本發(fā)明涉及三苯基新木質(zhì)素類化合物的應(yīng)用，尤其涉及含有紅花八角醇、大花八角醇及其衍生物為有效成分在制備抗菌藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一，可引起肺炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等多種致死性感染。尤其是醫(yī)院獲得性MRSA(hospital-acquired MRSA，HA-MRSA)，基于其多重耐藥和易傳播的特點給治療帶來極大困難。目前僅糖肽類萬古霉素及惡唑烷酮類利奈唑胺等少數(shù)幾類藥物對其有效。因此一些學(xué)者也將MRSA與乙型肝炎、艾滋病并列為世界三大感染性疾病。有資料表明，美國每年因MRSA感染導(dǎo)致死亡的患者數(shù)相當于AIDS、結(jié)核病和病毒性肝炎的總和。雖然萬古霉素、利奈唑胺、達托霉素和替加環(huán)素等少數(shù)藥物經(jīng)美國FDA批準用于臨床治療MRSA感染，但近年來臨床上已發(fā)現(xiàn)上述藥物的耐藥菌株，并且分得的幾率逐漸增加，故新型抗MRSA感染藥物的研發(fā)顯得尤為迫切。

紅花八角醇，大花八角醇是自八角屬(Illicium)植物莖葉中分離得到的一種三苯基新木質(zhì)素類化合物。其提取分離操作簡便，因此由其生產(chǎn)的抗菌藥物或其衍生物具有成本低，安全性高的特點。目前未見將其應(yīng)用于制備抗菌藥物中的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供含有化合物紅花八角醇(Dunnianol)或大花八角醇(Macranthol)為有效成分的藥物在制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和多藥抗藥性金黃色葡萄球菌藥物中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明人在長期從事抗菌天然藥物研究與開發(fā)的基礎(chǔ)上，對初篩的幾種抗菌活性較好的藥用植物進行活性追蹤，從中分離得到2個具有顯著抗菌活性的天然產(chǎn)物紅花八角醇，大花八角醇。發(fā)現(xiàn)紅花八角醇，大花八角醇及其衍生物作為有效成分在治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和多藥抗藥性金黃色葡萄球菌有較好的效果。

本發(fā)明所說的三苯基新木質(zhì)素類化合物為紅花八角醇，大花八角醇及其衍生物，其化學(xué)通式如下：

其中R₁為H或OH，R₂為H或OH。

優(yōu)選如下式(1)、(2)化合物：

紅花八角醇，大花八角醇提取方法：在典型的分離方法中，將包含該化合物的植物與一種或多種有機試劑一起粉碎以形成一種或多種植物提取物，然后純化該提取物以得到化合物。本發(fā)明化合物得自八角屬植物，特別是得自八角屬植物種野八角(Illicium simonsii)，紅花八角(Illicium dunnianum)或文山八角(Illicium tsaii)中提取分離得到。其它八角屬植物種例如華中八角(Illicium fargesii)也可用于提取本發(fā)明化合物。

本發(fā)明從天然來源分離紅花八角醇，大花八角醇。本發(fā)明化合物所采用的制備方法均為公認技術(shù)，在各種文獻中均可查閱到。

在針對革蘭氏陽性菌株，特別是MRSA和耐青霉素變異菌株方面，本發(fā)明所述化合物具有比現(xiàn)有技術(shù)有更好的活性，例如對細菌的多藥抗藥性菌株的活性。在發(fā)明人進行的實驗中，發(fā)現(xiàn)所述化合物具有對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)脂類、氟喹諾酮類和四環(huán)素類耐藥的菌株在內(nèi)的所有多藥抗藥性菌株的顯著活性。可以將本化合物直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有質(zhì)量百分比0.1-99％本發(fā)明化合物，優(yōu)選為0.5-90％，其余為藥物學(xué)上可接受的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。

所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明藥物組合物以單位體重服用量或涂膜劑的形式使用。紅花八角醇，大花八角醇及其衍生物的組合物采用制藥領(lǐng)域公認的方法制備成各種劑型。如液體制劑(注射液、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑等)、固體制劑(片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑等)、噴劑、氣霧劑、軟膏劑等。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注射(靜脈注射，靜脈滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下給藥、粘膜透析等給藥途徑進行細菌感染的治療。

本發(fā)明優(yōu)點：所得紅花八角醇，大花八角醇及其衍生物分離自植物天然產(chǎn)物，顯示出對革蘭氏陽性球菌的抗菌活性，尤其針對臨床治療困難的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和多藥耐藥的葡萄球菌屬。作為有效成分將其應(yīng)用在制備治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和多藥抗藥性金黃色葡萄球菌藥物中具有較好的效果。有利于新型抗MRSA感染藥物的研發(fā)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明藥物對金葡菌敏感株的抑菌活性實驗，圖中：A-紅花八角醇，B-大花八角醇，C-萬古霉素，D-DMSO；

圖2為本發(fā)明藥物對MRSA臨床株的抑菌活性實驗，圖中：A-紅花八角醇，B-大花八角醇，C-萬古霉素，D–DMSO。

具體實施方式

為對本發(fā)明進行更好地說明，舉實施例如下：

實施例1：紅花八角醇(1)，大花八角醇(2)的提取分離純化：

采集野八角莖葉，陰干，其學(xué)名經(jīng)鑒定為Illicium simonsii Maxim.，粉碎。取7.0kg陰干、粉碎的野八角莖葉，用質(zhì)量百分比95％乙醇回流提取3次，每次40L，每次3小時，過濾液濃縮至小體積，加水3L使懸浮，分別用氯仿(3L×3)和正丁醇(3L×4)萃取，減壓蒸餾得到氯仿部分(300g)和正丁醇部分(300g)。

氯仿部分(134g)用氯仿/甲醇溶解后吸附于300g硅膠，室溫揮干后經(jīng)硅膠柱層析(1kg，9.5×40cm，柱體積1500mL)，氯仿/甲醇(100∶0，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，0∶100)梯度洗脫，每1500mL為一個流分。經(jīng)硅膠TLC檢查，合并相同流份，得9個流分(A-I)。對各流分進行進一步的活性篩選發(fā)現(xiàn)，流分E活性最強。

對流分E進行進一步的化學(xué)成分分離。流分E(16.0g)用氯仿/甲醇溶解后吸附于20g硅膠，稱取200g硅膠裝柱(4×40cm)，以氯仿/丙酮(95：5，85：15，70：30)為洗脫劑梯度洗脫得到五個流分(E-1—E-5)。E-4(10g)以石油醚/丙酮(95：5)為洗脫劑經(jīng)硅膠柱(4×55cm，270g)得到流分E-3-2，再經(jīng)硅膠柱反復(fù)純化(石油醚：丙酮＝90：10)得到化合物1(2g)，化合物2(0.2g)。

結(jié)構(gòu)測定：旋光由JASCODIP-370旋光儀測定；紅外光譜(IR)采用KBr壓片法，由Bio-Rad FTS-135型紅外光譜儀；核磁共振譜(¹H-、¹³C-NMR、DEPT)用Brucker AM-400型和DRX-500型超導(dǎo)核磁共振儀測定、TMS(四甲基硅烷)作內(nèi)標；質(zhì)譜(MS)用VGAutospec-3000型質(zhì)譜儀測定；薄層色譜硅膠、柱層析硅膠(200-300目)購自青島海洋集團有限公司。

UV(甲醇)：λ_max(1ogε)＝320(2.39),295(2.69),216(3.41)。

IR(溴化鉀)：IR v_max(KBr)cm^-1：3250，3070，2975，2870，1640，1498，1405。

EI-MS m/z(％):398([M]⁺，100)，369(15)，316(20)，298(18)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)：δ:7.13(2H，s，H-3，H-5)，7.11(2H，d，J＝10.0Hz，H-5'，H-5”)，7.09(2H，s，H-3'，H-3”)，6.85(2H，d，J＝10.0Hz，H-6'，H-6”)，6.00(3H，m，H-8，H-8'，H-8”)，5.95(4H，m，H-9，H-9”)，5.13(2H，m，H-9)，3.37(6H，d，J＝8.5Hz，H-7，H-7'，H-7”)。

¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δ:147.6(s，C-1)，125.8(s，C-2，C-6)，131.4(d，C-3，C-5)，133.8(s，C-4)，39.4(t，C-7)，137.3(d，C-8)，116.1(t，C-9)，150.9(s，C-1'，C-1”)，124.8(s，C-2'，C-2”)，131.6(d，C-3'，C-3”)，133.2(s，C-4'，C-4”)，129.7(d，C-5'，C-5”)，117.0(d，C-6'，C-6”)，39.4(t，C-7'，C-7”)，137.5(d，C-8'，C-8”)，115.8(t，C-9'，C-9”)。

UV(甲醇)：λ_max(1og ε)＝295(2.73),214(3.28),204(3.29)。

IR(溴化鉀)：IR v_max(KBr)cm^-1：3434，3217，1637，1498，1468，1174，913cm^-1。

EI-MS m/z(％):398([M]⁺，100)，369(15)，316(20)，298(18)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ:7.29(1H，d，J＝2.2Hz，H-2)，7.25(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)，7.14(1H，dd，J＝8.1，2.2Hz，H-4”)，7.10(1H，d，J＝2.2Hz，H-6”)，7.04(1H，d，J＝2.2Hz，H-6')，7.03(1H，overlaped，H-4')，6.94(1H，d，J＝8.1Hz，H-3”)，6.88(1H，dd，J＝7.2，1.8Hz，H-3')，6.05(1H，m，H-8)，5.98(1H，m，H-8”)，5.93(1H，m，H-8')，5.17(2H，m，H-9)，5.03-5.10(2H，overlaped，H-9')，5.03-5.10(2H，overlaped，H-9”)。

¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δ:130.1(s，C-1)，130.9(d，C-2)，128.3(s，C-3)，150.9(s，C-4)，124.8(s，C-5)，130.0(d，C-6)，35.0(t，C-7)，136.2(d，C-8)，116.7(t，C-9)，127.5(s，C-1')，150.8(s，C-2')，115.8(d，C-3')，128.9(d，C-4')，132.4(s，C-5')，130.3(d，C-6')，39.3(t，C-7')，137.4(d，C-8')，115.9(t，C-9')，123.3(s，C-1”)，151.2(s，C-2”)，116.8(d，C-3”)，130.2(d，C-4”)，133.4(s，C-5”)，131.3(d，C-6”)，39.4(t，C-7”)，137.7(d，C-8”)，115.6(t，C-9”)。

實施例2.紅花八角醇，大花八角醇的體外抗菌活性實驗

(1)K-B紙片法：

實驗方法：參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M02-A11文件關(guān)于藥敏紙片制備的方法，同時制備本發(fā)明藥物和陽性對照藥物萬古霉素的藥敏紙片，使紙片載藥量為10μg/mL。此外，設(shè)溶劑DMSO陰性對照紙片。將制備好的藥敏紙片分別貼于涂布好金黃色葡萄球菌標準株ATCC 29213和MRSA臨床株JP-5的MHA瓊脂板上，在放置好紙片后15min內(nèi)倒置瓊脂板并將其放置在37℃孵箱中培養(yǎng)16-18小時后讀取結(jié)果，即抑菌圈大小。

實驗結(jié)果：從圖1抑菌圈內(nèi)徑大小可見(紅花八角醇0.49cm；大花八角醇0.46cm；萬古霉素：0.53cm)，本發(fā)明藥物紅花八角醇和大花八角醇對金葡菌敏感株表現(xiàn)出與萬古霉素(臨床治療包括MRSA在內(nèi)的金葡菌感染的一線藥物)相當?shù)囊志钚浴RSA臨床株(圖2)的抑菌活性(紅花八角醇0.41cm；大花八角醇0.41cm)雖然稍弱于萬古霉素(0.58cm)，但仍表現(xiàn)出顯著抑菌活性。

(2)微量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC):

實驗方法：參照CLSI M07-A9文件關(guān)于稀釋法抗菌藥物敏感性試驗方法標準，測定本發(fā)明藥物對MRSA臨床株的最低抑菌濃度。該實驗中，本發(fā)明藥物的溶解劑為DMSO，稀釋劑為純水，DMSO終濃度≤1％；受試藥物稀釋檢測范圍為8-0.015μg/mL；金黃色葡萄球菌標準株ATCC 29213為質(zhì)控菌株。具體方法如下：按照倍比稀釋法，將抗菌藥物原液用MH肉湯稀釋成10個梯度，依次加入96孔細胞培養(yǎng)板前10個孔中，每孔100μL。用MH肉湯將測試菌株稀釋成10⁵CFU/mL，在每排前10孔各加入稀釋菌液100μL。第11孔加100μL MH肉湯作陰性對照，第12孔加100μL稀釋菌液作陽性對照。37℃培養(yǎng)16～20h，觀察各孔培養(yǎng)液中細菌的生長情況，以抑制細菌生長的藥物最高稀釋度作為測試藥物的最小抑菌濃度(MIC)。每種藥物做2個平行。

實驗結(jié)果：由表1可見，本發(fā)明藥物對MRSA臨床株表現(xiàn)出與萬古霉素相當?shù)牧己玫目咕钚浴?/p>

表1本發(fā)明藥物對10株無重復(fù)臨床分離MRSA的MIC(μg/mL)

實施例3.紅花八角醇，大花八角醇對小鼠表皮感染模型的在體抗菌活性試驗

實驗方法：

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間給予充足的鼠糧和水。1周后隨機挑取30只小鼠剪去背毛，用質(zhì)量百分比10％水合氯醛0.1ml/20g將其麻醉，麻醉后的小鼠用恒溫燙傷儀100℃燙傷10秒，燙傷壓力1000g燙傷面積為2.5cm²；挑取過夜培養(yǎng)的MRSA臨床株，200rmp 37℃過夜培養(yǎng)，取100μL菌液于每只小鼠燙傷傷口處涂勻進行感染，反復(fù)感染11次，經(jīng)檢測30只小鼠全部感染成功。將30只感染小鼠隨機分為2組，每組15只，再將每組的15只小鼠隨機分為5組每組3只，分別為大花八角醇組、紅花八角醇組、萬古霉素組、生理鹽水組、1％DMSO組，小鼠感染感染24和48h后給藥，每3h給藥1次，連續(xù)給藥5次，每次給藥量4μg(100μL，濃度40μg/mL)。給藥后第15個小時將小鼠脫臼處死，用酒精棉球簡單消毒感染部位周圍，用蘸有生理鹽水的棉簽刮擦感染部位，取膿液于1mL生理鹽水中，3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，再加1mL生理鹽水重懸菌體，混勻，稀釋適當倍數(shù)后涂布于金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(金葡菌在此板上顯紅色，雜菌無色或藍色)，37℃培養(yǎng)16-18h后讀取菌落數(shù)(每組每只小鼠平行涂板3塊，菌落數(shù)取平均數(shù))，觀察持續(xù)給藥后感染部位菌落減少數(shù)。

實驗結(jié)果：由表2可見，本發(fā)明藥物大花八角醇和紅花八角醇，對小鼠MRSA表皮感染模型的治療效果顯著，能夠顯著降低小鼠感染部位的菌落數(shù)，對MRSA具有一定的抑殺活性。

表2本發(fā)明藥物對小鼠MRSA表皮感染模型的治療效果

實施例4：注射液

本發(fā)明化合物1或化合物2用少量的DMSO溶解后，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實施例5：片劑

本發(fā)明化合物1或化合物2與賦形劑按照重量比為1:5的比例加入賦形劑，制粒壓片，得片劑。

實施例6：膠囊

本發(fā)明化合物1或化合物2與賦形劑按照重量比為1:5的比例加入賦形劑，制成膠囊。

實施例7：軟膏劑

本發(fā)明化合物1或化合物2與賦形劑按照重量比為1:5的比例加入賦形劑，制成軟膏劑。

本發(fā)明的用途和方法已經(jīng)通過具體的實施例進行了描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本發(fā)明的內(nèi)容適當改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。