一種pH敏感的多肽聚合物及其制備方法和應用與流程

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本發(fā)明屬于藥物技術領域，涉及一種pH敏感的多肽聚合物及其制備方法和應用，尤其是涉及一種具有抗腫瘤活性的pH敏感的多肽聚合物及其制備方法和應用。

背景技術：

在癌癥治療中，目前傳統(tǒng)的化療手段都是利用一些小分子抗癌藥物制劑，它在治療癌癥的同時，對正常的組織會產(chǎn)生毒副作用。同時，人們還發(fā)展了一類新型的功能性多肽類分子用于腫瘤疾病治療，該類功能性多肽分子具有良好的生物相容性且能夠高效抑制腫瘤細胞。但是，多肽類分子一般由于具有較大的分子量及親水性的特點，使之很難進入細胞，因此具有較低的生物可利用度。此外，由于體內(nèi)多肽水解酶的廣泛存在，使其較容易被降解，穩(wěn)定性較差，體內(nèi)循環(huán)半衰期較短。

因此，人們隨后發(fā)展了大分子類給藥系統(tǒng)，該類大分子給藥系統(tǒng)可以顯著提高抗癌藥物選擇性進入腫瘤組織的幾率，減少化療對正常組織造成的副作用。但是現(xiàn)在的大分子類納米藥物或納米給藥系統(tǒng)，在體內(nèi)應用時仍存在一些問題，如：容易在肝內(nèi)積累，表面的電荷易被免疫系統(tǒng)識別，從而被排出體外，較短的體內(nèi)循環(huán)周期等。

CN102911326A公開了一種酸敏感可降解聚合物囊泡及其制備和應用，所述聚合物囊泡由A-B-C型嵌段聚合物形成，嵌段A為聚乙二醇，分布于囊泡外表面，嵌段B為疏水的pH敏感可降解聚合物聚(三甲氧基苯甲縮醛-三羥甲基乙烷-甲基丙烯酸酯)，構成囊泡的膜核，嵌段C為聚電解質(zhì)聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯、聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、或聚甲基丙烯酸二異丙氨乙酯中的一種，分布于囊泡膜內(nèi)壁，用于高效負載帶有相反電荷的藥物，該酸敏感可降解聚合物可以負載小分子親水抗癌藥物、治療性蛋白質(zhì)藥物、多肽類藥物和核酸類藥物，在其起作用時需要將聚合物降解釋放藥物來起到治療作用。

在本領域中，為了更好地進行抗癌治療，亟需開發(fā)更多多肽類藥物治療系統(tǒng)。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的在于提供一種pH敏感的多肽聚合物及其制備方法和應用，特別是提供一種具有抗腫瘤活性的pH敏感的多肽聚合物及其制備方法和應用。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一方面，本發(fā)明提供一種pH敏感的多肽聚合物，所述pH敏感的多肽聚合物由兩親性聚合物以及連接在兩親性聚合物上的pH敏感多肽組成。

在本發(fā)明中，通過共價鍵將pH敏感的多肽接到聚合物上，制備pH敏感的多肽類聚合物。所制備的pH敏感的多肽聚合物在血液循環(huán)中是惰性的，可以在體液循環(huán)中長期存在。當?shù)竭_腫瘤部位時，在腫瘤的微酸環(huán)境下，多肽發(fā)生質(zhì)子化，形成α螺旋結(jié)構，其治療活性被激活破壞腫瘤細胞的線粒體膜，誘導細胞死亡。這種腫瘤部位點特異性激活的多肽聚合物可以提高治療的靶向性和對腫瘤的毒性，降低對正常組織的副作用。同時多肽聚合物本身具有較高的生物相容性，實現(xiàn)抗腫瘤藥物在體內(nèi)的應用。

優(yōu)選地，所述兩親性聚合物為帶有羥基或氨基的兩親性聚合物。

優(yōu)選地，所述pH敏感多肽為含有巰基的pH敏感多肽；

優(yōu)選地，通過將所述兩親性聚合物進行丙烯酸化得到丙烯酸化的兩親性聚合物，而后將所述pH敏感多肽通過其含有的巰基與丙烯酸化的兩親性聚合物的丙烯基反應形成共價鍵而將多肽連接在兩親性聚合物上。

優(yōu)選地，所述pH敏感的多肽聚合物具有如下結(jié)構：

其中X為O或N，表示聚合物鏈。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的兩親性聚合物為丙烯酸化的聚乙烯醇、丙烯酸化的殼聚糖、丙烯酸化的葡聚糖、丙烯酸化的超支化聚酯、丙烯酸化的聚乙烯亞胺、丙烯酸化的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物或丙烯酸化的聚β巰基酯中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚乙烯醇的結(jié)構式為：其中m＝100-1800(例如100、120、150、180、200、230、250、280、300、500、800、1000、1300、1500或1800)，n＝80-1600(例如80、90、100、200、300、500、700、900、1000、1300、1500或1600)，p＝10-600(例如10、20、30、50、80、100、150、200、250、300、400、500或600)。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚乙烯醇的數(shù)均分子量為5000-80000，例如5000、5500、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000或80000。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的殼聚糖的結(jié)構式為：

其中m＝15-250(例如15、20、30、40、50、70、90、100、130、150、180、200、220或250)，n＝3-37(例如3、5、8、10、13、15、18、20、25、28、30、33、35或37)，p＝15-250(例如15、20、30、40、50、70、90、100、130、150、180、200、220或250)。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的殼聚糖的數(shù)均分子量為3000-50000，例如3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000或50000。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的葡聚糖的結(jié)構式為：其中m＝15-250(例如15、20、30、40、50、70、90、100、130、150、180、200、220或250)，n＝15-250(例如15、20、30、40、50、70、90、100、130、150、180、200、220或250)。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的葡聚糖的數(shù)均分子量為5000-80000，例如5000、5500、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000或80000。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的超支化聚酯為第2-4代的丙烯酸化的超支化聚酯。

在本發(fā)明中，所述第2-4代(第2、3、4代)的丙烯酸化的超支化聚酯是指，其中，第n代表示超支化程度及羥基的數(shù)目，例如，第2代有16個羥基，第3代有32個羥基，第4代有64個羥基。例如第4代的丙烯酸化的超支化聚酯為具有如下結(jié)構式的聚合物：

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚乙烯亞胺的結(jié)構式為：

其中n為7-70(例如7、9、12、15、18、20、23、25、28、30、40、50、60或70)。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚乙烯亞胺的數(shù)均分子量為5000-50000，例如5000、5500、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000或50000。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為第2-9代(第2、3、4、5、6、7、8、9代)的丙烯酸化的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，其中，第n代表示超支化程度及氨基的數(shù)目，例如，例如第4代的丙烯酸化的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物為具有如下結(jié)構式的聚合物：

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚β巰基酯的結(jié)構式為：

其中n為12-120(例如12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、110或120)。

優(yōu)選地，所述丙烯酸化的聚β巰基酯的數(shù)均分子量為5000-50000，例如5000、5500、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000或50000。

優(yōu)選地，所述pH敏感多肽為氨基酸序列為CGGGHLAHLAHHLAHLAH，在本發(fā)明中簡單記為HLAH。在該HLAH多肽中含有巰基。

本發(fā)明的目的之二在于提供如上所述的pH敏感的多肽聚合物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將兩親性聚合物進行丙烯酸化得到丙烯酸化的兩親性聚合物；

(2)利用丙烯酸化的兩親性聚合物與pH敏感的多肽反應，從而將pH敏感的多肽連接至兩親性聚合物上，得到所述pH敏感的多肽聚合物。

在本發(fā)明中，步驟(1)所述將兩親性聚合物進行丙烯酸化的方法為本領域已知的方法，例如步驟(1)所述兩親性聚合物為聚乙烯醇時，丙烯酸化的方法為：將兩親性聚合物與丙烯酸在催化劑存在下反應得到丙烯酸化的兩親性聚合物；

優(yōu)選地，所述催化劑為稀鹽酸。

優(yōu)選地，步驟(1)所述兩親性聚合物為殼聚糖、葡聚糖、超支化聚酯、聚乙烯亞胺、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物或聚β巰基酯中的任意一種或至少兩種的組合時，丙烯酸化的方法為：將兩親性聚合物與丙烯酰氯在催化劑存在下反應得到丙烯酸化的兩親性聚合物。

優(yōu)選地，所述催化劑為三乙胺或氫氧化鈉。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應在弱堿催化劑存在下進行。

優(yōu)選地，步驟(2)所述弱堿催化劑為三乙胺、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀中的任意一種或至少兩種組合。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應在保護性氣體保護下進行。

優(yōu)選地，所述保護性氣體為氮氣、氦氣、氖氣或氬氣中的任意一種，進一步優(yōu)選為氮氣。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應在中性或堿性溶劑體系中進行。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應在pH 7.4-8.0(例如pH為7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0)的磷酸緩沖溶液中進行。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應的溫度為25-37℃，例如25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃。

優(yōu)選地，步驟(2)所述反應的時間為1-8天，例如1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天或8天，優(yōu)選2-3天。

在本發(fā)明中，在步驟(2)所述反應結(jié)束后，將反應后的溶液透析，然后冷凍干燥，得到白色粉末狀的多肽聚合物。

所述將反應后的溶液透析的方法為：在截留分子量為5000-10000(例如5000、6000、7000、8000、9000或10000)的透析袋中透析24-48小時(例如24小時、26小時、28小時、30小時、33小時、35小時、38小時、40小時、42小時、44小時或48小時)。

優(yōu)選地，步驟(2)所述pH敏感的多肽通過固相合成法來合成。

本發(fā)明的目的之三在于提供如上所述的pH敏感的多肽聚合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發(fā)明所述的pH敏感的多肽聚合物，在血液循環(huán)中是惰性的，可以在體液循環(huán)中長期存在。當?shù)竭_腫瘤部位時，在腫瘤的微酸環(huán)境下，多肽發(fā)生質(zhì)子化，形成α螺旋結(jié)構，其治療活性被激活破壞腫瘤細胞的線粒體膜，誘導細胞死亡。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的pH敏感的多肽聚合物共價連接pH敏感的多肽分子，所述pH敏感的多肽聚合物，在血液循環(huán)中是惰性的，可以在體液循環(huán)中長期存在。當?shù)竭_腫瘤部位時，在腫瘤的微酸環(huán)境下，多肽發(fā)生質(zhì)子化，形成α螺旋結(jié)構，其治療活性被激活破壞腫瘤細胞的線粒體膜，誘導細胞死亡。這種腫瘤部位點特異性激活的多肽聚合物可以提高治療的靶向性和對腫瘤的毒性，降低對正常組織的副作用。同時多肽聚合物本身具有較高的生物相容性，實現(xiàn)抗腫瘤藥物在體內(nèi)的應用，為癌癥治療方向提供了新思路。

附圖說明

圖1是實施例1制備的多肽HLAH(–CGGGHLAHLAHHLAHLAH)的質(zhì)譜圖。

圖2是實施例1制備的多肽HLAH(–CGGGHLAHLAHHLAHLAH)的高效液相色譜圖。

圖3是實施例1制備的pH敏感的多肽聚合物在細胞內(nèi)的線粒體共定位圖。

圖4A是實施例1制備的pH敏感的多肽在不同pH以及濃度下的細胞存活率結(jié)果圖。

圖4B是實施例1制備的pH敏感的多肽聚合物在不同pH以及濃度下的細胞存活率結(jié)果圖。

圖5A為實施例1制備的pH敏感的多肽聚合物對小鼠治療后第17天的腫瘤部位的腫瘤大小的照片。

圖5B為實施例1制備的pH敏感的多肽聚合物對小鼠治療過程中小鼠腫瘤生長曲線圖。

圖5C為實施例1制備的pH敏感的多肽聚合物對小鼠治療過程中小鼠體重變化圖。

圖6為實施例1制備的pH敏感的多肽聚合物的對小鼠組織器官生物安全性評價結(jié)果圖，從左至由代表的器官為心、肝、脾、肺、腎。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1

(1)本發(fā)明實施例中所用的多肽HLAH(–CGGGHLAHLAHHLAHLAH)為利用固相合成法合成的序列，即合成過程為：以聚苯乙烯樹脂為固相載體，按照HALHALHHALHALHGGGC的順序?qū)被徇B接至載體上，完成多肽氨基酸的連接，最后用一定濃度的三氟乙酸裂解得到所述多肽。

圖1和圖2分別展示了實施例中所用的多肽–CGGGHLAHLAHHLAHLAH的質(zhì)譜圖和高效液相色譜圖，其分子量為1851，純度為95.66％；因此，所述多肽純度較高，不會發(fā)生氧化、二聚及環(huán)化等副反應，符合聚合反應要求。同時該多肽既溶于水也溶于二甲基亞砜，可以制備親水性多肽聚合物和疏水性多肽聚合物。

以聚β巰基酯為例制備多肽聚合物

(2)多肽聚合物的合成方法：

將10mM(總量)多肽分子–CGGGHLAHLAHHLAHLAH溶于水中，并置于反應器中，加入pH 7.4的磷酸的磷酸緩沖溶液2mL，攪拌溶解后，加入10mM分子量為52900的聚β巰基酯丙烯酸酯，密封體系，通入氮氣20分鐘，恒溫37℃反應3天；反應后的溶液加入透析袋中，透析24小時，冷凍干燥得到白色粉末狀固體。通過凝膠滲透色譜分析，多肽聚合物分子量為124000，分散度為1.2。

實施例2

將10mM(總量)多肽分子–CGGGHLAHLAHHLAHLAH溶于水中，并置于反應器中，加入pH 7.4的磷酸的磷酸緩沖溶液2mL，攪拌溶解后，加入10mM分子量為36000的丙烯酸化的聚乙烯醇，密封體系，通入氮氣20分鐘，恒溫25℃反應2天；反應后的溶液加入透析袋中，透析36小時，冷凍干燥得到白色粉末狀固體。通過凝膠滲透色譜分析，多肽聚合物分子量為108000，分散度為1.23。

實施例3

將10mM(總量)多肽分子–CGGGHLAHLAHHLAHLAH溶于水中，并置于反應器中，加入pH 7.4的磷酸的磷酸緩沖溶液2mL，攪拌溶解后，加入10mM分子量為80000的丙烯酸化的葡聚糖，密封體系，通入氮氣20分鐘，恒溫30℃反應1天；反應后的溶液加入透析袋中，透析48小時，冷凍干燥得到白色粉末狀固體。通過凝膠滲透色譜分析，多肽聚合物分子量為98000，分散度為1.28。

實施例4

將10mM(總量)多肽分子–CGGGHLAHLAHHLAHLAH溶于水中，并置于反應器中，加入pH 7.6的磷酸緩沖溶液2mL，攪拌溶解后，加入10mM分子量為80000的第4代的丙烯酸化的超支化聚酯，密封體系，通入氮氣20分鐘，恒溫30℃反應8天；反應后的溶液加入透析袋中，透析48小時，冷凍干燥得到白色粉末狀固體。通過凝膠滲透色譜分析，多肽聚合物分子量為189800，分散度為1.38。

實施例5

在本實施例中，對多肽聚合物與細胞線粒體進行共定位測試

將實施例1制備的多肽聚合物溶于磷酸緩沖液(PBS溶液)中，用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)測試方法評價多肽聚合物在U87細胞中對線粒體的破壞。JC-1檢測用于研究細胞凋亡的過程，JC-1在正常的線粒體中聚集形成J-型聚集體，發(fā)出紅色熒光；當線粒體遭到嚴重破壞時，紅色熒光幾近消失，綠色熒光逐漸增強。

實施例6

在本實施例中，對多肽聚合物進行生物毒性測試：

將實施例1制備的多肽聚合物溶于磷酸緩沖液(PBS溶液)中，用CCK-8測試方法評價多肽聚合物在U87細胞中的細胞毒性。

在含10.0％的胎牛血清和100.0U/mL青霉素以及100.0μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤(U87)細胞，培養(yǎng)溫度為37.0℃，濕潤空氣中CO₂的濃度為5.0％；培養(yǎng)細胞直至其對數(shù)生長期，用胰酶消化分散細胞；通過細胞計數(shù)板用細胞培養(yǎng)液將細胞懸浮液的濃度調(diào)整至6.0×10³/孔，向96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入100μL細胞懸浮液。將培養(yǎng)板放入含5.0％二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)，在37.0℃的溫度下培養(yǎng)24小時。從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)板，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入不同pH值(pH 7.4和pH 6.5)90μL的新鮮細胞培養(yǎng)液。然后向每孔中加入10μL不同濃度的樣品溶液，24h后進行CCK-8分析。細胞的細胞存活率按下面公式計算：細胞存活率(％)＝(A_sample/A_control)×100％，A_sample和A_control分別代表樣品的吸光度和參比的吸光度。每個實驗重復三次，取平均值。由圖4A為游離的多肽分別在不同pH值(pH 7.4和pH 6.5)培養(yǎng)液下共培養(yǎng)的細胞的細胞存活率，圖4B為所制備的多肽聚合物分別在不同pH值(pH 7.4和pH 6.5)共培養(yǎng)的細胞的細胞存活率。由圖4A和圖4B可知，所制備的多肽聚合物在pH 7.4時對細胞沒有毒性，當在微酸條件下(pH 6.5)，多肽聚合物相對于游離的多肽具有較高的細胞毒性。對實施例2-4制備得到的多肽聚合物納米膠束進行同樣的實驗可以得到同樣的結(jié)果。由此可推斷，所述多肽聚合物能夠有效殺死腫瘤細胞，具有較好的治療癌癥的效果且能夠降低對正常組織的毒副作用。

實施例7

在本實施例中，對多肽聚合物進行活體抗腫瘤測試：

所有動物實驗操作符合XX規(guī)定。實驗選用體重為18～20克左右，6～8周的磁性Balb/C裸鼠。在皮下注射5.0×10⁶個U87細胞，2周后腫瘤為50～100mm³時開始實驗。將實施例1制備的多肽聚合物納米膠束(P-H)溶液、聚合物膠束(P)溶液、多肽(HLAH)水溶液及PBS每隔一天(第1天、3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天)通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)(200μL,200μL,～10mg kg^-1聚合物,～3mg kg^-1多肽HLAH)，每組平行5只小鼠實驗。在1-17天，每隔一天稱量小鼠的體重，游標卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積計算方法為：V＝AB²/2，其中A為和B分別為腫瘤的最長直徑和最短直徑。圖5A為小鼠治療后第17天的腫瘤大小的照片，圖5B為治療過程中小鼠腫瘤生長曲線，圖5C為治療過程中小鼠體重變化，可知在1-17天的治療過程中，治療組(P-H)腫瘤得到明顯抑制。四組實驗組的小鼠體重幾乎沒有改變，表明所制備多肽聚合物對小鼠沒有毒副作用。對實施例2-4制備得到的多肽聚合物納米膠束進行同樣的實驗可以得到同樣的結(jié)果。因此，本發(fā)明所制備的pH敏感的多肽聚合物可有效的抑制腫瘤的增長，對小鼠沒有毒副作用。

實施例8

在本實施例中，對多肽聚合物進行生物安全性測試：

實驗選用體重為18～20克左右，6～8周的磁性Balb/C裸鼠。將實施例1制備得到的多肽聚合物納米膠束(P-H)溶液和PBS每隔一天(第1天、3天、5天、7天、9天、11天、13天、15天)通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)(200μL,～10mg kg^-1聚合物,～3mg kg^-1多肽HLAH)。之后將小鼠處死，取出心、肝、脾、肺、腎等組織器官，浸沒在4％的甲醛溶液中。通過HE(蘇木精-伊紅)染色觀察主要臟器的病理形態(tài)。從圖6可知，實驗組(P-H納米膠束)和空白對照組(PBS)的臟器的HE染色切片(從左至右依次為心、肝、脾、肺、腎)沒有明顯區(qū)別，對實施例2-4制備得到的多肽聚合物納米膠束進行同樣的實驗可以得到同樣的結(jié)果。這進一步表明，本發(fā)明所制備的pH敏感的多肽聚合物對小鼠沒有毒副作用。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的pH敏感的多肽聚合物及其制備方法和應用，但本發(fā)明并不局限于上述實施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。

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