背景技術(shù)：

常規(guī)的癌癥治療鮮有治愈性的，并且可能具有顯著的副作用。這部分是由于多數(shù)化療藥物的細胞周期特異性作用機理，這使它們對于代表所有細胞周期的細胞的群體不那么有效。

細胞周期是發(fā)生于細胞中的一系列事件，其引起細胞分裂和復制。在真核細胞中，周期可以分為兩個階段：間期和有絲分裂期。細胞周期的這兩個階段之間的跨越被稱作進展或增殖。在間期，細胞生長、積累有絲分裂所需的營養(yǎng)物并復制其DNA。在有絲分裂期，細胞自己分裂為兩個不同子代細胞。間期包括3個不同階段：Gap 1(G₁)期、S期和Gap 2(G₂)期，而有絲分裂期包括兩個階段。G₁期包括細胞尺寸增大，細胞的生物合成活性增大和后續(xù)步驟中的DNA復制所需的酶的合成。S期包括DNA合成的開始和所有的染色體的復制。G₂期持續(xù)至細胞進入有絲分裂期并包括蛋白合成，包括產(chǎn)生用于有絲分裂的微管。有絲分裂期包括“細胞的染色體在兩個子代細胞之間分配”的過程和“原始細胞的細胞質(zhì)分裂形成兩個不同子代細胞”的胞質(zhì)分裂過程。細胞周期還包括靜止期，通常被稱作G₀。各個時期之間的界限，例如G₁與S期之間的界限被稱作細胞周期檢查點(checkpoint)。

細胞周期的進程可以被抑制，從而特定的細胞在進入下一個階段之前，周期停止在某個點——細胞檢查點。細胞周期檢查點位于細胞周期的不同階段，兩個檢查點在G₁與S期之間交界處(G₁/S)和G₂與M期交界處。細胞周期抑制劑能夠停止細胞進入下一個階段的進程，例如，細胞可以在G₁/S細胞周期檢查點被抑制，這迫使細胞保持在G₁期直至該抑制劑被消除。

在個體中的任何特定癌細胞群體或腫瘤中，細胞周期的長度是可變的。該可變性是由于在G₁或G₀所花的時間段是不同的，而從S期開端至M期末尾的時間長度是相對恒定的。

常規(guī)的化療處理僅打亂細胞周期的S或M期中的事件，處于細胞周期的其它階段的細胞保持相對未受傷害。例如，烷基化劑將作用于S期，而微管穩(wěn)定性或破壞性藥物則作用于M期。不幸的是，某特定的細胞在特定的時間可能不在細胞周期的S或M期。為了補償這一點，必須在長時間段內(nèi)重復施用化療藥物，以增加到達處于特定細胞周期階段的細胞的機會。這種重復施用導致受試者內(nèi)的較大劑量的有害藥物和增加的毒性。

理想的是使臨床相關(guān)的份數(shù)的細胞停滯在G₁/S細胞周期檢查點，從而可以增強化療的功效。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了用于治療哺乳動物中的疾病或病癥的方法，其包括以下步驟：施用治療上有效量的T型鈣通道抑制劑以有效減緩或停止真核細胞通過細胞周期的S、G₂和M期的進程，以增加處于G₁期的真核細胞的比例，停止施用所述T型鈣通道抑制劑一個時間段，和施用選自由至少一種化療劑的劑量、放射劑量及其組合組成的組的劑量以殺死在停止施用所述T型鈣通道抑制劑之后進展越過細胞周期的G₁期的真核細胞的比例。

附圖說明

圖1是細胞周期的示意圖。外圓圈包括間期(I)和有絲分裂(M)期，其中夸大了有絲分裂期的持續(xù)時間相對于其它階段。內(nèi)圓圈包括Gap1(G₁)、Gap 2(G₂)和合成(S)期。沒有顯示Gap 0(G₀)或靜止期。

圖2顯示了幾種化學試劑抑制鈣流入的能力與相同的化學試劑抑制細胞增殖的能力的對比。

圖3是細胞周期的示意圖以及幾種鈣通道阻斷劑對細胞周期進程的影響。

圖4是在交錯治療中測定的數(shù)據(jù)的代表性圖示。

圖5是在交錯治療中測定的數(shù)據(jù)的代表性圖示。

定義

在描述和要求保護本發(fā)明時，將根據(jù)下文給出的定義使用下列術(shù)語。

如本文使用的術(shù)語“治療”包括施用療法以預防、治愈、緩解、減少、抑制或減輕/防止與特定病癥、疾病、損失或病癥相關(guān)的癥狀。例如，治療癌癥包括腫瘤的抑制或完全停止生長，腫瘤細胞數(shù)目的減少，腫瘤尺寸的減小，腫瘤細胞向外周器官/組織浸潤的抑制，轉(zhuǎn)移的抑制，以及與病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的一定程度上的減輕。癌癥的治療也包括施用直接減少腫瘤細胞的病理或使腫瘤細胞對其它治療劑、例如放療和/或化療更易感的治療劑。如本文使用的術(shù)語“治療”包括特定病癥或病癥的預防，或與特定病癥或病癥相關(guān)的癥狀的減輕和/或預防或消除所述癥狀。

如本文使用的術(shù)語“藥學上可接受的載體、介質(zhì)或稀釋劑”包括任何標準的藥學載體，諸如磷酸鹽緩沖的鹽溶液，水，乳液諸如油/水或水/油乳液，以及多種類型的潤濕劑。該術(shù)語還包括美國聯(lián)邦政府的管理部門批準的或美國藥典中所列的用于動物包括人的任何試劑。

術(shù)語“治療上有效量”意思是本發(fā)明的化合物的緩解、減弱、減少或消除特定疾病或病癥或預防或延緩特定疾病或病癥的發(fā)作的量。

“哺乳動物”意指所有哺乳動物，包括，例如，靈長類，例如人和猴子。并且本文中包括的其它哺乳動物的實例是兔子、狗、貓、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠和馬。優(yōu)選地，哺乳動物是女人或男人。

表述“癌前病癥”是指非惡性但如果不治療可能變?yōu)閻盒缘纳L。“癌前病癥”也被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員稱作“惡病變前病癥”。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解：“T型鈣通道阻抑劑”也被稱作“T型鈣通道抑制劑”。

如本文使用的術(shù)語“細胞周期抑制劑”是指能夠減緩或停止細胞進程，或細胞停在細胞周期的一個階段、不進入細胞周期的下一階段的化合物。

如本文使用的術(shù)語“細胞毒素”是指能夠引起被該化合物影響的細胞壞死或凋亡的化合物。

具體實施方式

細胞周期的可變長度主要是由G₁期所花的時間決定的。因此，群體中的任何特定細胞將停留在G₁一段時間，然后細胞進入細胞周期的S期。為了使細胞停止而不繼續(xù)通過細胞周期檢查點，可以施用細胞周期抑制劑，包括T型鈣通道抑制劑。

首先將治療有效量的細胞周期抑制劑施用至哺乳動物以有效減緩或停止真核細胞通過細胞周期的S、G₂和M期的進程，從而增加處于G₁期與S期之間的細胞周期檢查點(G₁/S)的真核細胞的比例。哺乳動物可以是人。該方法可用于治療哺乳動物中的癌癥和癌前病癥，以及癌性和癌前腫瘤。

細胞周期抑制劑的施用引起細胞群體中的異步性進展或增殖的癌細胞隨著它們通過細胞周期而在G₁/S積累，因為它們進入S期的能力被細胞周期抑制劑阻抑。對于從G₁期經(jīng)由細胞周期檢查點進入S期的細胞，該細胞需要細胞外鈣的流入，以激發(fā)進程所需的生物化學級聯(lián)。從細胞外介質(zhì)中除掉鈣會阻斷每個細胞的細胞周期運轉(zhuǎn)。這種阻斷可以通過施用T型鈣通道抑制劑來實現(xiàn)。適宜的T型鈣通道抑制劑包括米貝拉地爾(mibefradil)、依福地平(efonidipine)、乙琥胺(ethosuxamide)、舒替尼(sutinib)、TTL-1177(專利化合物，描述于下列參考文獻：Gray，L.S.，Perez-Reyes，E.，Gomora，J.C.，Haverstick，D.M.，Shattock，M.，McLatchie，L.，Harper，J.，Brooks，G.，Heady，T.和MacDonald，T.L.(2004)Cell Calcium(細胞鈣)36，489-497)和鎳等等。因此，每個細胞保持在G₁期，只要存在細胞外的鈣，但當在沒有鈣的情況下到達G₁/S時，細胞將被鎖定不動，從而使細胞同步于G₁/S。鈣流入進細胞對于通過細胞周期的進展和跨越是必需的。在以下實施例1中進一步描述了這一點。

細胞周期抑制劑的施用增加了處于G₁/S的細胞的百分率。在該施用之后，施用至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量，所述劑量靶向殺死處于細胞周期的S期的細胞?；焺┛梢允前┌Y化療劑，細胞毒素或其組合。細胞毒素可以是烷基化劑。癌癥化療劑可以是抗代謝物或抗有絲分裂劑，并且可以選自下列實例：替莫唑胺[temozolamide(Temo)]、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、博來霉素(bleomycin)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、羥基脲(hydroxyurea)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、氨甲蝶呤(metotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(doocetaxol)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)、絲裂霉素C及其組合。至少一種化療劑的劑量可以在放射的劑量之前、之后或之中施用。放射的劑量可以在至少一種化療劑的劑量之前、之后或之中施用。首先施用細胞周期抑制劑和細胞毒素之間的時間段，允許細胞積累于細胞周期的G₁/S。該方法增加了處于S或M期的細胞的百分率，從而增加了至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量的效力，并且隨后降低了殺死預先確定數(shù)量的真核細胞所需的毒素載量。

可以在施用至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量之后，第二次施用細胞周期抑制劑，以減緩靶向的細胞或腫瘤的再生長，從而可以視需要提供進一步的劑量施用。細胞周期抑制劑的第二次施用將使一定百分率的細胞群體再次同步于G₁/S。

細胞周期抑制劑可以通過數(shù)種途徑施用，包括胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、栓劑、透皮、表面或口服。細胞周期抑制劑的口服施用是最優(yōu)選的?？诜o藥可以以劑量單元的形式施用，通常是藥丸或膠囊連同藥學上可接受的載體。

T型鈣通道抑制劑限制細胞外鈣流入進細胞，這對于多個關(guān)鍵的細胞過程是關(guān)鍵性的。這些過程所需的鈣經(jīng)由通過鈣通道的流入而來自細胞外環(huán)境?；谛蛄蟹治?、生物物理特性和藥理學敏感性，鈣通道被歸類為幾個家族。這些鈣通道被指牽涉于血壓的調(diào)節(jié)、心律和細胞增殖。研究也指出，T型鈣通道可能在年齡相關(guān)黃斑變性中具有重要作用。至少一種藥理學試劑，米貝拉地爾，已經(jīng)被證明是臨床上有效的，因為其抑制T通道的功能。鈣進入的抑制劑對于治療高血壓、心律不齊和臨床上有害的細胞增殖是有用的。

T型鈣通道存在于細胞、細胞系、尤其是癌細胞系中。具體地，T型鈣通道的Cav3.2同種型已經(jīng)被證明在日本婦女的乳腺癌組織中相對于正常的鄰近乳腺組織中異常表達，如下列參考文獻中所討論：Asaga，S.，Ueda，M.，Jinno，H.，Kikuchi，K.，Itano，O.，Ikeda，T.和Kitajima，M.(2006)Anticancer Res(抗癌研究)26，35-42。

細胞周期抑制劑有效停止或減緩真核細胞在細胞周期檢查點、包括G₁/S的進展，其在下文實施例2中進一步解釋。此外，細胞周期抑制劑的施用有效減緩疾病或病癥的生長或增值，如下文實施例3所解釋的。

在施用細胞周期抑制劑之后，有一個不添加細胞周期抑制劑的時間段。該時間段可以是大約0小時至大約336小時的范圍。該時間段允許積累于G₁/S的細胞進入細胞周期的S期。通過施用細胞周期抑制劑，大約5％至大約25％的細胞將積累于G₁/S。處于S期的細胞數(shù)目的增加使所施用的至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量更加有效，因為高百分率的細胞將被每個劑量影響。“影響”意指殺死或未殺死。

在不添加細胞周期抑制劑的時間段之后，施用至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量以殺死處于S期的細胞?！皻⑺馈币庵讣毎M行凋亡或壞死。至少一種化療劑的具體劑量、放射的劑量或二者的劑量將由本領(lǐng)域技術(shù)人員的臨床經(jīng)驗確定，其中不同的疾病由不同的劑量和不同的試劑治療。僅為舉例的目的而言，可以使用下列化療劑的劑量來治療下列疾病。在治療成膠質(zhì)細胞瘤時，可以使用細胞毒素替莫唑胺(temozolamide)。在治療黑素瘤時，可以使用細胞毒素美法侖(melphalan)或替莫唑胺。在治療胰腺癌時，可以使用細胞毒素吉西他濱(gemcitabine)。在治療乳腺癌時，可以使用細胞毒素吉西他濱。在治療結(jié)腸癌時，可以使用細胞毒素伊立替康(irinotecan)或5-氟尿嘧啶。

這種交錯治療，即，施用細胞周期抑制劑，然后施用至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量，可用于降低疾病或病癥的進展、增殖或生長，如下文實施例4和5中更詳細地解釋。在使用該交錯治療時，相比于單獨使用的化療或放射劑量，等量的至少一種化療劑的劑量、放射的劑量或二者的劑量更加有效。

實施例1

為了測定鈣流入的抑制與進展或增殖之間的對應性，將數(shù)種化學試劑的抑制鈣流入的能力針對這些試劑的抑制增殖的能力作圖，如以下圖2中可見。這些試劑是在維吉尼亞大學合成的專利化的化學實體。獲得了斜率為0.98、R²值為0.92的最小乘方相關(guān)曲線。按照慣例，相關(guān)性不能用于推斷因果關(guān)系，但在本例中，貝葉斯(Bayesian)方法是符合的，因為鈣流入對于增殖必然是由因及果的，所以阻斷鈣進入將相應地阻斷增殖。具有非常接近1的斜率的回歸線表示變量中幾乎所有的差異都由其它中的差異促成，意味著除了抑制鈣進入之外，這些試劑對于增殖沒有作用。

實施例2

使用流式細胞術(shù)和BUdR染色進行了細胞周期分析。在圖3中，“Con”代表未經(jīng)處理的對照細胞。所有其它細胞培養(yǎng)物都經(jīng)過諾考達唑(nocodazole)處理，其干擾微管的聚合并在M期阻斷細胞周期。僅以諾考達唑處理A10細胞阻斷了通過M期的細胞周期跨越，如流式細胞術(shù)所確定的。因為A10細胞主要停留在G₀與G₁之間的細胞周期檢查點(見圖3中的“Con”)，所以，評價藥理學試劑抑制該階段之外的跨越的可能性并不比確定在其它細胞周期檢查點的阻斷更直接。因此，以T型鈣通道阻斷劑米貝拉地爾(mib)、鎳(Ni)或TTL-1177(由受讓人Tau Therapeutics擁有的專利化合物)處理細胞培養(yǎng)物24小時，然后加入諾考達唑。在不存在T通道阻斷劑的效應時，細胞將被諾考達唑鎖定在G₂與M之間的細胞周期檢查點，如同單獨使用它處理細胞時發(fā)生的情況一樣。相反，以T型鈣通道阻斷劑的處理使細胞停留在G₀與G₁之間的細胞周期檢查點，并阻止了如果不這樣的話將由諾考達唑引起的在G₂與M之間的細胞周期檢查點的積累。這證明T型鈣通道阻斷劑使周期中的細胞停止在G₁/S。

實施例3

將從患者切除的胰腺癌立即移植進入裸鼠的腰窩并通過連續(xù)體內(nèi)傳代維持。移植的腫瘤以大約100mm³的體積移植，并允許生長至200至300mm³，然后啟動治療。攜帶PANC 219腫瘤的小鼠保持不予處理或以米貝拉地爾以65mg/kg p.o.b.i.d.處理(每組n＝10)。將腫瘤生長就處理開始時所測量的的尺寸進行校正。這些結(jié)果顯示于圖4中。處理組中的1只小鼠在第9天(D9)死亡，如圖4中的箭頭所示。與常規(guī)的化療藥物不同，以T型鈣通道抑制劑處理未引起腫瘤消退。相反，處理通過使腫瘤細胞停止于G₁/S而控制了腫瘤生長。

實施例4

使用D54細胞系在鼠異種移植模型中進行了人成膠質(zhì)細胞瘤的交錯治療的研究。使攜帶D54腫瘤的皮下移植物的小鼠，其被允許建立大約100mm³的體積，以米貝拉地爾以40mg/kg p.o.q.i.d.處理7天或不予處理。在第7天，所有的動物接受劑量為LD₁₀的25％的S期細胞毒素替莫唑胺，持續(xù)5天。在2天無處理之后，在最初以米貝拉地爾處理的小鼠組中再次啟動米貝拉地爾，劑量為35mg/kg p.o.q.i.d.。在第20天，僅接受替莫唑胺組的小鼠中的平均腫瘤體積是173mm³，與此對比，替莫唑胺+米貝拉地爾組小鼠中的平均腫瘤體積是102mm³(p＝0.0485；n＝10/組；Student’s匯集，雙尾t-檢驗)。在所有7個腫瘤體積測定值上進行的匯集的、雙尾Student’s t-檢驗產(chǎn)生p＝0.0329。在每個組中沒有動物由于腫瘤尺寸而被施以安樂死。沒有接受干預的對照組中的平均體積是1214mm³，有3只動物由于腫瘤尺寸而被施以安樂死。

實施例5

使用D54細胞系在鼠異種移植模型中進行了人成膠質(zhì)細胞瘤的交錯治療的進一步研究。使攜帶D54腫瘤的皮下移植物的小鼠被允許建立，以米貝拉地爾以40mg/kg p.o.q.i.d.處理7天或不予處理。在第7天，所有的動物接受劑量為LD₁₀的25％的S期細胞毒素替莫唑胺，持續(xù)5天。在2天無處理之后，在最初以米貝拉地爾處理的小鼠組中再次啟動米貝拉地爾，劑量為35mg/kgp.o.q.i.d.。在米貝拉地爾處理5天之后，再次施用替莫唑胺，持續(xù)5天，但劑量為LD₁₀的10％，因為在第一輪細胞毒素處理之后，細胞毒素已經(jīng)使20只小鼠中的6只的腫瘤變得太小以致于不能測定。結(jié)果顯示于下文圖5中。僅以替莫唑胺處理的小鼠具有156±65mm³的平均體積，而以替莫唑胺和米貝拉地爾處理的動物的腫瘤體積為70±19mm³。體積的差異表明以交錯治療的小鼠具有的腫瘤比僅以細胞毒素治療的小鼠在30天的時間里大約更小55％。在第35天，交錯組中的所有小鼠的癌癥都觸摸不到了。對于第30天和第35天的雙尾t檢驗，p＜0.0001。在第35天，非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗給出相同的p值：0.00010。這部分反映了下列事實：交錯組中的所有腫瘤都消退至不可觸到的尺寸。