合(其中兩者的質(zhì)量比為100,50,40,20,10,5)，得到的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料在振蕩器上輕輕震蕩均勻，在室溫下靜置15分鐘。為了評(píng)估小干擾rna從放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料上釋放下來的能力，加入肝素與放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料在室溫下共孵育20分鐘，其中肝素與小干擾rna的物質(zhì)的量之比為5:1。此外，為了測定殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體對(duì)小干擾rna的保護(hù)作用，加入2μlrna酶(rnase,1μg/μl)與放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料在37℃下孵育1小時(shí)，以降解掉1μg的小干擾rna。其中，游離的小干擾rna作為空白對(duì)照。最后，小干擾rna負(fù)載量、釋放量以及殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體對(duì)小干擾rna的保護(hù)能力均是通過1％瓊脂糖凝膠電泳在120v電壓下進(jìn)行15分鐘檢測出來。

利用瓊脂糖凝膠電泳儀(c300,usa,azurebiosystems)對(duì)實(shí)施例1得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體負(fù)載小干擾rna的能力進(jìn)行表征，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)復(fù)合納米載體與小干擾rna的質(zhì)量比為50:1時(shí)，小干擾rna全部成功負(fù)載在復(fù)合納米載體上，達(dá)到很好的負(fù)載效果。

增敏效果評(píng)價(jià)：

本實(shí)施例說明多鎢酸釓在x射線照射下可以產(chǎn)生放射增敏效果，并且谷胱甘肽可以清除活性氧物質(zhì)。

具體檢測過程為：首先，0.5ml溶于dmso的dcfh-da與2.0ml濃度為0.01m的naoh在室溫下避光發(fā)生水解反應(yīng)，最終生成探針dcfh。待反應(yīng)30分鐘之后，10mlpbs(25mm,ph7.2)加入上述反應(yīng)體系中，以終止反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。隨后在形成的dcfh水溶液外側(cè)覆蓋一層錫箔紙并置于冰塊上用于后續(xù)的檢測實(shí)驗(yàn)。緊接著，在沒有或有g(shù)sh(1mm)存在的條件下，將實(shí)施例1中得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體(0.10mg/ml)與上述生成的dcfh水溶液(10μm)混合，然后立即用x-ray照射10分鐘。待照射完之后，立即將溶液置于熒光光譜儀下測定樣品的熒光光譜，用于檢測各個(gè)樣品ros產(chǎn)生。

利用熒光光譜儀(jobinyvonfluorolog3，horiba，japan)對(duì)本實(shí)施例中各個(gè)樣品(空白、x射線、多鎢酸釓gdw10、多鎢酸釓加x射線、多鎢酸釓加x射線和谷胱甘肽)在探針530nm特征吸收峰處的熒光強(qiáng)度的測定，如圖8所示，空白對(duì)照或探針在x射線照射下熒光強(qiáng)度很低，但是多鎢酸釓在x射線照射下熒光強(qiáng)度迅速上升到很大值，一旦加入谷胱甘肽之后(gsh)，熒光強(qiáng)度又降低，說明多鎢酸釓在x射線照射下可以產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，達(dá)到放射增敏效果，并且谷胱甘肽具有清除活性氧物質(zhì)的能力。

本實(shí)施例說明多鎢酸釓可以與谷胱甘肽發(fā)生氧化還原反應(yīng)，降低谷胱甘肽的水平，從而實(shí)現(xiàn)更多有效的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生。

將殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體溶解在碳酸鹽緩沖溶液中(pbs,ph8.6,50mm)，配成濃度為100μg/ml，然后將此濃度的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體溶液與谷胱甘肽水溶液(0.8mm)按體積比為1:1置于離心管中進(jìn)行氧化反應(yīng)，同時(shí)在離心管外壁覆蓋一層錫箔紙，阻止外界可見光對(duì)反應(yīng)的干擾。隨后，將此混合體系置于搖床上，在室溫下以150rpm的轉(zhuǎn)速搖4小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束之后，分別向反應(yīng)體系中加入785μltris-hcl(0.05m)和15μldtnb(100mm)，繼續(xù)以相同速度搖5分鐘。最后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于酶標(biāo)儀下，測定412nm處樣品的紫外吸收。其中，pbs(ph8.6,50mm)和純h2o2(1.0mm)分別作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

利用熒光倒置顯微鏡(olympus,ix71，japan)在探針的412nm特征吸收峰處測定樣品的紫外吸收，檢測單純過氧化氫、單純多鎢酸釓、單純x射線、多鎢酸釓加x射線對(duì)谷胱甘肽含量的影響圖，如圖9所示，陰性對(duì)照純谷胱甘肽在412nm處具有很強(qiáng)的吸收，陽性對(duì)照過氧化氫將谷胱甘肽全部反應(yīng)掉，在412nm處幾乎無吸收，但是谷胱甘肽在加入多鎢酸釓之后，測定結(jié)果顯示谷胱甘肽的含量就降低，說明多鎢酸釓可以與谷胱甘肽發(fā)生氧化還原反應(yīng)，降低谷胱甘肽的水平，從而減少谷胱甘肽清除活性氧物質(zhì)的機(jī)會(huì)。

對(duì)乏氧條件下人源肝癌細(xì)胞bel-7402細(xì)胞活力影響的評(píng)價(jià)：

以下實(shí)例用于說明實(shí)施例1中得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體對(duì)乏氧條件下人源肝癌細(xì)胞bel-7402細(xì)胞活力的影響。

(1)bel-7402乏氧細(xì)胞的培養(yǎng)

首先，將bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基dmem中，放置在37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

(2)細(xì)胞活力的測定

待細(xì)胞生長至一定數(shù)量之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中繼續(xù)孵育24小時(shí)，其中細(xì)胞密度為4×10³/孔。待細(xì)胞基本鋪滿整個(gè)孔板之后，將含有不同濃度的從實(shí)施例1中得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體(6.25,12.5,25.0,50.0,100μg/ml)的分散在含有100μm模擬乏氧環(huán)境的cocl2新鮮培養(yǎng)基中。待共孵育24小時(shí)后，10μl新鮮的cck-8加入每個(gè)孔繼續(xù)共孵育1小時(shí)，最后將96孔板置于酶標(biāo)儀下，在450nm處測定每個(gè)孔細(xì)胞的吸光度，根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算公式計(jì)算出不同濃度條件下細(xì)胞的存活率。

利用酶標(biāo)儀(thermoscientific,multiscanmnk3)測定不同濃度的實(shí)施例1中得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體對(duì)乏氧條件下人源肝癌細(xì)胞bel-7402細(xì)胞活力的影響，如圖10所示，當(dāng)復(fù)合納米載體濃度高達(dá)100μg/ml時(shí)，細(xì)胞的存活率還大于90％，說明得到的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體對(duì)乏氧條件下人源肝癌細(xì)胞bel-7402不會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，可以進(jìn)一步應(yīng)用于抗腫瘤效果的評(píng)估。

對(duì)乏氧腫瘤細(xì)胞中具有放射治療和基因治療的協(xié)同治療效果的評(píng)價(jià)：

以下實(shí)例用于說明實(shí)施例1中放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料在乏氧腫瘤細(xì)胞中具有放射治療和基因治療的協(xié)同治療效果。

(1)bel-7402乏氧細(xì)胞的培養(yǎng)

首先，將bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基dmem中，放置在37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

(2)協(xié)同治療效果的評(píng)估

為了克隆實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞數(shù)目為2000的bel-7402細(xì)胞分散在含有100μm模擬乏氧環(huán)境的cocl2培養(yǎng)基中，然后將懸浮細(xì)胞在24孔板中孵育48小時(shí)。待貼壁之后，對(duì)細(xì)胞用放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料與x射線同時(shí)處理。其中，空白對(duì)照組其他條件一樣，只是不加入放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料，待兩種方法處理完之后，將細(xì)胞繼續(xù)孵育10天，然后用吉姆薩染液進(jìn)行染色，最后通過對(duì)形成的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測定，評(píng)估兩種方法各自對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用。如圖11a和圖11b所示，當(dāng)采用放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料與x射線同時(shí)處理細(xì)胞之后，細(xì)胞的存活率(圖11b圖)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組(圖11a圖)，說明放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料對(duì)乏氧條件下人源肝癌細(xì)胞bel-7402會(huì)產(chǎn)生明顯的放射治療與基因治療的協(xié)同治療效果。

對(duì)在活體腫瘤模型中具有放射治療和基因治療的協(xié)同治療效果的評(píng)價(jià)：

本實(shí)例用于說明實(shí)施例1中的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料在活體腫瘤模型中具有放射治療和基因治療的協(xié)同治療效果。

(1)腫瘤模型的構(gòu)建

首先，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買30只balb/c裸鼠，然后在老鼠皮下植入100μl含有細(xì)胞密度為1.0×10⁶的bel-7402細(xì)胞懸液。10天之后，待老鼠的腫瘤體積大小達(dá)到約100mm³時(shí)，將這些老鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行隨機(jī)分配。

(2)在活體腫瘤模型中評(píng)估協(xié)同治療效果

將帶有腫瘤的裸鼠隨機(jī)分配為6個(gè)小組：其中，(i)pbs緩沖溶液組(pbs)；(ii)單獨(dú)殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體(gdw10@cs)；(iii)單獨(dú)x射線組(x-ray)；(iv)放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料(gdw10@cssirna)；(v)復(fù)合納米材料與x射線組(gdw10@cs+rt)；(vi)放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料與x射線組(gdw10@cssirna+rt)。分別對(duì)i組帶有bel-7402腫瘤的荷瘤鼠，向瘤內(nèi)注入20μlpbs溶液；對(duì)于ii和v組老鼠，向瘤內(nèi)注入20μl殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體水溶液；對(duì)于iv和vi組老鼠，向瘤內(nèi)注入20μl放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料水溶液。注入之后，對(duì)i,v和vi組的帶有bel-7402腫瘤的荷瘤鼠，采用x-ray(10gy)照射10分鐘。同時(shí)，為了保證hif-1αsirna在腫瘤內(nèi)部的活性，以確保達(dá)到更高的治療效果，每隔2-3天向老鼠體內(nèi)重新注入新鮮準(zhǔn)備的放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料水溶液。隨后，分別采用游標(biāo)卡尺或相機(jī)對(duì)老鼠腫瘤體積的變化進(jìn)行測量和拍照。并且采用老鼠腫瘤體積的計(jì)算公式如下：腫瘤體積v＝ab²/2，其中，a＝腫瘤長度；b＝腫瘤寬度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，利用相機(jī)對(duì)本實(shí)施例中各種處理方式的老鼠腫瘤進(jìn)行拍照，如圖12a-圖12f所示，說明放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料在活體腫瘤模型中也會(huì)產(chǎn)生明顯的放射治療與基因治療的協(xié)同治療效果，與其他組相比，協(xié)同治療組的腫瘤生長得到最大限度的抑制。

以下實(shí)例用于說明實(shí)施例1中放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料對(duì)活體也不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性。

(1)腫瘤模型的構(gòu)建

首先，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買30只balb/c裸鼠，然后在老鼠皮下植入100μl含有細(xì)胞密度為1.0×10⁶的bel-7402細(xì)胞懸液。10天之后，待老鼠的腫瘤體積大小達(dá)到約100mm³時(shí)，將這些老鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行隨機(jī)分配。

(2)放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料對(duì)活體產(chǎn)生的毒性評(píng)估

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，對(duì)每組老鼠采用眼球取血方式，將搜集到的全血置于1.5ml離心管中，室溫下靜置2-3小時(shí)，然后采用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速為1500rpm離心5min，以獲得血清用于血生化指標(biāo)的檢測，用于判斷各組老鼠肝功能和腎功能是否正常。

利用血生化分析儀測定本實(shí)施例中取得的各組老鼠血生化指標(biāo)，如肝功能指標(biāo)的含量和腎功能指標(biāo)的含量等，結(jié)果見表1，各組老鼠血生化指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)、肌酐(crea)和尿素(urea)。肝功能指標(biāo)與腎功能指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，沒有出現(xiàn)明顯的異常現(xiàn)象，說明放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料對(duì)活體不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性。

表格1

本實(shí)例用于說明實(shí)施例1中放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料對(duì)老鼠腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。

(1)腫瘤模型的構(gòu)建

首先，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買30只balb/c裸鼠，然后在老鼠皮下植入100μl含有細(xì)胞密度為1.0×10⁶的bel-7402細(xì)胞懸液。10天之后，待老鼠的腫瘤體積大小達(dá)到約100mm³時(shí)，將這些老鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行隨機(jī)分配。

(2)對(duì)老鼠腫瘤轉(zhuǎn)移抑制效果的評(píng)價(jià)

待實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，處死老鼠之后，搜集每只老鼠的心，肝、脾、肺和腎，將取得的老鼠臟器用4％的多聚甲醛進(jìn)行固定兩天，隨后進(jìn)行石蠟切片及使用蘇木精和伊紅(h&e)染色。最后，用熒光倒置顯微鏡對(duì)每個(gè)組織切片進(jìn)行病理學(xué)分析。

利用熒光倒置顯微鏡(olympus,ix71，japan)對(duì)實(shí)施例中搜集到的病例切片進(jìn)行分析，如圖13a、圖13b、圖13c和圖13d所示，與對(duì)照組相比，使用放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料和x射線處理的老鼠腫瘤沒有發(fā)生任何轉(zhuǎn)移(圖13c和圖13d)，而對(duì)照組老鼠的腫瘤在肝臟和肺部都發(fā)現(xiàn)有明顯的轉(zhuǎn)移(圖13a和圖13b)，說明放射增敏劑多鎢酸釓復(fù)合納米材料對(duì)老鼠腫瘤具有明顯的抑制作用，并且還可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

以下實(shí)例用于說明殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體也可以用于多模式成像。

首先，將不同濃度的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體(0,6.25,12.5,25.0,50mg/ml)溶解在超純水中，然后將樣品置于磁共振成像儀下，用于測定樣品的磁共振信號(hào)強(qiáng)度(mri)的檢測。同樣，為了測定不同濃度條件下的ct的信號(hào)強(qiáng)度，不同濃度的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體(0,6.25,12.5,25.0,50mg/ml)溶解在0.5％的瓊脂糖水溶液中，然后將樣品置于1.5ml離心管中，用于測定樣品的ct信號(hào)強(qiáng)度。為了對(duì)比，相同濃度的商用ct造影劑碘普羅胺(iopromide)用作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。最后，將每個(gè)樣品置于計(jì)算機(jī)斷層掃描儀下進(jìn)行ct成像。

分別采用磁共振成像儀(biospec；bruker；ettlingen；germany)和計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(msotinvision128,itheramedical,germany)測定不同濃度的殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體的成像效果，如圖14所示，隨著濃度的增加，磁共振信號(hào)強(qiáng)度和ct信號(hào)強(qiáng)度都大大增加，說明殼聚糖修飾的多鎢酸釓復(fù)合納米載體也可以用于多模式(mr/ct)成像。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。