本發(fā)明屬于化合物的生物活性應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種圓錐山螞蝗堿在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及藥物組合物。

背景技術(shù)：

腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。腫瘤與心腦血管疾病和意外事故一起，構(gòu)成當(dāng)今世界所有國家三大死亡原因。因此，世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克腫瘤列為一項(xiàng)首要任務(wù)。

目前，腫瘤的治療主要有西醫(yī)治療與中醫(yī)治療兩種治療方法，西醫(yī)治療主要有手術(shù)治療、放療與化療。現(xiàn)代西醫(yī)常采用手術(shù)治療的方法來治療各種腫瘤，該方法給病人造成極大的痛苦和較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對(duì)于惡性腫瘤來說，一旦發(fā)現(xiàn)則一般處于中晚期，手術(shù)治療并不是最佳方法，因?yàn)閷?duì)于中晚期腫瘤盡管切除了病灶，但同時(shí)手術(shù)對(duì)人體的巨大創(chuàng)傷也加速了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，手術(shù)后一般要配合放療或化療治療，這種放療或化療治療對(duì)正常人體細(xì)胞有極大的殺傷作用，大大降低了人體自身的免疫能力。放療對(duì)某些部位腫瘤的治療有時(shí)會(huì)有比較理想的效果，但對(duì)很多部位腫瘤的治療療效是不能達(dá)到真正治愈的預(yù)期目的的，在放療的過程中，對(duì)人體的傷害也往往是明顯的，并且手術(shù)與放療治療后的病人5年以上生存率還是很不理想的。

圓錐山螞蝗(Desmodium elegans)為豆科山螞蝗屬下的一個(gè)種。多分枝灌木；葉為羽狀三出復(fù)葉；小葉紙質(zhì)，形狀、大小變化較大，卵狀橢圓形、寬卵形、菱形或圓菱形；花序頂生或腋生，頂生者多為圓錐花序，腋生者為總狀花序；莢果扁平，線形；花、果期6-10月。產(chǎn)于陜西西南部、甘肅、四川、貴州西北部、云南西北部和西藏。生于松、櫟林緣，林下，山坡路旁或水溝邊，海拔1000-3700米。CN103922991A公開了圓錐山螞蝗枝葉中分離的化合物及其制備方法和用途，該化合物的化學(xué)名稱為[(S,E)-4-(3-(2-(dimethylamino)ethyl)-1H-indol-5-yloxy)-4-(4-hydroxy-2,6,6-trimethylcycloh ex-1-enyl)but-3-en-2-one]，俗名為Desmodeleganine，該化合物是從圓錐山螞蝗(Desmodiumelegans)枝葉中經(jīng)過大孔樹脂、MCI、硅膠以及LH-20柱層析的方法獲得，單胺氧化酶(MAO)抑制活性實(shí)驗(yàn)證明該化合物具有顯著抗單胺氧化酶活性，動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明該化合物具有抗抑郁、抗帕金森作用。

通過檢索國內(nèi)外的現(xiàn)有技術(shù)，目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道圓錐山螞蝗枝葉根或圓錐山螞蝗堿具有抗腫瘤的生物活性。另外，甲磺酸伊馬替尼可用于抗腫瘤，但由于經(jīng)口服方式給藥后到達(dá)癌變組織的藥物濃度過低，而大劑量給藥帶來的毒副作用，包括水潴留、周圍浮腫、疲勞、乏力、發(fā)熱、畏寒、寒戰(zhàn)、僵直等副作用，因此限制了該藥在這方面的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人在臨床用藥中意外地發(fā)現(xiàn)，癌癥患者抑郁后采用民間驗(yàn)方緩解抑郁癥狀時(shí)，發(fā)現(xiàn)中藥材圓錐山螞蝗可顯著增強(qiáng)甲磺酸伊馬替尼抗腫瘤的療效。

進(jìn)一步的體外細(xì)胞試驗(yàn)研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)圓錐山螞蝗枝葉中提取分離的圓錐山螞蝗堿具有一定的抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用。倒置顯微鏡觀察MCF-7乳腺癌細(xì)胞經(jīng)圓錐山螞蝗堿處理后形態(tài)的變化，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)藥物處理的MCF-7乳腺癌細(xì)胞貼壁伸展，相鄰細(xì)胞連接成片，形態(tài)舒展，折光均勻，細(xì)胞核大而明顯。中濃度的圓錐山螞蝗堿處理24h后細(xì)胞收縮變小，與周圍細(xì)胞分離，細(xì)胞核周圍出現(xiàn)較多空泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核物質(zhì)邊集，而高濃度的圓錐山螞蝗堿作用24h后，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核異常凝集，核固縮和凋亡小體形成等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。再進(jìn)一步的體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大幅度降低甲磺酸伊馬替尼劑量后，與圓錐山螞蝗堿聯(lián)合用藥具有抗腫瘤的協(xié)同作用。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)圓錐山螞蝗堿具有抗腫瘤細(xì)胞增殖的活性，利用該發(fā)現(xiàn)制備抗腫瘤的藥物可用于治療或預(yù)防與腫瘤疾病?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)研究結(jié)果，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種圓錐山螞蝗堿的制藥用途，即：圓錐山螞蝗堿在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。需要說明的是，本發(fā)明制備的抗腫瘤藥物，可適用的腫瘤類型為肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、宮頸癌。另外，本發(fā)明所涉及的圓錐山螞蝗堿的化學(xué)名為：(S,E)-4-(4-羥基-2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯基)-4-((3-(2-(二甲氨基)乙基)-1H-吲哚-5-基)氧基)丁-3-烯-2-酮，其英文通用名為Desmodeleganine，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明所涉及的活性化合物圓錐山螞蝗堿，其氫譜、碳譜數(shù)據(jù)為：¹H-NMR：7.23(s),7.17(d,J＝2.2)，6.88(dd,J＝2.2,8.8)，7.31(d,J＝8.8)，3.10(t,J＝7.4)，3.25(t,J＝7.4)，2.80(s)，1.62(dd,J＝2.2,12.1)，1.28(dd,J＝5.4,12.1)，3.83(m)，2.41(dd,J＝7.8,18.0)，1.93(dd,J＝10.2,18.0)，5.40(s)，2.42(s)，0.99(s)，1.05(s)，1.97(s)。¹³C-NMR：125.74,110.58，128.24，108.14，149.95，115.28，112.93，135.03，22.30，59.56，43.98，37.72，49.14，64.55，42.30，136.77，135.87，165.79，119.21，200.73，31.37，29.98，30.36，23.30。

另外，本發(fā)明人將圓錐山螞蝗堿與小劑量的甲磺酸伊馬替尼聯(lián)用后，能夠降低化療的不良反應(yīng)，并能夠增強(qiáng)甲磺酸伊馬替尼抗腫瘤的敏感性，二者聯(lián)用后在抗腫瘤生長方面具有協(xié)同作用。因此，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種抗腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物由活性成分和藥學(xué)上可用的輔料組成，所述的活性成分包括甲磺酸伊馬替尼和圓錐山螞蝗堿。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述抗腫瘤的藥物組合物，其中甲磺酸伊馬替尼和圓錐山螞蝗堿的重量比為(2-16)：1。進(jìn)一步優(yōu)選地，甲磺酸伊馬替尼和圓錐山螞蝗堿的重量比為(4-8)：1。在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例中，甲磺酸伊馬替尼和圓錐山螞蝗堿的重量比為8：1。

本發(fā)明所述抗腫瘤的藥物組合物，其中甲磺酸伊馬替尼和圓錐山螞蝗堿作為活性成分以灌胃方式進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果藥物經(jīng)胃腸吸收顯著，因此所述的藥物組合物可以為口服制劑。其中所述的口服制劑包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、滴丸。需要說明的是，按照制劑領(lǐng)域的常規(guī)工藝，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易將甲磺酸伊馬替尼和圓錐山螞蝗堿與藥劑學(xué)上可接受的輔料制備成常用的口服制劑，如顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、滴丸。其中，藥劑學(xué)上可接受的輔料包括填充劑、崩解劑、粘合劑、矯味劑、潤滑劑等等。所述的填充劑選自以下的一種或多種：預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇和微晶纖維素；所述的崩解劑選自以下的一種或多種：羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和低取代羥丙基纖維素；所述的粘合劑選自以下的一種或多種：淀粉漿、羥丙基纖維素溶液、聚維酮溶液；所述的潤滑劑選自以下的一種或兩種：硬脂酸鎂、滑石粉。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)圓錐山螞蝗堿具有抗腫瘤增殖的活性，利用該發(fā)現(xiàn)制備抗腫瘤藥物可用于治療或預(yù)防與癌癥相關(guān)的疾病。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，圓錐山螞蝗堿與甲磺酸伊馬替尼聯(lián)用對(duì)于多個(gè)不同組織來源的腫瘤細(xì)胞具有抑制腫瘤增殖和活性的作用，包括乳腺癌、結(jié)腸癌癌和胃癌等，圓錐山螞蝗堿對(duì)甲磺酸伊馬替尼的增效作用呈劑量依賴性，且圓錐山螞蝗堿體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中工作濃度未見毒性，具有藥源豐富、安全無毒的特征，可進(jìn)一步開發(fā)為用于抗腫瘤化療藥增效劑的抗腫瘤藥物。

附圖說明

圖1：圓錐山螞蝗堿作用12、24、48h時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞存活率的影響曲線；

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明圓錐山螞蝗堿的體外和體內(nèi)藥效實(shí)施例，實(shí)施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：圓錐山螞蝗堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL(約含1×10⁴個(gè)細(xì)胞)，置37℃、100％濕度、5％CO₂條件下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，換新鮮培養(yǎng)基并加入不同濃度的圓錐山螞蝗堿(每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔)處理12，24，48h后，每孔加入90μL新鮮培養(yǎng)基和5％MTTl0μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，每孔加入100μLDMSO，振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光值。細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組A值-本底A值)/(空白對(duì)照組A值-本底A值)×100％，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)圖1的體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，低濃度的圓錐山螞蝗堿(5，10，20，40μg/m1)作用12，24，48h，沒有明顯的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用，但高濃度的圓錐山螞蝗堿(80，160μg/m1)對(duì)細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，并隨著給藥時(shí)間的延長，抑制作用也顯著增強(qiáng)，160μg/ml的藥物作用48h，細(xì)胞的存活率接近零。

實(shí)施例2：圓錐山螞蝗堿的急性毒性試驗(yàn)研究

KM小鼠，50只，雌雄各半，體重18-20g，每天供給普通小鼠全價(jià)顆粒飼料，飲用水為純凈水。小鼠購入后適應(yīng)期經(jīng)觀察未見異常反應(yīng)，飲食正常。按性別采用按體重分層隨機(jī)分配的方法將小鼠分為對(duì)照組(安慰劑)和受試組(化合物)，每組22只，雌雄各半，隨機(jī)編號(hào)，用苦味酸在小鼠不同部位做標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分。每組1-20號(hào)為正式試驗(yàn)動(dòng)物，21-22號(hào)為備用動(dòng)物，試驗(yàn)方法相同。給藥前日傍晚小鼠禁食(不禁水)，將圓錐山螞蝗堿以1.50g/kg給予小鼠灌胃2次，兩次間隔6h，小鼠總灌胃量為3.0g/kg/d。對(duì)呼吸系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)功能、驚厥抽搐反應(yīng)、眼瞼指征、心血管指征、唾液分泌、豎毛、痛覺、肌張力、胃腸指征、皮膚等各個(gè)系統(tǒng)和靶器官進(jìn)行分析，確定毒性可能涉及的組織、器官和系統(tǒng)。給藥后即刻開始，觀察給藥當(dāng)天小鼠有無以上中毒癥狀。若未出現(xiàn)死亡，則繼續(xù)飼養(yǎng)14d，每7d稱取體重1次。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)脫頸椎處死小鼠，對(duì)心、肝、脾、肺、腎等主要器官進(jìn)行大體解剖，當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí)，則對(duì)改變的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

與對(duì)照組比較，圓錐山螞蝗堿受試組小鼠藥后7d、14d體重?zé)o明顯減輕。對(duì)受試小鼠進(jìn)行大體解剖，未見組織器官有體積、顏色、質(zhì)地的改變。以最大給藥量給予小鼠本發(fā)明藥物2次(即總給藥量為3.0g/kg/d)，該劑量下小鼠未出現(xiàn)死亡，各個(gè)系統(tǒng)和靶器官未表現(xiàn)相應(yīng)的毒性反應(yīng)。

實(shí)施例3：甲磺酸伊馬替尼聯(lián)合圓錐山螞蝗堿結(jié)腸癌荷瘤小鼠的影響試驗(yàn)

取人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo，置于含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)液，無菌條件下收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁶/mL得細(xì)胞懸液。裸鼠皮膚消毒后，用1mL注射器于每只裸鼠右腋皮下接種0.1mL的細(xì)胞懸液。接種后繼續(xù)在SPF級(jí)條件下的層流架中飼養(yǎng)。每2～3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤直徑，待腫瘤平均直徑為5～6mm時(shí)，選擇無出血、無壞死、無感染的裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

模型制備成功后，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，模型對(duì)照組每次灌胃給予等體積生理鹽水，圓錐山螞蝗堿組每次灌胃圓錐山螞蝗堿20mg/kg，甲磺酸伊馬替尼組每次灌胃甲磺酸伊馬替尼160mg/kg，聯(lián)合用藥組每次灌胃圓錐山螞蝗堿10mg/kg+甲磺酸伊馬替尼80mg/kg，連續(xù)給藥2周，1次/d。實(shí)驗(yàn)期間所有裸鼠均自由采食、飲水。每次給藥前稱裸鼠體質(zhì)量，每2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量1次瘤塊的長徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)。V＝1/2×a×b²；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死裸鼠，無菌條件下立即完整剝離瘤塊，稱瘤質(zhì)量，計(jì)算各組平均瘤質(zhì)量和抑瘤率。抑瘤率＝(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量

根據(jù)表1的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，與模型組相比，各給藥組顯示不同程度的腫瘤抑制作用；并且，圓錐山螞蝗堿與甲磺酸伊馬替尼的聯(lián)合給藥組的抑瘤率達(dá)到了48.86％，顯著高于對(duì)照藥伊馬替尼組。

表1各組藥物對(duì)裸鼠移植瘤的影響比較(n＝10)

與模型對(duì)照組比較，^*P＜0.05；與圓錐山螞蝗堿組比較，^￥P＜0.05；與伊馬替尼組比較，^#P＜0.05。