本發(fā)明涉及一種基于R語言的同時(shí)提取甘草中皂苷和總黃酮的優(yōu)化提取工藝。

背景技術(shù)：

甘草很早便運(yùn)用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，一般為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根及根莖，在經(jīng)過長(zhǎng)久的臨床實(shí)踐驗(yàn)證后，確認(rèn)它能緩解感冒癥狀、補(bǔ)脾益氣、有效止痛、調(diào)和各種藥效的功能，可用于治療感冒、脾胃不適、身體虛弱以四肢疼痛等癥狀，還可以緩解其它藥的毒性。起這些藥效的主要成分是三萜類和黃酮類化合物，因此這兩類物質(zhì)常常被作為研究的對(duì)象。

甘草皂苷是研究最多的甘草活性物質(zhì)，屬三萜類化合物，其中甘草酸是含量最高的皂苷類成分。具有抗病毒、抗炎、抗過敏、抗?jié)?、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用。除應(yīng)用于醫(yī)藥界外，它還被廣泛應(yīng)用于食品添加劑(主要是低熱值甜味劑)、煙草、釀造、化妝品等行業(yè)，是重要的精細(xì)化工產(chǎn)品。甘草總黃酮類化合物主要用于抗癌、抗腫瘤、抗炎癥以及抗心律失常等疾病^[3]，同時(shí)因?yàn)樗€具有較強(qiáng)的抗氧化、抑制酶的作用，所以，在食品添加劑、化妝品的原料、醫(yī)藥原料行業(yè)也都有巨大的市場(chǎng)。

R是一個(gè)有著強(qiáng)大統(tǒng)計(jì)分析及作圖功能的軟件系統(tǒng)，其使用的程序語言是S語言中的分支--R語言，具有操作簡(jiǎn)單、浮點(diǎn)運(yùn)算功能強(qiáng)大、作圖功能強(qiáng)大等特點(diǎn)。然而R語言在中醫(yī)藥方面的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。

現(xiàn)有甘草的提取方法提取效率較低，需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化研究，而且甘草黃酮和皂苷同時(shí)提取的工藝也較少，本發(fā)明利用當(dāng)今熱門的R語言技術(shù)，結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法，對(duì)甘草中的皂苷、總黃酮類化合物的同時(shí)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于R語言的同時(shí)提取甘草中皂苷和總黃酮的優(yōu)化提取工藝，利用當(dāng)今熱門的R語言技術(shù)，結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法，對(duì)甘草中的皂苷、總黃酮類化合物的同時(shí)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的提取工藝。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種基于R語言的同時(shí)提取甘草中皂苷和總黃酮的優(yōu)化提取工藝，所述工藝包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)提取條件的因素水平，以甘草提取中的不同控制參數(shù)為因子，按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件安排因子組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行提取，檢測(cè)其中的皂苷和總黃酮含量；

(2)使用R語言進(jìn)行熵權(quán)法編程，計(jì)算權(quán)重值，分別得到甘草皂苷和甘草總黃酮的權(quán)重系數(shù)，然后甘草皂苷和總黃酮的含量各自乘以其權(quán)重系數(shù)，得到綜合評(píng)價(jià)值；

(3)采用3層結(jié)構(gòu)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模，輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)為不同因子；輸出節(jié)點(diǎn)數(shù)為1個(gè)，即綜合評(píng)價(jià)值；將中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行全數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證和留一法交叉驗(yàn)證，進(jìn)行神經(jīng)元的訓(xùn)練，對(duì)不同隱層神經(jīng)元的個(gè)數(shù)進(jìn)行模型的測(cè)試訓(xùn)練，以擬合誤差和預(yù)測(cè)誤差作為對(duì)隱層神經(jīng)元選取的依據(jù)，選取最優(yōu)的隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)；

(4)采用R語言的實(shí)數(shù)編碼程序，由遺傳算法尋優(yōu)得到最佳的綜合評(píng)價(jià)值及其對(duì)應(yīng)的因子水平；

(5)、根據(jù)最優(yōu)綜合評(píng)價(jià)值對(duì)應(yīng)的控制參數(shù)因子水平，在最優(yōu)化條件下提取甘草中的皂苷和總黃酮，按照步驟(2)的權(quán)重系數(shù)計(jì)算實(shí)際綜合評(píng)價(jià)值，與網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值相比較，驗(yàn)證模型的可靠性。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中，所述以甘草提取中的不同控制參數(shù)為因子，可預(yù)先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，篩選多個(gè)提取的控制參數(shù)后，選取影響最大的幾個(gè)控制參數(shù)為因子。

進(jìn)一步，所述步驟(1)選取氨醇回流法進(jìn)行甘草提取，并進(jìn)行優(yōu)化。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)提取溶劑氨醇、回流時(shí)間、氨醇氨濃度、氨醇氨醇濃度、液固比對(duì)甘草皂苷和甘草總黃酮提取影響最大，因此以氨濃度、乙醇濃度、回流時(shí)間、液固比為四個(gè)因子，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

所述步驟(1)中，甘草提取的工藝為：稱取甘草藥材，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入氨醇溶液，在80℃下加熱回流提取，重復(fù)提取3次，放冷至室溫，抽濾，即得提取液；氨醇溶液為氨的乙醇溶液，氨醇溶液中的氨濃度、乙醇濃度、回流時(shí)間、液固比根據(jù)因子設(shè)計(jì)水平確定。

提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用適量的60％乙醇溶解，轉(zhuǎn)入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，搖勻，用0.22μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液，用分光光度計(jì)分別在252nm和510nm處檢測(cè)吸光度，與甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線或蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，分別計(jì)算得到甘草皂苷和總黃酮的含量，甘草皂苷的含量＝甘草皂苷的量/甘草生藥量，總黃酮的含量＝總黃酮的量/甘草生藥量。

進(jìn)一步，所述步驟(2)中，所述熵權(quán)法是將各個(gè)待評(píng)價(jià)單元的信息進(jìn)行量化與綜合后，對(duì)熵權(quán)值轉(zhuǎn)化為權(quán)重值。利用熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重值時(shí)，采用的數(shù)值歸一化法是數(shù)據(jù)離差標(biāo)準(zhǔn)化歸一化法。

進(jìn)一步，所述步驟(3)中，輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)為4個(gè)，分別為氨濃度、乙醇濃度、回流時(shí)間、液固比。

進(jìn)一步，所述步驟(3)中，采用留一法交叉驗(yàn)證進(jìn)行神經(jīng)元的訓(xùn)練時(shí)，初始隨機(jī)權(quán)(rang)為0.1，參數(shù)重量衰變(decay)為5×10^-3，最大迭代次數(shù)(maxit)為800，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

在采用留一法交叉驗(yàn)證進(jìn)行神經(jīng)元的訓(xùn)練時(shí)，擬合誤差和預(yù)測(cè)誤差的選取標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)選均在5％以下。

所述步驟(3)中，采用全數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證進(jìn)行神經(jīng)元的訓(xùn)練時(shí)，優(yōu)選選取擬合誤差最小時(shí)的隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)。全數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證是以正交試驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)為樣本，對(duì)不同個(gè)數(shù)的隱層神經(jīng)元(size)進(jìn)行模型的測(cè)試訓(xùn)練。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中，綜合留一法交叉訓(xùn)練和全數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證的數(shù)據(jù)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最優(yōu)的隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為5。

本發(fā)明采用的遺傳算法是一種基于自然選擇和基因遺傳學(xué)原理的優(yōu)化搜索方法。它將“優(yōu)勝劣汰,適者生存”的生物進(jìn)化原理引入待優(yōu)化參數(shù)形成的編碼串群體中,按照一定的適配值函數(shù)及一系列遺傳操作對(duì)各個(gè)個(gè)體進(jìn)行篩選從而使適配值高的個(gè)體被保留下來,組成新的群體，新群體中個(gè)體適應(yīng)度不斷提高，直到滿足一定的極限條件，得到最優(yōu)解。

本發(fā)明采用R version 3.1.1軟件、熵權(quán)法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型代碼和遺傳算法rgenoud工具包進(jìn)行BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建模和遺傳算法的計(jì)算。

所述步驟(4)中，遺傳算法尋優(yōu)時(shí)，，將中心組合試驗(yàn)的各因子水平和綜合評(píng)價(jià)值輸入R語言程序，設(shè)定種群大小為800，接近的最大代數(shù)為100，最大不可變代數(shù)為10，收斂公差為1×10-3，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。本發(fā)明實(shí)施例中，運(yùn)用R語言代碼進(jìn)行編程，由遺傳算法尋優(yōu)后得到的結(jié)果如下：總共運(yùn)行了82代，運(yùn)行時(shí)間為28s，運(yùn)行到第82代時(shí)得到網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)綜合評(píng)價(jià)值為191.65，得到該結(jié)果的條件分別為：氨濃度0.62％，乙醇濃度64％，回流時(shí)間1.8h，液固比12∶1。

本發(fā)明結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法，最終得到甘草中皂苷和總黃酮的最佳提取條件為：氨濃度0.62％，乙醇濃度64％，回流時(shí)間1.8h，液固比12∶1，模型綜合評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)值為191.65，而實(shí)驗(yàn)所得的平均綜合評(píng)價(jià)值為188.90，相對(duì)誤差為1.43％，證明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法具有較好的預(yù)測(cè)性。本發(fā)明建立的數(shù)學(xué)模型尋求同時(shí)提取甘草皂苷和總黃酮最佳提取條件是科學(xué)可行的，為實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)成分乃至藥效物質(zhì)基礎(chǔ)多目標(biāo)尋優(yōu)提供了新的參考和思路。

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1

1材料、儀器及軟件

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110731-201517，含量98％)；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-201506，含量91.7％)；三氯化鋁(上海美興化工股份有限公司，分析純，批號(hào)：100401)；氫氧化鈉(上海國(guó)藥，分析純，批號(hào)：20150429)；氨水(上海國(guó)藥，分析純，批號(hào)：20140326)；亞硝酸鈉(上海國(guó)藥，分析純，批號(hào)：20150325)；甘草(寧夏，批號(hào)：150701)購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室主任黃繩武教授鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根，符合《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)范要求；水為超純水；乙醇等均為分析純。

TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；018268型電熱恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)；AG135型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；FA1004N分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)；RE-52AAA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海嘉鵬科技有限公司)；R version 3.1.1軟件、熵權(quán)法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型代碼和遺傳算法rgenoud工具包(新西蘭奧克蘭大學(xué))。

2方法與結(jié)果

2.1甘草皂苷和總黃酮測(cè)定準(zhǔn)備

2.1.1甘草酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱定甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品2.0mg，，置10ml容量瓶中，加60％的乙醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.2mg/mL甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取適量的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到甘草酸的最大吸收波長(zhǎng)在252nm處。用移液槍準(zhǔn)確移取0.2mg/mL甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于5mL容量瓶中，用60％乙醇溶液定容至刻度線，在252nm處測(cè)其吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝12.674X+0.0303，r＝0.9995，結(jié)果表明甘草酸在質(zhì)量濃度0.008-0.056mg/mL與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品2.0mg，置于10mL容量瓶中，定容至刻度線，配成濃度為0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取適量蘆丁標(biāo)曲溶液置于5mL容量瓶中，先加入5％亞硝酸鈉0.15mL，放置6min，再加入10％硝酸鋁0.15mL，放置6min，最后加入4％氫氧化鈉2.0mL，用60％乙醇定容稀釋至刻度，搖勻，靜置10-15min，使其充分顯色，最后進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)在510nm處。用移液槍準(zhǔn)確移取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL于5mL容量瓶中，依據(jù)上述顯色步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝9.4643X-0.0356，r＝0.9996，結(jié)果表明蘆丁在質(zhì)量濃度0.024-0.08mg/mL與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2甘草溶液的提取與供試品溶液的制備

稱取甘草藥材5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入醇氨溶液(0.6％氨，60％乙醇)60mL，在80℃下加熱回流提取2.5h，放冷至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，抽濾，即得提取溶液。提取溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用適量的60％乙醇溶解，轉(zhuǎn)入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，搖勻，用0.22μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.1.3精密度實(shí)驗(yàn)

取濃度為0.056mg/mL甘草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，在252nm條件下重復(fù)測(cè)定其吸光度5次，吸光度的RSD為0.170％；取濃度為0.08mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，顯色后在510nm條件下重復(fù)測(cè)定其吸光度5次，吸光度的RSD為0.162％，表明精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性測(cè)定

按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液1份，將供試液不避光，在室溫下放置0，2，4，6，8h時(shí)測(cè)定供試品溶液吸光度。在252nm處測(cè)定吸光度5次，RSD為0.884％；在510nm處測(cè)定吸光度5次，RSD為0.606％，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復(fù)性測(cè)定

稱取甘草藥材5g，共5份。按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，分別測(cè)定其吸光度。在252nm處測(cè)定5份供試品溶液，RSD為1.314％；在510nm處測(cè)定5份供試品溶液，RSD為0.678％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率測(cè)定

取已測(cè)定的同一批藥材，精密稱定甘草藥材5g，，共10份，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備提取供試品品溶液，5份分別加入0.2mg/mL甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液5mL，其余5份分別加入0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液2mL。甘草皂苷的加樣平均回收率為99.80％，RSD為1.20％；總黃酮類化合物的加樣平均回收率為99.50％，RSD為2.15％。

2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

在相關(guān)資料以及前期單因素預(yù)試驗(yàn)(因子選擇詳見后續(xù)3.1)的基礎(chǔ)上，確定影響甘草中皂苷和總黃酮提取得率的4個(gè)因素：氨濃度、乙醇濃度、回流時(shí)間、液料比。以Design expert 8.0.6軟件中Central Composite Design設(shè)計(jì)原理，因素水平表見表1,中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)見表2。

稱取甘草藥材30份，每份5g，按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件進(jìn)行提取，重復(fù)提取3次，回流提取后放冷，抽濾，濾液置于200mL的量瓶中。密封備用，得30個(gè)樣品溶液。取樣品溶液蒸發(fā)至近干，用適量的60％乙醇溶解，轉(zhuǎn)入10mL量瓶中，加60％乙醇至刻度，搖勻，用0.22μm的微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液，用分光光度計(jì)分別在252nm和510nm處檢測(cè)吸光度，與甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線或蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，分別計(jì)算得到甘草皂苷和總黃酮的含量。甘草皂苷的含量＝甘草皂苷的量/甘草生藥量，總黃酮的含量＝總黃酮的量/甘草生藥量。測(cè)定結(jié)果見表2。

表1工藝優(yōu)化因素水平表

表2中心組合設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

2.3綜合評(píng)價(jià)值的計(jì)算

使用R語言進(jìn)行熵權(quán)法編程，計(jì)算權(quán)重值，利用熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重值時(shí)，采用的數(shù)值歸一化法是數(shù)據(jù)離差標(biāo)準(zhǔn)化歸一化法。得到甘草皂苷和甘草總黃酮的權(quán)重系數(shù)分別為0.435和0.565。綜合評(píng)價(jià)值＝甘草皂苷含量×0.435+甘草總黃酮含量×0.565。結(jié)果見表2。

2.4R語言模式下的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模

本研究采用3層結(jié)構(gòu)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模，輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)為4個(gè)(氨濃度、乙醇濃度、回流時(shí)間、液固比)；輸出節(jié)點(diǎn)數(shù)為1個(gè)(綜合評(píng)價(jià)值)。30組中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依次采用留一法交叉驗(yàn)證進(jìn)行神經(jīng)元的訓(xùn)練，初始隨機(jī)權(quán)(rang)為0.1，參數(shù)重量衰變(decay)為5×10^-3，最大迭代次數(shù)(maxit)為800，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，留一法交叉驗(yàn)證后平均擬合誤差和平均預(yù)測(cè)誤差訓(xùn)練結(jié)果見表4。并且采用全數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，以30組中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為訓(xùn)練樣本，對(duì)不同隱層神經(jīng)元(size)的個(gè)數(shù)進(jìn)行模型的測(cè)試訓(xùn)練，擬合誤差結(jié)果見表3。同樣參數(shù)條件下，以擬合誤差和預(yù)測(cè)誤差作為對(duì)隱層神經(jīng)元選取的依據(jù)，不同神經(jīng)元的30組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)留一法交叉驗(yàn)證后平均擬合誤差和平均預(yù)測(cè)誤差訓(xùn)練結(jié)果見表4。

表3全數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證隱層神經(jīng)元測(cè)試訓(xùn)練結(jié)果

表4不同神經(jīng)元的30組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)留一法交叉驗(yàn)證后平均擬合誤差和平均預(yù)測(cè)誤差訓(xùn)練結(jié)果(％)

由表3可知，隨著隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)的增加，擬合誤差先減小后增大再減小，可判別出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)中的擬合過度現(xiàn)象。故初步選取隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為3、5、7。再結(jié)合表4留一法交叉驗(yàn)證結(jié)果，隱層神經(jīng)元為3時(shí)的平均預(yù)測(cè)結(jié)果劣于5和7，且超過了5％，無顯著性意義。然而隱層神經(jīng)元越多，越會(huì)脫離現(xiàn)實(shí)實(shí)際意義，且隱層神經(jīng)元5和7平均擬合誤差和平均預(yù)測(cè)誤差極為接近，且都小于5％，有顯著性意義。故綜上所述，最終選取隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為5。

2.5R語言模式下遺傳算法進(jìn)行目標(biāo)優(yōu)化

基于R語言模式下遺傳算法的基本思想，種群大小為800，接近的最大代數(shù)為100，最大不可變代數(shù)為10，收斂公差為1×10^-3，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。采用R語言的實(shí)數(shù)編碼程序，由遺傳算法尋優(yōu)后得到的結(jié)果如下：總共運(yùn)行了82代，運(yùn)行時(shí)間為28s，運(yùn)行到第82代時(shí)得到網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)綜合評(píng)價(jià)值為191.65，得到該結(jié)果的條件分別為：氨濃度0.62％，乙醇濃度64％，回流時(shí)間1.8h，液固比12∶1。

2.6提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述提取工藝條件，稱取5g甘草藥材，共3份，進(jìn)行熱回流提取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定甘草中甘草皂苷和甘草總黃酮的含量。結(jié)果見表5。由表5可知，其平均綜合評(píng)價(jià)值為188.90，網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值為191.65，實(shí)驗(yàn)測(cè)量值和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.43％。優(yōu)化后提取工藝的測(cè)量值結(jié)果與預(yù)測(cè)值吻合度較高，說明模型具有較好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)性。

表5最佳工藝下的驗(yàn)證試驗(yàn)

3分析與討論

3.1試驗(yàn)因素的選取與確定

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和藥材本身特點(diǎn)，提取溶劑、提取溫度、回流時(shí)間、回流次數(shù)、氨醇氨濃度、氨醇中乙醇濃度、液固比等均為影響甘草中甘草皂苷和甘草總黃酮提取的重要影響因素。

故對(duì)上述條件因素依次進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察了提取溶劑蒸餾水、稀氨(0.5％)、稀醇(30％)、乙醇(75％)、氨醇(含氨0.5％的30％乙醇)，提取溫度55、65、75、85、95℃，回流時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5h，回流次數(shù)1、2、3、4、5次，氨醇氨濃度0.3、0.4、0.5、0.6、0.7％，氨醇醇濃度30、45、60、75、90％，液固比8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1，發(fā)現(xiàn)提取溶劑氨醇、回流時(shí)間、氨醇氨濃度、氨醇氨醇濃度、液固比對(duì)甘草皂苷和甘草總黃酮提取影響最大，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取氨醇氨濃度0.6％、氨醇氨醇濃度60％、回流時(shí)間2h、液固比11∶1為中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。且提取溫度85℃、回流次數(shù)3次兩者再往上增加時(shí)，提取的效率增幅緩慢，從綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等角度考慮，將提取溫度和回流次數(shù)分別確定為80℃和3次。

3.2測(cè)定指標(biāo)的選取與確定

相關(guān)文獻(xiàn)記載報(bào)道，甘草中富含三萜類、黃酮類和多糖等化學(xué)成分，具有抗菌與抗病毒活性、抗氧化、保肝等作用，在中醫(yī)藥臨床中有著廣泛的應(yīng)用。大量的研究表明，甘草皂苷和黃酮類物質(zhì)是甘草中最重要的生理活性物質(zhì)，甘草皂苷具有抗炎、抗變應(yīng)性炎癥等作用，甘草黃酮類物質(zhì)具有增強(qiáng)記憶力等作用。故以甘草皂苷和甘草黃酮類化合物為典型代表，作為提取測(cè)定指標(biāo)，為甘草中有效部位的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考。

3.3模型的選取與確定

響應(yīng)面試驗(yàn)中，研究者們常采用中心組合設(shè)計(jì)(CCD)和Box-Benhnken設(shè)計(jì)(BBD)。然而在相同的因素水平條件下BBD所需的試驗(yàn)次數(shù)比CCD少，即CCD比BBD試驗(yàn)?zāi)芨玫臄M合響應(yīng)曲面，從而能得到較為全面的試驗(yàn)結(jié)果，故本研究選擇CCD試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

CCD試驗(yàn)后，響應(yīng)面軟件采用多元回歸擬合進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。然而相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，多元回歸擬合精度、效果上劣于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的組合模型。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法模型具有可以進(jìn)行多個(gè)個(gè)體同時(shí)比較，潛在的并行性，高度準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)性，魯棒性好，能充分逼近復(fù)雜的因變量與自變量之間非線性關(guān)系等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果顯示平均綜合評(píng)價(jià)值為188.90，網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值為191.65，實(shí)驗(yàn)測(cè)量值和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.43％。優(yōu)化后提取工藝的測(cè)量值結(jié)果與預(yù)測(cè)值吻合度較高，說明模型具有較好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)性。

本文采用R語言環(huán)境下神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法對(duì)CCD試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行工藝優(yōu)化和目標(biāo)尋優(yōu)，在中藥有效物質(zhì)提取工藝中的運(yùn)用還鮮有報(bào)道。該模型簡(jiǎn)單易懂、快捷、準(zhǔn)確，為甘草乃至中藥提取工藝優(yōu)化提供了新的參考和依據(jù)。