本發(fā)明屬于藥物新用途
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及褪黑素在制備治療松動(dòng)假體周圍慢性炎癥和骨質(zhì)破壞的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：磨損顆粒引起的假體周圍慢性炎癥和骨質(zhì)破壞是引起無菌性松動(dòng)（asepticloosening，AL）的病理基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)，人工假體置入后，材料與骨界面間的微動(dòng)和長(zhǎng)期的關(guān)節(jié)磨損，必然會(huì)產(chǎn)生大量的磨損顆粒，包括PMMA、聚乙烯以及金屬顆粒等。磨損顆粒積聚在假體周圍，一方面加重了局部摩擦，引起磨損顆粒增多，形成溶解-松動(dòng)-溶解的惡行循環(huán)，另一方面磨損顆粒能引起周圍結(jié)締組織炎癥反應(yīng)，假體-骨界面的骨組織細(xì)胞吞噬磨損顆粒后，以自分泌或旁分泌的方式釋放大量細(xì)胞因子，從而引起假體周圍骨改建紊亂，導(dǎo)致假體松動(dòng)。為了預(yù)防和治療磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解而導(dǎo)致的人工假體失效，研究人員做了大量的工作，包括設(shè)計(jì)新型假體、采用耐磨材料，改進(jìn)手術(shù)方法及固定技術(shù)等。這些技術(shù)以及材料的采用使得假體松動(dòng)發(fā)生率明顯降低，但磨損依然存在。除了后期的翻修手術(shù)，假體松動(dòng)尚無有效的預(yù)防和治療手段。但翻修手術(shù)對(duì)于初次人工關(guān)節(jié)置換而言手術(shù)難度大、效果差、費(fèi)用高、創(chuàng)傷大，給患者帶來巨大痛苦和負(fù)擔(dān)。目前，越來越多的學(xué)者將注意力集中在闡釋磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的發(fā)生機(jī)制，尋求藥理學(xué)干預(yù)措施阻斷磨損顆粒誘導(dǎo)的骨質(zhì)破壞作用。褪黑素（melatonin，Mel），化學(xué)名N-乙?；?5-甲氧基色胺，CASNo：8041-44-9，分子式C13H16N2O2，分子量232.28，結(jié)構(gòu)式如下：。褪黑素是松果體產(chǎn)生的一種吲哚胺類激素，既往研究證實(shí)褪黑素具有多種生理功能，包括促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等。美國(guó)FDA認(rèn)為褪黑素可以作為普通的膳食補(bǔ)充劑。到目前為止，我國(guó)CFDA已經(jīng)批準(zhǔn)了20多種含有褪黑素的產(chǎn)品作為改善睡眠保健藥品。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在骨髓中也有表達(dá)，提示褪黑素可能參與骨發(fā)育的調(diào)控。最新的研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，體內(nèi)研究證實(shí)藥理劑量的褪黑素能增加小鼠骨密度。但褪黑素對(duì)假體松動(dòng)引起的慢性炎癥和骨質(zhì)破壞的保護(hù)作用尚未見有關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，開發(fā)褪黑素的新用途，且尋找能夠防治磨損顆粒引起的假體松動(dòng)，抑制骨質(zhì)破壞和炎癥反應(yīng)的有效藥物，本發(fā)明提供了褪黑素在制備治療松動(dòng)假體周圍慢性炎癥和骨質(zhì)破壞的藥物中的用途。技術(shù)方案：褪黑素在制備治療松動(dòng)假體周圍慢性炎癥和骨質(zhì)破壞的藥物中的用途，所述褪黑素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：，所述的藥物包含藥學(xué)上有效劑量的上述化合物和藥學(xué)上可接受的載體。所述假體松動(dòng)為磨損顆粒引起的假體松動(dòng)。一種治療松動(dòng)假體周圍慢性炎癥和骨質(zhì)破壞的藥物，包含褪黑素。優(yōu)選的，所述褪黑素在在藥物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-99%，優(yōu)選10-90%。優(yōu)選的，所述藥物制成適用于胃腸道或非胃腸道給藥的藥物制劑，優(yōu)選為常規(guī)片劑或膠囊劑或控釋、緩釋制劑。有益效果：本發(fā)明發(fā)掘了褪黑素新的藥用前景，開拓了一個(gè)新的藥用領(lǐng)域，其對(duì)假體松動(dòng)療效確切，具有高效防治磨損顆粒引起的假體松動(dòng)的用途，同時(shí)能夠顯著降低炎癥因子的表達(dá)，減輕磨損顆粒引起的炎癥反應(yīng)，抑制破骨細(xì)胞活化，促進(jìn)骨溶解局部新骨形成，減輕磨損顆粒引起的骨質(zhì)破壞。附圖說明：圖1為各實(shí)驗(yàn)組小鼠顱骨HE染色結(jié)果及顱骨骨溶解面積、顱骨厚度檢測(cè)值。*p<0.05,**p<0.01。圖2為免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠顱骨炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。*p<0.05,**p<0.01。圖3為micro-CT掃描各實(shí)驗(yàn)組小鼠顱骨的二維圖像及小鼠顱骨陷窩數(shù)、骨密度（BMD）、骨體積（BV）及骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）檢測(cè)值。*p<0.05,**p<0.01。圖4為各實(shí)驗(yàn)組小鼠顱骨TRAP染色結(jié)果及破骨細(xì)胞數(shù)量、OCs/BS檢測(cè)值。*p<0.05,**p<0.01。圖5為免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠顱骨局部ALP、Osterix和OCN表達(dá)及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。*p<0.05,**p<0.01。圖6為免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠顱骨局部RANKL和OPG表達(dá)及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。*p<0.05,**p<0.01。圖7為免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子β-catenin和DKK1表達(dá)及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。*p<0.05,**p<0.01。具體實(shí)施方式實(shí)施例11.主要藥品及試劑褪黑素（melatonin，Mel），TRAP染色試劑盒，購(gòu)自Sigma，美國(guó)；多聚甲醛、PBS、DAB顯色劑、蘇木素、伊紅、無水乙醇、蒸餾水、10%水合氯醛。鈦顆粒購(gòu)自美國(guó)JohnsonMattheychemicals公司(catalog#00681;WardHill,Massachusetts)；RANKL、OPG、TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Biosource，美國(guó)；OPG、RANKL、β-catenin、DKK1、TNF-α、IL-1β、IL-6抗體均購(gòu)自Abcam,英國(guó)。2.主要儀器Micro-CT（SkyScan1176，比利時(shí)）、石蠟切片機(jī)（Leica2135，德國(guó)）、烤片機(jī)（Leica1120，德國(guó)）、石蠟包埋機(jī)（BMJ-Ⅱ，中國(guó)，常州）、Axiovert40C光學(xué)顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）、酶標(biāo)儀（Biotec，美國(guó)）、手術(shù)器械一套。3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康C57BL/J6小鼠60只，雄性，體重19～22g，8～10周齡，清潔級(jí)，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012-0045]。喂養(yǎng)條件如下：五只一籠，室溫18～20℃，濕度50～60%，通風(fēng)良好，自由攝食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)C57BL/6小鼠的處置方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。4.實(shí)驗(yàn)方法（1）鈦顆粒（titanium,Ti）的觀察及消毒處理Ti顆粒直徑為3.32±2.39μm，其中90%的顆粒直徑小于3.6μm，50%的顆粒直徑小于1.6μm，10%的顆粒直徑小于1.0μm。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示Ti顆粒形狀不規(guī)則，大小不一。在使用前，Ti顆粒應(yīng)消毒和去除內(nèi)毒素。將Ti顆粒置于烘箱內(nèi)，180℃烘烤6h后，硝酸（1M）浸泡4h，等滲鹽水反復(fù)沖洗，2000rpm離心5min；后將其浸泡于75%乙醇，室溫下振蕩1h，重復(fù)四次，無水乙醇浸泡過夜，等滲鹽水洗滌3次，2000rpm離心5min沉淀Ti顆粒；將Ti顆粒置于超凈工作臺(tái)中，紫外線照射條件下自然干燥后4℃保存?zhèn)溆?。?）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組雌性C57BL/6小鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組（Sham），Ti顆粒植入組（Vehicle），Mel低劑量治療組（Low-Mel）和Mel高劑量治療組（High-Mel），每組15只小鼠。Sham組僅接受假手術(shù)，術(shù)后每天經(jīng)腹腔300μl等滲鹽水，6天/周；Vehicle組在小鼠顱骨表面植入Ti顆粒，術(shù)后每天經(jīng)腹腔300μl等滲鹽水，6天/周；Low-Mel和High-Mel組，Ti顆粒植入后，術(shù)后每天經(jīng)腹腔5或50mgkg-1d-1Mel，持續(xù)2周。（3）小鼠顱骨骨溶解模型的制備采用Greenfield制備的小鼠顱骨骨溶解模型模擬磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的病理過程。小鼠稱重后，以40g/L水合氯醛按40mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，采用小鼠固定板固定小鼠四肢和頭部，顱頂局部皮膚去毛后安爾碘消毒。在顱骨表面沿顱骨正中矢狀縫的體表投影位置作一長(zhǎng)約1cm切口，暴露1cm×1cm的視野，不破壞骨膜。以小鼠顱骨矢狀縫和冠狀縫交匯處為中心，將消毒后的Ti顆粒50μl（400mg/ml）均勻涂在顱骨表面（20mg/只）。以4-0手術(shù)線間斷縫合傷口。術(shù)后日光燈照射加溫復(fù)蘇小鼠，待小鼠完全蘇醒后再放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。術(shù)前每只小鼠經(jīng)皮下注射6-氯-α-甲基咔唑-2-乙酸4mg/kg；術(shù)后在飲用水中加入100mg/ml恩諾沙星，持續(xù)3天。（4）標(biāo)本收集給藥2周后，使用CO2箱處死小鼠，整體分離小鼠顱骨及顱下腦組織，剔除顱底附著軟組織，每組小鼠顱骨平均分為3組：5個(gè)顱骨/組置于6孔板中，加入2ml含有1%青-鏈霉素的無血清DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，2000rpm離心5min，收集上清，-80℃凍存；保留顱骨用于分子生物學(xué)檢測(cè)。5個(gè)顱骨/組10%多聚甲醛固定48h后行micro-CT掃描。5個(gè)顱骨/組10%多聚甲醛固定48h后，再以10%EDTA脫鈣，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。實(shí)施例2使用比利時(shí)SkyScan公司生產(chǎn)的高分辨顯微CTSkyScan1076對(duì)小鼠顱骨進(jìn)行掃描分析。掃描前將標(biāo)本從固定液中取出，晾干。參照Zhai等的方法，用手術(shù)刀片輕輕去除顱骨表面黑色的Ti顆粒，避免掃描時(shí)金屬偽影干擾。將每個(gè)顱骨放置在micro-CT測(cè)試試管杯中，每次5只，每個(gè)顱骨間用泡沫塑料片隔開；顱骨要擺放整齊，避免碰到試管壁。掃描參數(shù)設(shè)置為：掃描分辨率18μm，旋轉(zhuǎn)角度180°，旋轉(zhuǎn)角度量增0.9°，電壓80kV，電流100μA，曝光時(shí)間100ms。掃描結(jié)束后，采用SkyScan1076自帶軟件進(jìn)行顱骨三維重建。按照Wedemeyer建立的方法，使用CTAnalyzer分析軟件（CTAn，SkyScan）在小鼠顱骨表面以冠狀縫和矢狀縫交匯處為中心選定一圓柱形感興趣區(qū)域（Regionofinterest，ROI；3×3×1mm），分析以下參數(shù)：骨密度（Bonemineraldensity，BMD），以mg/cc表示；骨體積（Bonevolume，BV），以mm3表示；骨體積分?jǐn)?shù)（Bonevolumetotissuevolumeratio，BV/TV；%）；ROI區(qū)域內(nèi)骨陷窩數(shù)（NumberofporeswithintheROI）。實(shí)施例31.骨組織染色及形態(tài)計(jì)量學(xué)分析組織標(biāo)本的處理（1）標(biāo)本固定：將新鮮的顱骨標(biāo)本沖洗干凈，放置于10%多聚甲醛溶液中浸泡48h；（2）標(biāo)本脫鈣：將固定后的顱骨放入裝有10%EDTA脫鈣液（pH7.4）的容器內(nèi)，常溫下脫鈣3周，每3天換液。判斷脫鈣成功的方法：注射器針頭可無阻力穿過顱骨，即為脫鈣成功；（3）標(biāo)本沖洗：脫鈣成功后，將標(biāo)本置于流水下沖洗2h，以徹底去除脫鈣液成分；（4）標(biāo)本脫水：將沖洗干凈后的標(biāo)本室溫下分別通過50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ處理1h進(jìn)行脫水；（5）透明：室溫下將標(biāo)本分別浸泡于二甲苯無水乙醇混合液（1：1）30min，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min。在處理過程中應(yīng)注意觀察標(biāo)本透明程度，待標(biāo)本完全透明后即可進(jìn)入下一步；（6）浸蠟：選用無色透明石蠟（Leica），在融蠟箱中融化，保持溫度在58-60℃。將標(biāo)本依次經(jīng)過純蠟/二甲苯（1/2），純蠟/二甲苯（1/1），純蠟/二甲苯（2/1），石蠟Ⅰ，石蠟Ⅱ，各1.5h；（7）包埋：將融化的石蠟倒入準(zhǔn)備好的包埋盒內(nèi)，將顱骨冠狀位切面朝下按于包埋盒底部，待石蠟?zāi)毯笸瞥鱿瀴K，制成固體蠟塊；（8）切片、展片、烤片：將蠟塊修整成梯形，用石蠟切片機(jī)將樣品切成厚度約5μm的連續(xù)切片，正面放入43±2℃水浴中展片，用經(jīng)過防脫片處理的載玻片撈片。常溫放置24h后，將玻片放入烤箱（60℃）內(nèi)烘烤4h。2.蘇木素-伊紅染色（Hematoxylinandeosinstaining,H&E）H&E染色是最常用的染色方法，本研究采用H&E染色觀察顱骨表面大體變化，分析炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及骨質(zhì)破壞程度。具體操作步驟如下：（1）每個(gè)樣品選擇5張連續(xù)切片，放入烤箱（60℃）內(nèi)烘烤30min；（2）石蠟切片經(jīng)二甲苯（15min×2次）脫蠟后，依次經(jīng)過無水乙醇，無水乙醇，95%乙醇，95%乙醇，90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇各5min，去離子水沖洗；（3）蘇木素染色3-5min，去離子水沖洗；（4）1%鹽酸酒精分化20s，1%氨水返藍(lán)30秒，去離子水沖洗；（5）l%伊紅溶液復(fù)染5min，自來水沖洗5min，去離子水沖洗1min；（6）常規(guī)脫水、透明（75％乙醇5min，90％乙醇5min，95%乙醇5min，無水乙醇5min，二甲苯透明10min×2次）；（7）用吸水紙擦去樣品周圍多余的二甲苯，在保持樣品濕潤(rùn)的情況下滴加中性樹膠，加蓋玻片封片；（8）Axioimager.M1正置顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）觀察顱骨的形態(tài)學(xué)變化，于10×條件下攝片，顱骨的ROI區(qū)域位于拍攝的中央。用顯微鏡計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Image-Proplus6.0），參照Nich和Dempster等報(bào)道的方法計(jì)算顱骨厚度（Bonethickness，BT；mm）以及骨溶解面積（Boneerodedsurface，BES；mm2）。3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色（Tartrate-ResistantAcidPhosphataseStaining，TRAP）抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨細(xì)胞特有的一種酶，常被用來鑒定成熟的破骨細(xì)胞。采用Sigma公司的TRAP染色試劑盒（387A）染色后，成熟的破骨細(xì)胞呈紫紅色。具體染色方法如下：3.1染色液的配制按照說明書步驟配制TRAP染色液，每次染色時(shí)染色液均需新鮮配置。表1：TRAP染色液試劑體積雙蒸水（加熱至37℃）360mlFastGarnetGBCBase溶液（重氮化的副品紅）4mlSodiumNitriteSolution（亞硝酸鈉）4mlNaphtholAS-BI磷酸鹽溶液4ml醋酸鹽溶液16ml酒石酸鹽溶液8ml3.2染色步驟（1）每個(gè)樣品選擇5張連續(xù)切片，放入烤箱（60℃）內(nèi)烘烤30min；（2）石蠟切片經(jīng)二甲苯（15min×2次）脫蠟后，依次經(jīng)過無水乙醇，無水乙醇，95%乙醇，95%乙醇，90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇各5min，雙蒸水沖洗；（3）用吸水紙擦干樣品周圍的水漬，將切片放入丙酮溶液中固定30s；（4）雙蒸水沖洗2min；（5）將玻片放入暗盒內(nèi)，加入新鮮配制的TRAP染液，染液需完全覆蓋切片，37℃水浴鍋避光孵育1h；（6）雙蒸水沖洗2min×3次；（7）蘇木素復(fù)染2min；（8）自來水沖洗，晾干，中性樹膠封片。Axioimager.M1正置顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）觀察，于20×條件下攝片，顱骨的ROI區(qū)域位于拍攝的中央。由于在骨組織中鑒定成熟破骨細(xì)胞比較困難，采用Sawyer建立的方法，運(yùn)用顯微鏡計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Image-Proplus6.0）計(jì)算ROI區(qū)域內(nèi)成熟破骨細(xì)胞數(shù)量及破骨細(xì)胞/骨表面積百分比（percentageofosteoclastsurfaceperbonesurface，OcS/BS，%）。4.免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)染色（Immunohistochemistry，IHC）技術(shù)檢測(cè)顱骨ROI區(qū)域堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP），成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix，骨鈣蛋白（osteocalcin,OCN），β-連環(huán)蛋白（β-catenin），DKK1，核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand，RANKL)以及骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的表達(dá)變化。具體操作步驟如下：（1）選用Leica公司的防脫玻片，每個(gè)樣品切5張連續(xù)切片，厚5μm；（2）設(shè)置烤箱溫度在60℃，烤片45min，使切片緊密粘附于玻片上；（3）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水（二甲苯（15min×2次）脫蠟后，依次經(jīng)過無水乙醇，無水乙醇，95%乙醇，95%乙醇，90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇各5min，雙蒸水沖洗）；（4）3%的過氧化氫與甲醇按1：50體積比混合，室溫浸泡切片15min，滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，雙蒸水沖洗5min×3次；（5）配制枸櫞酸鹽（Sigma）緩沖液，10mmol/L，pH=6.0，煮沸后將切片加入，維持煮沸狀態(tài)15min×2次；（6）雙蒸水沖洗，降至室溫；（7）滴加正常馬血清封閉30min，保持切片濕潤(rùn)，不必清洗；（8）滴加一抗工作液（ALP,1:500；Osterix,1:100；DKK1：1：500；OCN：1：800；RANKL,1:500；OPG,1:200;TNF-α,1:500；IL-1β,1:500；IL-6,1:600；抗體均購(gòu)自Abcam公司），4℃孵育過夜，雙蒸水沖洗5min×3次；（9）滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG，室溫靜置30min，雙蒸水沖洗5min×3次；（10）滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫靜置30min，雙蒸水沖洗5min×3次；（11）加入DAB顯色液避光顯色5min，流水沖洗終止反應(yīng)；（12）加入IHC專用蘇木素染液復(fù)染1min，流水沖洗2min；（13）梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；（14）Axioimager.M1正置顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）觀察，細(xì)胞漿或細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕（褐）黃色顆粒為陽性細(xì)胞，在顯微鏡下隨機(jī)選取ROI區(qū)域內(nèi)10個(gè)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。實(shí)施例4采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）檢測(cè)外周血中RANKL、OPG、OCN、I型膠原羧基末端肽（C-terminaltelopeptideoftypeIcollagen，CTX）、I型前膠原氨基端肽（N-terminalpropeptideoftypeIprocollagen，P1NP）以及顱骨體外培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和和IL-6的含量。具體操作步驟如下：（1）配制標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)說明書以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，室溫放置10min；（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定所需板孔數(shù)目，并增加1孔作為空白顯色液孔；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量2次；（3）取100μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次加入標(biāo)準(zhǔn)孔中，1孔加入稀釋液作為0孔；（4）取50μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入樣品空中，再加入50μl樣品稀釋液，混勻；（5）在待檢測(cè)孔中加入50μl生物素結(jié)合的抗TNF-α或其它抗體，37℃反應(yīng)120min；（6）棄反應(yīng)液體，PBS清洗5次，甩去多余液體；（7）在檢測(cè)孔中加入100μlStreptavidin-HRP工作液，顯色劑空白空除外，37℃孵育30min；（8）棄反應(yīng)液，PBS清洗4次，甩去多余液體并在吸水紙上拍幾下；（9）在每孔中加入100μl顯色液，37℃避光孵育30min；（10）在每孔中加入100μl終止液，終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀（Bio-Rad）450nm波長(zhǎng)處讀取每孔的吸光讀，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用曲線擬合計(jì)算出待測(cè)樣品中各因子的含量，每個(gè)指標(biāo)由兩名研究者獨(dú)立重復(fù)測(cè)量三次，取平均值。應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS，Chicago，IL，USA)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Tukeypost-hocpairwise分析，統(tǒng)計(jì)運(yùn)算前所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例51.小鼠基本情況各組小鼠均在手術(shù)后0.5～1.0h內(nèi)蘇醒，能正?；顒?dòng)、飲水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)過程中切開無紅腫、滲出等改變，均一期愈合。藥物治療組小鼠對(duì)Mel耐受性好，體重增加明顯；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，無1例小鼠死亡。2.褪黑素抑制鈦顆粒引起的炎癥反應(yīng)H&E染色結(jié)果顯示鈦顆粒植入部分可見炎癥反應(yīng)明顯，有大量的巨噬樣細(xì)胞浸潤(rùn)，骨連續(xù)性中斷，Mel治療組骨膜內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥反應(yīng)減輕，骨破壞程度得到改善，且抑制作用呈劑量依賴性（圖1）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和IL-6陽性表達(dá)定位于胞漿，呈棕黃色，Vehicle組骨溶解處炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6深染區(qū)域明顯增多。ImagePro-Plus6.0軟件計(jì)量結(jié)果顯示Vehicle組TNF-α、IL-1β、IL-6陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p<0.05，**p<0.01）；而經(jīng)褪黑素治療后，上述因子的表達(dá)明顯減少，且抑制作用呈劑量依賴性（圖2）。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示（表2），顱骨體外24h后，Vehicle組上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量分別為241.35±52.36pg/ml、181.45±41.26pg/ml、172.52±15.29ng/ml，與Sham組（113.36±21.08pg/ml、96.45±23.58pg/ml、121.24±18.46ng/ml）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；Mel治療組顱骨培養(yǎng)上清液中炎癥因子的表達(dá)顯著減少，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。表2：褪黑素對(duì)顱骨體外培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)的影響（，n=5）ShamVehicleLow-MelHigh-MelTNF-α(pg/ml)113.36±21.08241.35±52.36*162.45±24.67*#138.62±19.87#IL-1β(pg/ml)96.45±23.58181.45±41.26*123.50±18.56*#104.23±12.17#IL-6(ng/ml)121.24±18.46172.52±15.29*151.26±14.18*119.25±11.18#注：與Sham組比較，*p<0.05；與Vehicle組比較，#p<0.05。3.褪黑素抑制鈦顆粒引起的炎癥性骨破壞給藥兩周后，每組5只小鼠顱骨行micro-CT檢測(cè)。結(jié)果顯示鈦顆粒植入后小鼠表面蟲蝕樣破壞明顯；經(jīng)腹腔注射Mel治療后，顱骨表面的蟲蝕樣破壞明顯減輕，提示Mel能夠減輕鈦顆粒引起的骨破壞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Mel治療后，小鼠顱骨表面骨陷窩數(shù)明顯減少，骨密度（BMD）、骨體積（BV）和骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）顯著增加，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，p<0.05）。4.褪黑素抑制破骨細(xì)胞性骨吸收破骨細(xì)胞是介導(dǎo)磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的直接效應(yīng)細(xì)胞。TRAP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sham組僅少量、散在點(diǎn)狀陽性改變，鈦顆粒植入后顱骨溶解側(cè)可見大片連續(xù)的紫紅色深染區(qū)域；Low-Mel和High-Mel組僅在顱骨溶解邊緣有少量陽性區(qū)域。骨組織計(jì)量學(xué)分析結(jié)果顯示，與Vehicle組比較，Low-Mel和High-Mel組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)分別下降了35.78±6.76%和44.83±10.37%，OCs/BS分別降低了50.14±15.70%和72.76±9.84%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，p<0.05）。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，Vehicle組骨吸收指標(biāo)CTX的含量明顯增加，與Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Mel治療后，CTX的表達(dá)變化不顯著，與Vehicle組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3，p>0.05）。表3:褪黑素對(duì)血清中CTX、P1NP、OCN、RANKL、OPG和RANKL/OPG比值的影響（，n=5）ShamVehicleLow-MelHigh-MelCTX35.76±1.9453.58±4.30*51.77±2.9955.15±2.61P1NP35.65±1.7942.58±4.87*54.17±4.31#62.21±2.48#OCN59.93±2.2840.76±4.53*51.66±3.35#63.02±4.03#RANKL157.33±5.47161.12±9.06129.83±12.51#99.17±9.83#OPG2130.33±139.122640.00±247.27*3376.17±208.61#3650.33±193.65#RANKL/OPG0.07±0.010.06±0.01*0.05±0.01#0.03±0.01#注：與Sham組比較，*p<0.05；與Vehicle組比較，#p<0.05。5.褪黑素促進(jìn)骨溶解局部新骨形成成骨細(xì)胞骨形成能力降低是磨損顆粒引起骨溶解的主要病理改變之一。在本研究中，采用免疫組織化學(xué)染色的方法發(fā)現(xiàn)，在鈦顆粒引起的骨溶解局部成骨細(xì)胞骨形成相關(guān)指標(biāo)堿性磷酸酶（ALP）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix和骨鈣蛋白（OCN）陽性表達(dá)區(qū)域有減少；Mel治療后，ALP、Osterix和OCN陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5，p<0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)血清中骨形成指標(biāo)骨鈣蛋白（OCN）和I型前膠原氨基端肽（P1NP）來評(píng)價(jià)Mel對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解局部新骨形成的影響。結(jié)果如表3所示在Vehicle組，血清中OCN的含量為（40.76±4.53）ng/ml，與Control組（59.93±2.28）ng/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；而P1NP在兩組中的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。經(jīng)Mel治療后，P1NP和OCN的含量均顯著增加，與Vehicle組比較，H-Mel組（50mg/kg/d）P1NP增加了46.1%，OCN增加了54.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。6.褪黑素對(duì)RANKL/OPG表達(dá)的影響RANKL/OPG是調(diào)控磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的關(guān)鍵信號(hào)通路。進(jìn)一步探討Mel干預(yù)對(duì)RANKL和OPG在骨溶解局部及外周血中表達(dá)的影響。ELISA結(jié)果顯示，與Sham組比較，Vehicle組血清中OPG的含量增加了23.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），而RANKL的含量增加不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。經(jīng)Mel治療2周后，血清中OPG的含量顯著上升，與Vehicle組比較，OPG的含量在Low-Mel和High-Mel組分別增加了27.9%和38.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。與此相反，Mel治療后，RANKL的含量顯著減少，與Vehicle組比較，Low-Mel和High-Mel組RANKL的含量分別減少了19.4%和38.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Vehicle組RANKL/OPG比值為0.06±0.01，與Sham組（0.07±0.01）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；而Low-Mel和High-Mel組RANKL/OPG比值分別為0.05±0.01和0.03±0.01，與Vehicle組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3；p<0.05）。采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)RANKL和OPG在鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解局部的表達(dá)，結(jié)果表明Vehicle組RANKL棕黃色深染區(qū)域明顯增多，顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果顯示RANKL陽性細(xì)胞數(shù)比Sham組增加了3.7倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；OPG陽性細(xì)胞數(shù)在Vehicle組僅略有增加，與Sham組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。Mel治療組RANKL和OPG的表達(dá)均受影響，染色結(jié)果表明Low-Mel和High-Mel組RANKL陽性細(xì)胞明顯減少，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；而OPG的表達(dá)顯著增多，與Vehicle組比較，Low-Mel和High-Mel組OPG陽性細(xì)胞數(shù)分別增加了12.6%和52.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6；p<0.05）。7.褪黑素調(diào)控β-catenin和DKK1的表達(dá)Wnt/β-catenin是調(diào)控骨形成的關(guān)鍵信號(hào)通路，采用免疫組織化學(xué)染色的方法發(fā)現(xiàn)，鈦顆粒植入后，小鼠顱骨局部?jī)H有較弱的β-catenin陽性的免疫反應(yīng)，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制因子DKK1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示骨溶解局部Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性被抑制。Mel治療后，β-catenin深染區(qū)域明顯增多，而DKK1陽性細(xì)胞數(shù)減少，與Vehicle組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7；p<0.05）。綜上實(shí)驗(yàn)表明，褪黑素能夠抑制炎癥因子表達(dá)，減輕磨損顆粒引起的炎癥反應(yīng)；調(diào)控RANKL/OPG，抑制破骨細(xì)胞性骨吸收，減輕磨損顆粒引起的骨質(zhì)破壞；活化骨溶解局部Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)骨溶解局部新骨形成。褪黑素在假體松動(dòng)及其它骨溶解性疾病的治療中具有較好的應(yīng)用前景。當(dāng)前第1頁1 2 3