本發(fā)明涉及莫能菌素的一種新用途，特別涉及莫能菌素在制備治療肺腺癌藥物中的應用

背景技術：

莫能菌素又稱莫能霉素、肉桂霉素和瘤胃素，是一種聚醚類離子載體抗生素。其純品為白色或白色結晶粉末，并伴有特殊臭味，易溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜等有機溶劑。分子量為670.88，分子式為C₃₆H₆₂O₁₁。化學結構式見圖1。

莫能菌素由Haney等人于1967年率先從肉桂地鏈霉菌(Streptomycescinnamonensis)的發(fā)酵液中分離得到。1971年由美國禮來公司將其推向市場，此后被廣泛用作反芻動物的飼料添加劑及抗球蟲藥物。

目前，對莫能菌素的研究主要集中在其提高反芻動物及家禽對飼料的利用率、抗蟲性及藥物殘留等方面。研究發(fā)現(xiàn)，莫能菌素能影響反芻動物瘤胃內的能量代謝，改變瘤胃的發(fā)酵類型，抑制瘤胃高效產氨菌的生長，從而減少瘤胃氨產生，提高蛋白質利用效率。此外，莫能菌素作為一種離子載體，可以有效地結合Na+、K+離子形成脂溶性絡合物，通過胞膜轉移進入球蟲體內，干擾其正常的滲透壓，從而達到抑制或殺死球蟲的目的。

鑒于目前多種抗腫瘤抗生素在臨床上的成功應用，莫能菌素也可能具有治療腫瘤的潛力，所以我們選擇莫能菌素作為研究藥物。理想的抗腫瘤藥物具有高效、低毒、能克服多藥耐藥等特點，并且能使腫瘤細胞以溫和的方式如凋亡或自噬走向死亡，而對正常細胞無毒副作用。

本發(fā)明以人的肺腺癌A549細胞為研究對象，以莫能菌素為供試藥物，來探究莫能菌素的體內外抗腫瘤作用及其初步的作用機制。通過這些研究，希望能為肺腺癌的治療提供一定的理論研究基礎，為肺腺癌的治療提供新的化療藥物。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術上的不足，本發(fā)明提供了莫能菌素的一種新用途。

本發(fā)明的技術方案如下：

莫能菌素在制備治療肺腺癌藥物中的應用。

莫能菌素提高caspase-3活性，誘導A549細胞的凋亡。

莫能菌素提高caspase-9活性，誘導A549細胞的凋亡。

莫能菌素提高caspase-4活性，誘導A549細胞的凋亡。

莫能菌素通過內質網途徑及線粒體途徑誘導A549細胞的凋亡。

以莫能菌素為活性成分，可用于制備治療肺腺癌藥物，采用藥劑學上可接受的工藝和輔料，制備成各種劑型的抗腫瘤藥物，如各種口服制劑和注射劑等。

本發(fā)明的優(yōu)點在于擴大了莫能菌素的應用范圍，為莫能菌素在治療肺腺癌藥物的制備上提供了支持。

附圖說明

圖1是莫能菌素的化學結構式。

圖2是不同監(jiān)測點的裸鼠腫瘤體積。

圖3是吉姆薩染色觀察細胞凋亡（48h）。

圖4是不同作用時間莫能菌素對A549細胞生長的抑制作用。

圖5是透射電鏡觀察結果（48h）。

圖6是莫能菌素作用48h后細胞內caspase-3酶活性測定。

圖7是莫能菌素作用48h后細胞內caspase-4酶活性測定。

圖8是莫能菌素作用48h后細胞內caspase-9酶活性測定。

圖9是莫能菌素作用48h后細胞內caspase-8酶活性測定。

圖10是caspase酶抑制劑對莫能菌素誘導的A549細胞凋亡的影響，其中A．對照，B．3.6uM莫能菌素處理，C．3.6uM莫能菌素+Z-VAD-FMK(pan-casp)處理，D．3.6uM莫能菌素+Z-DEVD-FMK(casp.3)處理，E．3.6uM莫能菌素+Z-LEHD-FMK(casp.9)處理，F(xiàn)．3.6uM莫能菌素+Z-LEVD-FMK(casp.4)處理，G．3.6uM莫能菌素+Z-IETD-FMK(casp.8)處理。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1 肺腺癌A549細胞的培養(yǎng)

選用人非小細胞肺腺癌A549細胞作為實驗細胞，運用含有10%的新生牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實施例2 莫能菌素的體內抑瘤實驗

將雄性裸鼠隨機分為對照組及實驗組，每組5只。用生理鹽水稀釋A549細胞至1.2×107/mL后，取0.2mL接種于每只裸鼠上肢腋下。待瘤長到約4mm×6mm大小時，對照組注射生理鹽水0.2mL/只，實驗組加入莫能菌素20mg/Kg。每隔三天測量一次瘤的直徑(A)和橫徑（B），按公式V=π/6×(A/2+B/2)3計算腫瘤體積，繪制生長曲線。

結果表明（圖2），裸鼠皮下接種人肺腺癌A549細胞，待瘤體長至4mm×6mm大小時開始加藥。從圖2中可以看出，加藥處理的第三天裸鼠腫瘤的體積就明顯小于對照組，其抑制率約為17.3%。此后，隨著藥物作用時間的延長，其抑制率逐漸增大。這表明，莫能菌素能抑制A549細胞的增殖，抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。

實施例3 吉姆薩染色實驗

實驗設置對照組和實驗組。每組設3個復孔。將滅菌處理的蓋玻片置于6孔板中。將對數生長期的A549細胞以每孔4×10⁴的密度接種于含蓋玻片的6孔板中。每孔分別加入2mL細胞懸液，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞接板24h后棄舊培養(yǎng)液。向對照組各孔中分別加入2mL細胞培養(yǎng)液；向實驗組各孔中分別加入2mL藥物濃度為1.8μM和3.6μM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，取出蓋玻片，用PBS漂洗細胞，干燥后用甲醇固定10min，用Giemsa工作液染色10min，流水沖洗掉未結合的染液，充分干燥后用二甲苯透明2min，中性樹膠封片。在普通光學顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)，并拍照保存。

結果表明（圖3），細胞經吉姆薩染色后，對照組細胞核大而均勻，被染成藍紫色或紫紅色，細胞質被染成淺藍色；經1.8μM及3.6μM莫能菌素處理48h的實驗組中，可見部分細胞核染色質凝集、趨邊，呈深紫色，且能觀察到清晰的凋亡小體。

實施例4 MTT法檢測細胞存活率

實驗設置空白組、對照組、溶劑對照組和實驗組。將對數生長期且生長狀態(tài)良好的細胞以每孔2×10³的密度接種于96孔板中。空白組加入100μL細胞培養(yǎng)液；其他各組每孔加入100μL細胞懸液。置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。接板24h后棄舊培養(yǎng)液。向空白組及對照組各孔中分別加入100μL培養(yǎng)液；向溶劑對照組各孔中加入100μL含0.2%乙醇濃度的培養(yǎng)液；向實驗組各孔中分別加入100μL藥物濃度分別是0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM的培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在藥物作用時間結束前4h，直接向每組各孔中分別加入20μLMTT貯存液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。4h后棄各孔上清液，每孔加入100μLDMSO，室溫避光震蕩15min。用空白組調零，在酶標儀570nm條件下檢測各孔的OD值，并記錄實驗結果。

計算：存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（溶劑對照組OD-空白組OD）×100%，抑制率=1-存活率。

結果表明（圖4），用濃度為0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM的莫能菌素分別處理A549細胞24h、48h、72h后，與對照組相比，細胞存活率總體呈現(xiàn)降低趨勢，并且隨著藥物作用時間的逐漸延長以及藥物濃度的逐漸增大，細胞存活率逐漸降低，即莫能菌素對A549細胞生長的抑制作用表現(xiàn)出一定的時間依賴性以及劑量依賴性。雖然0.01μM的莫能菌素處理細胞48h及72h后，細胞存活率較對照組高，但差異不顯著（P＞0.05，n﹦8）。

此外，除0.05μM莫能菌素作用細胞48h的實驗組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05，n﹦8），0.01μM、0.05μM、0.1μM莫能菌素作用細胞24h的實驗組與對照組相比差異顯著外（0.05＞P＞0.01，n﹦8），其余均差異極顯著（P＜0.01，n﹦8）。數據顯示藥物作用48h的半數抑制濃度為1.8μM。

實施例5 透射電鏡下細胞超微結構的觀察

實驗設對照組和實驗組。每組設3個平行皿。將對數生長期A549細胞以一定的密度接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后棄舊培養(yǎng)液。對照組加入培養(yǎng)液；實驗組加入含1.8μM莫能菌素的培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用48h后，胰蛋白酶消化細胞，將細胞置成單細胞懸液。離心棄上清，PBS重懸細胞，轉移至有瓊脂空槽的離心管中，離心使細胞成團，去上清，加入2.5%戊二醛固定。PBS沖洗，置于1%鋨酸中固定1h。丙酮梯度脫水，將細胞置于1:1丙酮與包埋劑混合液中置換30min，用包埋劑浸潤2h后包埋細胞。經超薄切片、乙酸鈾及檸檬酸鉛染色后，置于透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結構變化，并拍照保存。

結果表明（圖5），對照組細胞核大，核仁明顯，線粒體結構清晰；經1.8μM莫能菌素處理48h的實驗組細胞染色質凝集、彎曲呈新月形，細胞空泡化現(xiàn)象明顯。

實施例6 Caspase試劑盒檢測Caspase酶活性

實驗設對照組和實驗組。每組設3個平行皿。將對數生長期的A549細胞以一定的密度接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后棄舊培養(yǎng)液。對照組加入培養(yǎng)液；實驗組加入藥物濃度為1.8μM和3.6μM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用48h后，胰蛋白酶消化細胞并收集細胞。離心后棄上清，用PBS沖洗細胞后，按每200萬細胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。4℃16000g離心15min,并將上清轉移至冰浴預冷的離心管中。

結果表明（圖6、7、8、9），Caspase-3酶活性檢測試劑盒分析發(fā)現(xiàn)，經1.8μM及3.6μM莫能菌素處理A549細胞48h后，與對照組相比，在405nm處的光吸收值有了明顯的升高，且隨著藥物濃度的增大，光吸收值也逐漸升高，這表明caspase-3活性增大。凋亡執(zhí)行者caspase-3活性增大，即表明莫能菌素能誘導A549細胞走向凋亡。

Caspase-4/9酶活性檢測試劑盒分析結果與caspase-3分析結果相似，表明在A549細胞凋亡過程中，莫能菌素激活了caspase-4/9的活性，即說明內質網途徑及線粒體途徑參與了莫能菌素介導的A549細胞的凋亡。

Caspase-8酶活性檢測試劑盒分析發(fā)現(xiàn)：經1.8μM及3.6μM莫能菌素處理A549細胞48h后，與對照組相比，在405nm處的光吸收值無明顯變化，表明在莫能菌素誘導的A549細胞凋亡過程中無caspase-8參與，即膜受體途徑不參與莫能菌素介導的A549細胞的凋亡。

實施例7 細胞凋亡的ELISA檢測

實驗設對照組和實驗組。每組設3個平行皿。將對數生長期的A549細胞以一定的密度接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后棄舊培養(yǎng)液。對照組中分別加入培養(yǎng)液；不同的實驗組中加入20uM不同的caspase酶抑制劑，孵育1h后向各實驗組加入含3.6μM莫能菌素的培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用時間結束，胰蛋白酶消化細胞，將細胞制成單細胞懸液。按試劑盒說明書的操作步驟對樣品進行處理。在酶標儀405nm處測吸光度，并記錄數值。并按試劑盒說明設置反應體系，檢測Caspase酶活性。

按下述公式計算釋放到細胞質中的單或寡核苷酸小體的特異性增加量：

加強系數=加藥處理組的OD值/對照組細胞的OD值

結果表明（圖10），經3.6μM莫能菌素處理48h的實驗組與對照組相比，細胞裂解液中的核小體水平顯著增加，由3.547上升至34.4582，是對照組的9.7倍；而加入caspase酶抑制劑后，與經藥物處理的細胞相比，核小體水平有了明顯的降低，說明3.6μM莫能菌素處理細胞48h后，細胞內caspase酶活化，從而使A549細胞走向凋亡。分別加入caspase-3/9/4的抑制劑后，與經藥物處理的細胞相比，細胞裂解液中的核小體水平有了明顯的降低；而經caspase-8抑制劑處理的細胞內核小體水平無明顯變化，這說明caspase-3/9/4參與莫能菌素誘導A549細胞的凋亡，caspase-8沒有參與莫能菌素誘導A549細胞的凋亡。

以上所述僅是本專利的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本專利技術原理的前提下，還可以做出若干改進和替換，這些改進和替換也應視為本專利的保護范圍。