本發(fā)明涉及植物化學(xué)及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及中藥苦參的多種有效單體成分在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。持續(xù)性的心肌缺血可導(dǎo)致心肌壞死、心律失常、心力衰竭，是造成患者死亡的直接原因之一。缺血性心臟病具有發(fā)病急、進(jìn)展快、危害大的特點(diǎn)，因此，尋找防治缺血性心臟病的措施及藥物是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前保護(hù)心臟，減少心肌缺血損傷最有力的方法是缺血預(yù)適應(yīng)，但因倫理道德及使用不便等原因限制其臨床運(yùn)用。隨著對缺血預(yù)適應(yīng)本質(zhì)、特點(diǎn)和作用機(jī)理的不斷認(rèn)識和研究，人們期望用藥物代替缺血刺激，促使機(jī)體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活機(jī)體保護(hù)機(jī)制而產(chǎn)生心臟對缺血、缺氧的耐受。隨著人們回歸自然熱潮的興起，從天然植物和中藥中挖掘和開發(fā)低毒高效，治療和保護(hù)缺血心肌的藥物已成為研究熱點(diǎn)。

苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效?？鄥儆谇鍩崴幹械那鍩嵩餄袼帲糜跓崃?，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙癢，疥癬麻風(fēng)；其主要藥理作用有抗心肌纖維化，抗心律失常，抗腫瘤，抗炎，抗病原微生物，抗肝損傷以及對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用等，已廣泛應(yīng)用于心血管病的防治。

苦參化學(xué)成分主要為生物堿和黃酮類化合物。近年研究證明苦參黃酮類成分具有廣泛的藥理作用，包括抑菌、抗心律失常、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗瘧、降糖、神經(jīng)保護(hù)等(中成藥，2016，38(5)：1119-1123；吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34(3)：222-224)；此外還發(fā)現(xiàn)苦參總黃酮具有抗心肌纖維化的作用(中草藥，2015，46(20)：3055-3059；中藥藥理與臨床，2013，29(4)：76-78)，是苦參治療心臟相關(guān)疾病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

盡管苦參總黃酮具有心肌保護(hù)活性，但苦參酮、降苦參酮、苦參醇A 3種化合物的心肌保護(hù)活性至今未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供苦參有效成分在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，提供一種一類二氫黃酮化合物在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下，

其中，R₁表示R₂表示取代基為任意位置的-OCH3或-OH中的一個(gè)或兩個(gè)；R₃表示取代基為任意位置的一個(gè)或兩個(gè)-OH。

進(jìn)一步的，提供一種一類二氫黃酮化合物在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下，

其中，R₁表示R₂表示-OCH3或-OH；R₃表示取代基為-H或-OH。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所研究的3種化合物涉及苦參中分離、制備得到的3種二氫黃酮成分，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下，可從天然藥物中分離制備得到，也可通過化學(xué)合成制備得到。

(化合物1)苦參酮：

(化合物2)降苦參酮：

(化合物3)苦參醇A：

本發(fā)明通過考察化合物對缺氧/復(fù)氧致?lián)p傷的乳鼠原代心肌細(xì)胞存活率的影響，以及對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響，首次發(fā)現(xiàn)苦參酮、降苦參酮、苦參醇A具有心肌保護(hù)作用。

本發(fā)明通過考察化合物對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響，首次發(fā)現(xiàn)苦參酮、降苦參酮、苦參醇A 3個(gè)化合物的組合具有心肌保護(hù)作用。

本發(fā)明通過藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦參中3個(gè)單體成分及其組合的心肌保護(hù)藥理活性，能用于制備具有相應(yīng)作用的藥物，有利于進(jìn)行新型心肌保護(hù)藥物的研發(fā)。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明可用于制備鎮(zhèn)痛抗炎藥物的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，以下通過具體實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來作進(jìn)一步的闡釋。以下實(shí)施例均為說明性的，并不對本發(fā)明做任何限定。

實(shí)施例1：受試單體化合物對缺氧/復(fù)氧致?lián)p傷的乳鼠原代心肌細(xì)胞存活率的影響

1材料、試劑及儀器

1.1動物

SD乳鼠(<24h)，SPF級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證編號：11400700074853。

1.2主要材料與試劑

受試化合物對照品(苦參酮、降苦參酮、苦參醇A、葛根素)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；WST-8試劑盒(北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司)；0.06％胰蛋白酶(美國Gibco公司)；0.06％Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu，美國Invitrogen公司)；雙抗(青霉素/鏈霉素，北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司)。

1.3主要儀器

5％CO₂培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；酶標(biāo)儀(M5，美國Molecular Devices公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Costar公司)。

2.方法

2.1受試樣品溶液配制

取各受試化合物對照品適量溶于DMSO，取DMSO溶解的受試樣品用生理鹽水稀釋到所需要濃度。

2.2乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

乳鼠酒精消毒，開胸剪下心室。置于預(yù)冷PBS液中洗凈余血。將心肌剪碎成1mm³，置于酶中消化(膠原酶與胰酶1:1，終濃度為0.06％)，放入轉(zhuǎn)子機(jī)械攪拌加速消化。

第一次消化約5min，棄去消化液。從第二次消化開始收集消化液，每次5min，取上清至完全培養(yǎng)基中終止消化，共收集7次。800rpm離心3min收集細(xì)胞。20％胎牛血清D/F12培養(yǎng)基(終濃度100μM Brdu，100UI雙抗)重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)至培養(yǎng)皿中，進(jìn)行差速貼壁生長(成纖維細(xì)胞先貼壁，心肌細(xì)胞貼壁較慢)。

培養(yǎng)1.5h后收集細(xì)胞懸液(未貼壁細(xì)胞)，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種0.2mL/孔于96孔培養(yǎng)板，置5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后倒置顯微鏡下可見孔內(nèi)心肌細(xì)胞有規(guī)律的集體跳動即培養(yǎng)成功。每2-3天更換新鮮的20％胎牛血清D/F12培養(yǎng)基(終濃度100μM Brdu，100UI雙抗)，細(xì)胞可在14天內(nèi)保持活力用于實(shí)驗(yàn)。

2.3建模及給藥

更換N₂飽和的PBS緩沖液，放入三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱，缺氧2h，更換完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入樣品，5％CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧1h。同時(shí)設(shè)定正常組(細(xì)胞+生理鹽水，5％CO₂正常培養(yǎng)3h)，模型組(細(xì)胞+生理鹽水，方法同建模)和空白組(無細(xì)胞+生理鹽水)。

2.4細(xì)胞存活率測定(CCK-8法)

更換100μL/孔無血清培養(yǎng)基，加10μl/孔CCK-8原液，5％CO₂培養(yǎng)箱中共孵育2h，450nm處測定吸光度。

2.5計(jì)算與統(tǒng)計(jì)

細(xì)胞存活率(活細(xì)胞相對數(shù)量％)＝A(加藥)-A(空白)/A(0加藥)-A(空白)×100；

SPSS17.0軟件計(jì)算并統(tǒng)計(jì)，ANOVA單因素方差分析顯著性差異(P<0.05)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

化合物對缺氧/復(fù)氧致?lián)p傷的乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響如表1。葛根素(陽性對照)可發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著提高缺氧/復(fù)氧致?lián)p傷的心肌細(xì)胞存活率，說明細(xì)胞病理模型可靠；同葛根素一樣，苦參酮、降苦參酮及苦參醇A 3種化合物均可顯著提高缺氧/復(fù)氧致?lián)p傷的心肌細(xì)胞存活率，表明該3種化合物均有心肌保護(hù)活性。

表1受試化合物對缺氧/復(fù)氧致?lián)p傷的乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(n＝3，)

與模型組比較，*P<0.05。

實(shí)施例2：受試單體化合物對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響

1材料、試劑及儀器

1.1動物

健康雄性Wistar大鼠48只，體重200±20g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前，所用動物均進(jìn)行一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，動物自由取食，自由飲水。飼養(yǎng)室內(nèi)保持安靜，室內(nèi)溫度維持在23–25℃，濕度55％～75％，日光燈照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗。

1.2主要材料與試劑

受試化合物對照品(苦參酮、降苦參酮、苦參醇A)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；地奧心血康軟膠囊購自成都地奧制藥集團(tuán)有限公司；伊文思藍(lán)(Evans blue)和氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma公司。

1.3主要儀器

HX–200動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)，BL–420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、YPJO1型壓力換能器(成都醫(yī)療儀器廠)，image–pro plus 7.0圖像分析軟件(太原塞恩思科技發(fā)展有限公司)。

2.方法

2.1分組與給藥方法Wistar大鼠，隨機(jī)分成6組，每組6只，即假手術(shù)組(生理鹽水)、缺血再灌注損傷組(生理鹽水)、地奧心血康組(70mL/kg)、苦參酮組(50mg/kg)、降苦參酮組(50mg/kg)、苦參醇A組(50mg/kg)；各組大鼠均以10mL/kg的劑量灌胃給藥，連續(xù)7d，每天1次，于末次給藥1h后開始造模。

2.2建立缺血再灌注損傷模型各組大鼠以20％烏拉坦腹腔注射麻醉，仰臥位固定。用針形電極刺入四肢皮下，以標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電圖。頸部備皮，作縱向正中切口，分離氣管、右側(cè)頸總動脈，行氣管插管、右頸總動脈插管，接人工呼吸機(jī)通氣，頻率為60次/min，呼吸比率為2︰1，潮氣量8mL/kg(隨大鼠體重調(diào)節(jié))。于胸骨左側(cè)第三、四肋間打開胸腔暴露心臟，在肺動脈圓錐左緣與左心耳右緣之間，用6/0無損傷縫合線平左心耳下緣2mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度1～2mm，寬度2～3mm，然后將縫合線穿于自制的冠脈阻斷塑料管。除假手術(shù)組不結(jié)扎外，其他組均結(jié)扎冠狀動脈左前降支30min后，松開結(jié)扎線再灌注60min。實(shí)驗(yàn)中以心電圖ST段明顯抬高并與T波融合、心肌顏色變淺紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志；放松結(jié)扎線后ST段降低1/2以上及心肌逐漸紅潤為再灌注成功的標(biāo)志。

2.3心肌梗死面積測定將冠狀動脈左前降支原位重新結(jié)扎，于頸總動脈注入2％的伊文思藍(lán)1.5mL，待大鼠鞏膜藍(lán)染后迅速取下心臟，置于4℃生理鹽水中洗凈心腔殘余染液，剪去心底組織、心耳及右心室，錫箔紙包裹，置于–80℃保存。

將各實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟自心尖向心底平行于房室溝方向切成6片(1～1.5mm厚)。在1％TTC(37℃，pH7.4)中避光孵育15min后，用10％甲醛溶液固定48h。染成藍(lán)色的區(qū)域代表非缺血區(qū)，紅色區(qū)域代表危險(xiǎn)區(qū)(AAR)，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)(An)。拍照后利用圖像分析軟件image–pro plus 7.0分析、計(jì)算心肌梗死面積。

危險(xiǎn)區(qū)面積百分比(AAR/LV，％)＝(危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室區(qū)面積)100％

心肌梗死面積百分比(An/AAR，％)＝(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積)100％

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2，AAR/LV代表各組間冠脈結(jié)扎所致的缺血損傷程度；An/AAR表示心肌梗死面積大小。各組間AAR差異無顯著性，表明各組動物的缺血程度大體相當(dāng)，具有可比性。地奧心血康(陽性對照)可保護(hù)缺血再灌注損傷心肌，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著減小大鼠心肌梗死面積(與模型組比較，An/AAR顯著降低)，說明動物模型可靠；同地奧心血康一樣，苦參酮、降苦參酮及苦參醇A 3種化合物均可顯著減小缺血再灌注所致心肌梗死面積，說明3種化合物具有心肌保護(hù)作用。

表2受試單體化合物對心肌缺血再灌注大鼠梗死范圍的影響(n＝6)

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

實(shí)施例3：受試化合物組合對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響

1材料、試劑及儀器

材料、試劑及儀器均同實(shí)施例2。

2.方法

Wistar大鼠，隨機(jī)分成6組，每組6只，即假手術(shù)組(生理鹽水)、缺血再灌注損傷組(生理鹽水)、地奧心血康組(70mL/kg)、受試化合物組合(苦參酮︰降苦參酮︰苦參醇A＝3︰2︰1)低、中、高劑量組(15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)；各組大鼠均以10mL/kg的劑量灌胃給藥，連續(xù)7d，每天1次，于末次給藥1h后開始造模。其余方法同實(shí)施例2。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表3，AAR/LV代表各組間冠脈結(jié)扎所致的缺血損傷程度；An/AAR表示心肌梗死面積大小。各組間AAR差異無顯著性，表明各組動物的缺血程度大體相當(dāng)，具有可比性。地奧心血康(陽性對照)可保護(hù)缺血再灌注損傷心肌，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著減小大鼠心肌梗死面積(與模型組比較，An/AAR顯著降低)，說明動物模型可靠；同地奧心血康一樣，受試化合物組合中、高劑量組均可顯著減小缺血再灌注所致心肌梗死面積，說明該化合物組合具有心肌保護(hù)作用。

表3受試化合物組合對心肌缺血再灌注大鼠梗死范圍的影響(n＝6)

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。