相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2009年2月26日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/155,624的權(quán)益，將其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及癌癥診斷與治療的領(lǐng)域，更具體而言涉及可用于消除HER2⁺乳腺癌細(xì)胞、不表達(dá)雌激素受體、孕酮受體或HER2/neu的三陰性乳腺癌細(xì)胞、和具有干細(xì)胞樣特征的癌細(xì)胞的組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法還可用于處置轉(zhuǎn)移乳腺癌和使患者體內(nèi)的乳腺癌細(xì)胞可視化。

背景技術(shù)：

根據(jù)乳腺癌是否表達(dá)雌激素受體、孕酮受體和Her2/neu，可將其分為不同亞型。在開(kāi)始癌癥治療之前，確定患者的癌癥亞型很重要，這是因?yàn)橛行┧幬锇邢虮磉_(dá)雌激素受體的癌細(xì)胞，而另一些藥物靶向表達(dá)其他受體的癌細(xì)胞。已表明HER2/neu基因涉及哺乳動(dòng)物腫瘤發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。HER2/neu在20-30％的人乳腺癌中增多，并且HER2陽(yáng)性亞型的乳腺癌與侵襲性轉(zhuǎn)移疾病相關(guān)(Korkaya等人2008.Oncogene)。本發(fā)明通過(guò)提供可用于消除HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的新型組合物和方法，可有助于治療HER2陽(yáng)性乳腺癌。

最近鑒定了一種新的乳腺癌細(xì)胞亞型。這些癌細(xì)胞由于不表達(dá)雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu而被稱為三陰性乳腺癌細(xì)胞(Dent等人2007.Clinical Cancer Research 13：4429-4434)。如Cancer Research UK(2007)所述，三陰性乳腺癌病例在所有乳腺癌病例中占約15％。與其他已知的乳腺癌亞型相比，三陰性亞型更具侵襲性、對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療響應(yīng)更低并且與整體患者預(yù)后更差有關(guān)(Dent等人2007.Clinical Cancer Research 13：4429-4434)。因此，需要診斷和治療三陰性乳腺癌患者的組合物和方法。

近期研究表明，包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥都是由小亞群的癌干細(xì)胞(CSC)因自我更新途徑的失調(diào)而產(chǎn)生。已經(jīng)報(bào)道具有干細(xì)胞樣特征的乳腺癌細(xì)胞亞群為CD44和CD133陽(yáng)性、CD24陰性并且表達(dá)醛脫氫酶1(ALDH1)(Crocker等人2008.J Cell Mol Med)。需要鑒定和消除具有干細(xì)胞樣特征的乳腺癌細(xì)胞亞群的組合物和方法。

催乳素(“PRL”)是23-kDa的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在結(jié)構(gòu)上與生長(zhǎng)激素相關(guān)，并且以較低的程度與白介素家族的成員相關(guān)(Reynolds等人，1997，Endocrinol.138：5555-5560，Cunningham等人，1990，Science 247：1461-1465；Wells等人，1993，Recent Prog.Horm.Res.48：253-275)。催乳素受體存在于乳腺、卵巢、垂體腺、心臟、肺、胸腺、脾臟、肝臟、胰腺、腎臟、腎上腺、子宮、骨骼肌、皮膚和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)域中。Mancini T.(2008)，“Hyperprolactinemia and Prolactinomas，”Endocrinology&Metabolism Clinics of North America 37：67。當(dāng)催乳素與其受體結(jié)合時(shí)，它引起它與另一催乳素受體二聚化，從而導(dǎo)致Janus激酶2的活化，Janus激酶2是啟動(dòng)JAK-STAT路徑的酪氨酸激酶。催乳素受體的活化還導(dǎo)致有絲分裂原-活化蛋白激酶和Src激酶有絲分裂原的活化。Mancini，T.(2008).“Hyperprolactinemia and Prolactinomas，”Endocrinology&Metabolism Clinics of North America 37：67。“催乳素受體拮抗劑”是指干擾催乳素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的催乳素形式。發(fā)明人為W.Chen和T.Wagner的美國(guó)專利申請(qǐng)2007/0060520之前已描述了這種催乳素受體拮抗劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種用于抑制患者的不表達(dá)雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu的乳腺癌三陰性細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)患者施用人催乳素受體拮抗劑?？捎糜谠摲椒ǖ娜舜呷樗厥荏w拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被另一個(gè)氨基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑?？捎糜谠摲椒ǖ钠渌舜呷樗厥荏w拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被以下氨基酸中的任一個(gè)取代的那些人催乳素受體拮抗劑：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。

在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于抑制乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展的方法，所述方法包括對(duì)患者施用人催乳素受體拮抗劑?？捎糜谠摲椒ǖ娜舜呷樗厥荏w拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被另一個(gè)氨基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑。可用于該方法的其他人催乳素受體拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被以下氨基酸中的任一個(gè)取代的那些人催乳素受體拮抗劑：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。

本發(fā)明還涉及用于降低乳腺癌患者的醛脫氫酶1(ALDH1)的活性的方法，所述方法包括對(duì)患者施用人催乳素受體拮抗劑。可用于該方法的人催乳素受體拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被另一個(gè)氨基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑。可用于該方法的其他人催乳素受體拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被以下氨基酸中的任一個(gè)取代的那些人催乳素受體拮抗劑：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。

本發(fā)明還涉及用于減少乳腺癌患者的癌干細(xì)胞的數(shù)量的方法，所述方法包括對(duì)患者施用人催乳素受體拮抗劑。可用于該方法的人催乳素受體拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被另一個(gè)氨基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑?？捎糜谠摲椒ǖ钠渌舜呷樗厥荏w拮抗劑包括其中129位的甘氨酸被以下氨基酸中的任一個(gè)取代的那些人催乳素受體拮抗劑：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。本發(fā)明的方法中的任一個(gè)均可通過(guò)與選自毒素、放射性同位素、熒光染料和蛋白的試劑綴合的催乳素受體拮抗劑來(lái)實(shí)施。在另一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)將催乳素受體拮抗劑與化學(xué)治療劑同時(shí)施用或依次施用來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的方法。這種化學(xué)治療劑可以包括以下化合物中的任一個(gè)或它們的組合：全反式視黃酸；阿扎胞苷；硫唑嘌呤；博來(lái)霉素；卡鉑；卡培他濱；順鉑；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；道諾霉素；多西他賽；去氧氟尿苷；阿霉素；表柔比星；埃博霉素；依托泊苷；氟尿嘧啶；吉西他濱；羥基脲；伊達(dá)比星；伊馬替尼；氮芥；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；米托蒽醌；奧沙利鉑；紫杉醇；培美曲塞；替尼泊苷；硫鳥(niǎo)嘌呤；戊柔比星；長(zhǎng)春堿；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱。

可通過(guò)各種施用途徑將催乳素受體拮抗劑遞送至患者，所述各種施用途徑包括但不限于胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)或肺內(nèi)。在本發(fā)明的方法中，可以在乳腺癌切除之前和/或之后施用催乳素受體拮抗劑。

本發(fā)明還涉及定位患者體內(nèi)的癌細(xì)胞并且鑒定轉(zhuǎn)移的方法。為了實(shí)現(xiàn)該目的，將與放射性同位素、熒光染料或其他標(biāo)記試劑綴合的催乳素受體拮抗劑施用于患者，然后對(duì)該患者進(jìn)行鑒定該拮抗劑定位區(qū)域的程序?？捎糜诙ㄎ痪Y合催乳素受體的程序包括計(jì)算機(jī)斷層掃描程序、計(jì)算機(jī)斷層掃描程序、磁共振成像和核磁共振成像。

附圖說(shuō)明

圖1.用催乳素受體拮抗劑G129R治療三陰性乳腺癌細(xì)胞使ALDH1活性降低。

圖2.用催乳素受體拮抗劑G129R治療負(fù)荷HER2⁺/neu乳腺腫瘤的小鼠使腫瘤細(xì)胞的ALDH1活性降低。

圖3.用催乳素受體拮抗劑G129R治療原發(fā)HER2⁺/neu乳腺癌細(xì)胞使ALDH1活性降低。

圖4.催乳素拮抗劑G129R抑制攜帶HER2⁺/neu乳腺腫瘤的哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展。

圖5.催乳素拮抗劑G129R抑制哺乳動(dòng)物中HER2⁺/neu腫瘤的生長(zhǎng)。

圖6.催乳素拮抗劑G129R的治療抑制哺乳動(dòng)物原發(fā)和繼發(fā)腫瘤中HER2⁺/neu蛋白的磷酸化。

圖7.體內(nèi)HER2⁺腫瘤對(duì)催乳素拮抗劑G129R治療的劑量依賴性響應(yīng)。

圖8.體內(nèi)HER⁺腫瘤對(duì)催乳素拮抗劑G129R治療的時(shí)間依賴性響應(yīng)。

圖9.人催乳素的氨基酸序列。

具體實(shí)施方式

人催乳素的氨基酸序列如圖9所示。術(shù)語(yǔ)“催乳素(PRL)”在本文中指人和非人動(dòng)物形式的激素催乳素(還可見(jiàn)Cooke等人，J.Biol.Chem.，256：4007(1981)；Cooke等人，J.Biol.Chem.，225：6502(1980)；Kohmoto等人，Eur.J.Biochem.，138：227(1984)；Tsubokawa等人，Int.J.Peptide Protein Res.，25：442(1985)；Bondar等人，GenBank登錄號(hào)#X63235(1991)；Sasavage等人，J.Biol.Chem.257：678(1982)；Miller等人，Endocrinol.107：851(1980)；Li等人，Arch.Biochem.Biophys.141：705(1970)；Li，Int.J.Peptide Protein Res.，8：205(1976)；Martinant等人，Biochim.Biophys.Acta，1077：339(1991)；Lehrman等人，Int.J.Peptide Protein Res.，31：544(1988)；Li等人，Int.J.Peptide Protein Res.，33：67(1989)；Hanks等人，J.Mol.Endocrinol.，2：21(1989)；Watahiki等人，J.Biol.Chem.，264：5535(1989)；Karatzas等人，Nucl.Acids Res.，18：3071(1990)；Yasuda等人，Gen.Comp.Endocrinol.，80：363(1990)；Noso等人，Int.J.Peptide Protein Res.，39：250；Buckbinder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：3820(1993)；Takahashi等人，J Mol.Endocrinol.，5：281；Yamaguchi等人，J.Biol.Chem.，263：9113(1988)；Rentler-Delrue等人，DNA，8：261；Yasuda等人，Gen.Comp.Endocrinol.，66：280(1987)；Chang等人，GenBank登錄號(hào)#X61049(1991)；Chang等人，GenBank登錄號(hào)#X61052(1991)；Yasuda等人，Arch.Biochem.Biophys.，244：528(1986)；Kuwana等人，Agric.Biol.Chem.，52：1033(1988)；Song等人，Eur.J.Biochem.，172：279(1988)；Mercier等人，DNA 8：119(1989))。

術(shù)語(yǔ)“催乳素受體拮抗劑”是指干擾催乳素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的催乳素形式。優(yōu)選的催乳素受體拮抗劑包括其中至少一個(gè)氨基酸通過(guò)插入、缺失和/或取代而由其天然存在序列改變的催乳素。術(shù)語(yǔ)G129R指其中129位甘氨酸由精氨酸取代的例如圖9所示的催乳素受體拮抗劑。

將催乳素受體拮抗劑拮抗PRL對(duì)其受體的作用的能力定義為該變體抑制由PRL介導(dǎo)的效應(yīng)的能力。催乳素受體拮抗劑包括公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?005/0271626中描述的那些催乳素受體拮抗劑，將其內(nèi)容以引用方式整體并入本文。

在PRL和PRL變體都存在時(shí)，通過(guò)測(cè)定催乳素變體(“PRL變體”)對(duì)PRL經(jīng)由其受體發(fā)揮作用的能力進(jìn)行阻斷的能力，可以鑒定催乳素受體拮抗劑。PRL經(jīng)由其受體發(fā)揮作用的能力可通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖的變化以及MAP-激酶和HER2/neu信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中下游靶標(biāo)的磷酸化/活化來(lái)測(cè)定。

可以將其中129位的甘氨酸殘基被另一個(gè)氨基酸替換的催乳素變體用于本發(fā)明的方法中。以縮寫(xiě)形式G 129*(其中*是除甘氨酸之外的天然存在或合成氨基酸)表示的該取代可以是天然存在序列的唯一變化，也可以是多個(gè)改變(包括其他氨基酸的插入、缺失和/或取代)中的一個(gè)。取代氨基酸可以是中性-極性氨基酸，例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸；中性非極性氨基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸；酸性氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；以及堿性氨基酸，例如精氨酸、組氨酸或賴氨酸。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，hPRL的129位甘氨酸可以被纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該取代是以精氨酸替換129位甘氨酸(G129R)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了其中129位甘氨酸缺失的催乳素變體。

可以將催乳素受體拮抗劑與作為融合蛋白一部分的另一蛋白連接。例如，可將催乳素拮抗劑與白介素2、綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶或選自例如美國(guó)專利7,425,535所述的那些蛋白的孔形成蛋白連接。在另一實(shí)施方式中，催乳素受體拮抗劑與化合物綴合。這種化合物包括、但不限于熒光染料、放射性同位素或細(xì)胞毒素，所述細(xì)胞毒素例如能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡的小分子。

本發(fā)明的催乳素受體拮抗劑可通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。通常，可通過(guò)以下方式制備PRL的cDNA：利用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，以從產(chǎn)生PRL的細(xì)胞(例如垂體細(xì)胞)制備的RNA或cDNA為模板，根據(jù)已知PRL核酸或氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。制備編碼HPRL的cDNA的非限制性實(shí)例如公開(kāi)的美國(guó)專利7,115,556(Wagner等人)所述。然后可隨機(jī)或通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)赑RL cDNA中引入改變。

在通過(guò)重組技術(shù)制備催乳素受體拮抗劑的時(shí)候，可以將編碼PRL變體的核酸引入表達(dá)載體，并可操縱地連接于合適的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列。表達(dá)載體還可以含有一個(gè)或多個(gè)輔助PRL變體表達(dá)的元件，包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、多聚腺苷酸位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、信號(hào)序列等。合適的表達(dá)系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、粘液菌、和包括轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在內(nèi)的生物體。適合的表達(dá)載體包括單純皰疹病毒類載體如pHSV1(Geller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：8950-8954(1990))；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如MFG(Jaffee等人，Cancer Res.53：2221-2226(1993))，特別是莫洛尼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如LN、LNSX、LNCX、LXSN(Miller和Rosman，Biotechniques，7：980-989(1989))；牛痘病毒載體如MVA(Sutter和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10847-10851(1992))；腺病毒載體如pJM17(Ali等人，Gene Therapy 1：367-384(1994)；Berker，Biotechniques 6：616-624(1988)；Wand和Finer，Nature Medicine 2：714-716(1996))；腺相關(guān)病毒載體如AAV/neo(Mura-Cacho等人，J.Immunother.，11：231-237(1992))；慢病毒載體(Zufferey等人，Nature Biotechnology 15：87l-875(1997))；質(zhì)粒載體如pCDNA3和pCDNAl(InVitrogen)、pET 11a、pET3a、pET11d、pET3d、pET22d、和pET12a(Novagen)；質(zhì)粒AH5(其含有SV40起點(diǎn)和腺病毒主要后期啟動(dòng)子)、pRC/CMV(InVitrogen)、pCMU II(Paabo等人，EMBO J.，5：1921-1927(1986))，pZipNeo SV(Cepko等人，Cell，37：1053-1062(1984))。pSR.α.(DNAX，Palo Alto，Calif.)和pBK-CMV；以及桿狀病毒表達(dá)載體(O′Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS，Oxford University Press(1995))，例如p2Bac(InVitrogen)。

隨后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的催乳素受體拮抗劑進(jìn)行純化，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括電泳、色譜(包括親和色譜)、和超濾。可以制備與放射性同位素或熒光染料綴合的肽形式的催乳素受體拮抗劑?？梢栽隗w外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中合成生物素化或放射性標(biāo)記的催乳素受體拮抗劑，在所述體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中將變體基因克隆到載體中的SP6啟動(dòng)子下，隨后通過(guò)利用SP6轉(zhuǎn)錄酶和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞在生物素或放射性標(biāo)記物的存在下制備蛋白。體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)可商購(gòu)自QIAGEN。作為另一種選擇，可以在細(xì)菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生綴合的催乳素受體拮抗劑，所述細(xì)菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞在放射性標(biāo)記的、熒光標(biāo)記的或生物素化的氨基酸存在下培養(yǎng)。也可利用相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他合成標(biāo)記蛋白的方法來(lái)制備與放射性同位素、熒光染料、順磁標(biāo)簽或生物素綴合的催乳素受體拮抗劑。

本發(fā)明提供了其中可利用催乳素受體拮抗劑抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞或Her2⁺乳腺癌細(xì)胞增殖的方法和組合物。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)獲取生物活檢樣并以標(biāo)記物對(duì)所獲乳腺癌細(xì)胞染色，所述標(biāo)記物可對(duì)癌細(xì)胞是否表達(dá)雌激素受體、HER2⁺和/或孕酮受體進(jìn)行可視化，從而對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行診斷，以確定其乳腺癌是否為三陰性乳腺癌亞型或HER2陽(yáng)性亞型。如果確定患者攜帶三陰性乳腺癌細(xì)胞或HER2⁺乳腺癌細(xì)胞，則用催乳素受體拮抗劑治療患者。

為了確定用于治療的催乳素受體拮抗劑的有效量，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法，如劑量-響應(yīng)測(cè)試。然后以催乳素受體拮抗劑對(duì)患者按日進(jìn)行治療?？梢员O(jiān)測(cè)患者對(duì)治療的響應(yīng)，三陰性乳腺癌細(xì)胞或HER2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少表明對(duì)治療有正面響應(yīng)。每輪治療之后根據(jù)需要和總體改善，還可以對(duì)患者進(jìn)行后續(xù)輪次的治療。

本發(fā)明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑治療卵巢癌、子宮癌(子宮內(nèi)膜癌)、和宮頸癌的方法和組合物。為了確定用于治療的催乳素受體拮抗劑的有效量，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法，如劑量-響應(yīng)測(cè)試。每輪治療之后根據(jù)需要和總體改善，還可以對(duì)患者進(jìn)行后續(xù)輪次的治療。

本發(fā)明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑消除具有轉(zhuǎn)移瘤的患者的繼發(fā)腫瘤細(xì)胞的方法和組合物。在所述方法中，在乳腺癌外科手術(shù)過(guò)程中從患者腫瘤取活檢物。隨后分析活檢物，從而確定患者癌癥亞型是否是三陰性或HER2陽(yáng)性。隨后使患者從其外科手術(shù)中恢復(fù)，并對(duì)其進(jìn)行催乳素受體拮抗劑治療，例如為期2周的G129R治療。1至2周后，對(duì)患者再進(jìn)行數(shù)輪治療。催乳素受體拮抗劑治療可以與其他治療方法如化學(xué)療法和/或放射同時(shí)施用。

本發(fā)明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑消除具有干細(xì)胞樣特征的乳腺癌細(xì)胞的方法和組合物。在一些實(shí)施方式中，如上所述對(duì)患者進(jìn)行催乳素受體拮抗劑治療。

本發(fā)明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑對(duì)患者的具有干細(xì)胞樣特征的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行可視化的方法和組合物。在一些實(shí)施方式中，將催乳素拮抗劑首先與可檢測(cè)標(biāo)記物如熒光染料或放射性同位素綴合，然后施用于患者。然后通過(guò)本領(lǐng)域已知程序中的任一種將拮抗劑在患者體內(nèi)的定位可視化。所述程序例如包括計(jì)算機(jī)斷層掃描程序；磁共振成像和核磁共振成像。

在本發(fā)明的方法中，可以將催乳素受體拮抗劑與其他適合治療乳腺癌的試劑相繼施用或在組合治療方案中一起施用。作為非限制性實(shí)例，用于組合方案的其他試劑可包括化學(xué)治療劑、使HER2/neu信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑失活的試劑如賀賽汀、抗雄激素和/或抗雌激素，如他莫昔芬。

對(duì)于治療應(yīng)用，本發(fā)明的組合物可以以藥學(xué)可接受劑型施用于哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人，所述藥學(xué)可接受劑型包括可以作為靜脈內(nèi)推注施用或經(jīng)一段時(shí)間連續(xù)輸注、或通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊腔內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑施用的那些劑型。本發(fā)明的組合物還適合于經(jīng)腫瘤內(nèi)、腫瘤周?chē)?、病損內(nèi)或病損周?chē)緩绞┯茫员惆l(fā)揮局部的和全身的效果。預(yù)計(jì)腹膜內(nèi)施用對(duì)各種癌癥和轉(zhuǎn)移病灶的治療特別有用。

可根據(jù)已知的制備藥用組合物的方法來(lái)配制本發(fā)明的組合物，通過(guò)所述方法將組合物試劑組合于與藥學(xué)可接受載體載質(zhì)(carrier vehicle)的混合物中。包括其他人類蛋白如人血清白蛋白在內(nèi)的適合的載質(zhì)及其配制，在例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(16版，Osol，A編，Mack，Easton Pa.(1980))中有所描述。為了形成適合有效施用的藥學(xué)可接受組合物，所述組合物含有有效量的本發(fā)明的蛋白中的一種或多種，以及適合量的載體載質(zhì)。更具體而言，有效劑量(量)是指抑制HER2⁺乳腺癌細(xì)胞或三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖所需的催乳素受體拮抗劑的量。可以根據(jù)實(shí)施例8所述的劑量-響應(yīng)和時(shí)間-響應(yīng)測(cè)試確定有效量。治療有效量的確定特別取決于藥物的毒性和功效等因素?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的方法和在先文獻(xiàn)中的方法來(lái)確定毒性。可利用相同的指導(dǎo)結(jié)合以下實(shí)施例所述方法來(lái)確定功效。因此，藥學(xué)有效量就是指被臨床醫(yī)師視為毒性可耐受并仍然有功效的量。功效例如可通過(guò)靶向的腫瘤塊的質(zhì)量減少而測(cè)定。

可以用催乳素受體拮抗劑組合物治療乳腺癌、卵巢癌、子宮癌(子宮內(nèi)膜癌)或?qū)m頸癌的患者。隨后，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)患者癌細(xì)胞中ALDH1活性的下降來(lái)監(jiān)測(cè)患者的具有干細(xì)胞樣特征的癌細(xì)胞的數(shù)量的減少。之后可重復(fù)進(jìn)行催乳素受體拮抗劑治療的輪次，從而進(jìn)一步消除具有干細(xì)胞樣特征的癌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可對(duì)患者處以1至6輪治療，每輪由1至10天組成。

可使用催乳素受體拮抗劑對(duì)具有干細(xì)胞樣特征的乳腺癌、卵巢癌、子宮癌(子宮內(nèi)膜癌)或?qū)m頸癌細(xì)胞進(jìn)行可視化。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以施用與綠色熒光蛋白融合的催乳素受體拮抗劑。在其他實(shí)施方式中，可以將催乳素受體拮抗劑與熒光染料或放射性同位素綴合，并施用于患者。隨后對(duì)催乳素受體拮抗劑在患者體內(nèi)的定位進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

可以利用一種或多種生理可接受的載體或賦形劑通過(guò)常規(guī)方式來(lái)配制根據(jù)本發(fā)明所用的組合物。因此，可將其配制為用于通過(guò)吸入或吹入施用(通過(guò)嘴或鼻)，或口服、口頰、胃腸外或直腸施用。

可以對(duì)口服施用制劑進(jìn)行適當(dāng)配制，從而提供活性化合物的控釋。對(duì)于口頰施用，組合物可以為常規(guī)方法配制的片劑或錠劑的形式。對(duì)于吸入施用，可以將根據(jù)本發(fā)明的組合物以氣霧噴劑方式由加壓包或噴霧器按常規(guī)方式遞送，并使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當(dāng)氣體。在加壓氣霧劑情況中，可以通過(guò)設(shè)置可遞送計(jì)量量的閥來(lái)確定劑量單位?？梢耘渲坪谢衔锖瓦m當(dāng)粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物的膠囊和盒(例如明膠膠囊和盒)，以用于吸入器或吹入器。

可以將本發(fā)明的組合物配制用于通過(guò)注射進(jìn)行胃腸外施用，例如可通過(guò)推注或連續(xù)輸注。注射用制劑可以以單位劑量形式存在，例如在安培瓶或在多劑量容器中，并添加有防腐劑。組合物可以為在油性或水性載質(zhì)中的懸浮液、溶液或乳液等形式，并且可含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。作為另一種選擇，活性成分可以為粉末形式，以便在使用前用適當(dāng)載質(zhì)如無(wú)菌無(wú)熱源水配制。還可以將組合物配制為直腸用組合物，例如如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)(如可可油或其他甘油酯)的栓劑或灌腸保留劑。除了上述制劑以外，還可以將本發(fā)明的組合物配制為長(zhǎng)效制劑(depot preparation)。這種長(zhǎng)時(shí)間作用制劑可通過(guò)植入(例如皮下或肌肉內(nèi)植入)或肌肉內(nèi)注射來(lái)施用。因此，例如可以將使HER2/neu信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑失活的催乳素變體和/或試劑與適當(dāng)聚合物或疏水材料(如作為在可接受油中的乳液)或離子交換樹(shù)脂配制，或配制為微溶衍生物，例如微溶鹽。

如需要，該組合物可存在于可含有一個(gè)或多個(gè)包含活性成分的單位劑量形式的包裝或分配裝置中。所述包裝例如可以具有金屬箔或塑料箔，如泡罩包裝。所述包裝或分配裝置可帶有施用說(shuō)明書(shū)。

此外，還可以對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行修飾，從而具有更長(zhǎng)清除率，因而通過(guò)保護(hù)組合物免受受試者的免疫反應(yīng)和其他清除基質(zhì)的破壞而增加生物利用度。例如，PEG化的化合物顯示降低的免疫原性和抗原性，并在血流內(nèi)的循環(huán)比未綴合的蛋白顯著延長(zhǎng)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知方法將PEG(聚乙二醇)聚合物鏈與催乳素變體/催乳素受體拮抗劑連接，例如通過(guò)Roberts等人，Adv.Drug Del.Rev.，54(4)：459-76(2002)所述的PEG化程序。但其他可延長(zhǎng)本發(fā)明治療組合物的清除半衰期的試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且也包含在本發(fā)明中。

實(shí)際上，還可以用羥乙基淀粉(HES)修飾本文所述的組合物。HES是天然存在的支鏈淀粉的衍生物，并在體內(nèi)被α淀粉酶降解。本領(lǐng)域已知制備HES-蛋白綴合物的方法。例如見(jiàn)EP 1398322、DE 2616086和DE 2646854。

為了延長(zhǎng)本發(fā)明組合物的清除時(shí)間并增加其半衰期，本發(fā)明還包括將催乳素受體拮抗劑與血清白蛋白連接的試劑。雖然美國(guó)專利公開(kāi)2007/0160534(將其通過(guò)引用并入本文)披露了這種試劑，還認(rèn)為其他對(duì)可綴合本發(fā)明的催乳素受體拮抗劑的血清白蛋白有親和性的肽配體適合用于此處。

參考以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的。本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，而是包含了因本文提供的教導(dǎo)而顯而易見(jiàn)的各種變化形式。

實(shí)施例1

人催乳素拮抗劑G129R的制備

利用逆轉(zhuǎn)錄(RT)和之后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)成功克隆了人PRL。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將人垂體polyA RNA(CloneTech，Inc.Palo Alto，Calif.)用作模板。由hPRL cDNA的距終止密碼子(TAA)2個(gè)堿基處開(kāi)始設(shè)計(jì)HPRL反義引物(5′-GCTTAGCAGTTGTTGTTGTG-3′；SEQ ID NO：1)，并從ATG起設(shè)計(jì)正義引物(5′-ATGAACATCAAAGGAT-3′；SEQ ID NO：2)。利用Perkin-Elmer Cetus，Inc.(Norwalk，Conn.)的試劑盒進(jìn)行RT/PCR。利用經(jīng)修飾的T7 DNA聚合酶(Sequenase，United States Biochemical)通過(guò)雙脫氧鏈終止法測(cè)定所得hPRL的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中報(bào)導(dǎo)的相似，不同之處在于導(dǎo)致密碼子21處的沉默突變的一個(gè)堿基差異(CTG-＞CTC)。包括pUCIG-Met表達(dá)載體制備在內(nèi)的克隆過(guò)程的示意圖在公開(kāi)的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0030022833號(hào)(Wagner等人)中有所總結(jié)，將該文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。

將含有hPRL cDNA和M13 F1復(fù)制起點(diǎn)的親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli(CJ236)中。利用輔助噬菌體M13k07從所轉(zhuǎn)化的CJ236菌中分離出含有尿苷的單鏈質(zhì)粒DNA。通過(guò)在70℃加熱5分鐘，然后緩慢冷卻，將6pmol含有指導(dǎo)G129R突變的寡核苷酸與0.2pmol單鏈DNA在退火緩沖液(200mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，100mM NaCl)中退火。用單鏈DNA為模板，以T4 DNA聚合酶催化，將編碼G129R突變的寡核苷酸(5′-CGGCTCCTAGAGAGGATGGAGCT-3′；SEQ ID NO：3)用于引發(fā)DNA互補(bǔ)鏈的合成。合成后，使用雙鏈DNA來(lái)轉(zhuǎn)化E.coli(DH5a)。分離單克隆，并通過(guò)DNA核苷酸測(cè)序來(lái)篩選hPRL-G129R。

將hPRL和G129R編碼核酸各自插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體之中cDNA的轉(zhuǎn)錄受到小鼠金屬硫蛋白增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列和bGH poly A添加信號(hào)的控制(Chen等人，J.Biol.Chem.，266：2252-2258(1991)；Chen等人，Endocrinol.，129：1402-1408(1991)；Chen等人，Mol.Endocrinol.，5：1845-1852(1991)；Chen等人，J.Biol.Chem.，269：15892-15897(1994))。為了建立產(chǎn)生hPRL和hPRLA的穩(wěn)定小鼠L細(xì)胞系，將小鼠L細(xì)胞[胸苷激酶-陰性(TK)，且腺苷磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶-陰性(APRT)]選作體外表達(dá)體系。制備了表達(dá)HPRL的穩(wěn)定細(xì)胞系(其被用作陽(yáng)性對(duì)照)和人催乳素拮抗劑(約5-10mg/l/24h/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)。

利用Chen等人，J.Biol.Chem.269：15892-15897(1994)所述技術(shù)，使用膜超濾從條件細(xì)胞培養(yǎng)基中部分純化和濃縮hPRL和人催乳素拮抗劑。分離基于相對(duì)分子尺寸和膜的孔尺寸。超濾膜獲自Amicon，Inc.(Northorough，Mass.)。使用了兩種膜，YM10和YM100。首先，使用具有Amicon YM100的200ml超濾裝置，在20psia跨膜壓下從培養(yǎng)基中除去大雜質(zhì)。將透過(guò)物(hPRL回收為＞90％)用于第二過(guò)濾規(guī)程，該第二過(guò)濾規(guī)程用YM10膜來(lái)減少溶液體積，從而濃縮蛋白。利用Diagnostic Products Corp.(Los Angeles，Calif.)的免疫放射計(jì)量測(cè)試(IRMA)試劑盒來(lái)確定HPRL或人催乳素拮抗劑的濃度。

實(shí)施例2

用催乳素受體拮抗劑G129R治療三陰性乳腺癌細(xì)胞可降低細(xì)胞的ALDH1活性。

將人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和對(duì)照乳腺癌細(xì)胞T-47D以1x10⁵個(gè)細(xì)胞/孔鋪于6孔板中，并使其在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中貼壁24小時(shí)，然后進(jìn)行2小時(shí)的無(wú)血清培養(yǎng)基消耗。隨后在不含(對(duì)照)或含有催乳素(100ng/ml)或G129R(10ug/ml)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞3天。然后收集細(xì)胞，并通過(guò)ALDEFLUOR^R熒光測(cè)試(StemCell Technologies)測(cè)定ALDH-1活性(該酶是癌干細(xì)胞的標(biāo)記物。見(jiàn)Ginestier等人，Cell Stem Cell 20071(5)：555-567)。如圖1所示，催乳素拮抗劑G129R治療顯著降低了三陰性乳腺癌細(xì)胞中的ALDH1活性。

實(shí)施例3

催乳素受體拮抗劑治療降低腫瘤細(xì)胞中的ALDHl活性

MMTV/neu轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶由小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的活化的c-neu癌基因，并發(fā)展為乳腺HER2⁺腺癌(Muller等人1988.Cell.54(1)：105-15)。對(duì)攜帶乳腺腫瘤的MMTV/neu轉(zhuǎn)基因小鼠以PBS(n＝4)或G129R治療5天(n＝2)或10天(n＝3)(10mg/kg，i.p.)。在治療結(jié)束時(shí)分離腫瘤，消化為單細(xì)胞懸浮液，并比較ALDH1活性水平。從圖2可見(jiàn)，在分離自G129R治療動(dòng)物的癌細(xì)胞中，ALDH1活性顯著降低。實(shí)際上在以G129R治療10天的癌細(xì)胞中未檢測(cè)到ALDH1活性。

實(shí)施例4

催乳素受體拮抗劑對(duì)癌細(xì)胞的治療使ALDH1活性降低

從MMTV/neu轉(zhuǎn)基因小鼠中分離原發(fā)乳腺腫瘤細(xì)胞，并在G129R(10ug/ml)或PRL(100ng/ml)存在下培養(yǎng)24、48、72、或96小時(shí)。具體而言，將取自MMTV-neu小鼠的腫瘤消化為單細(xì)胞懸浮液，并以1x10⁵個(gè)細(xì)胞/ml鋪在12孔板中。使細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中貼壁24小時(shí)，然后進(jìn)行2小時(shí)的無(wú)血清培養(yǎng)基消耗。隨后不用(對(duì)照)催乳素或用催乳素(100ng/ml)或G129R(10ug/ml)處理細(xì)胞。處理24、48、72、或96小時(shí)后收集細(xì)胞，并測(cè)定ALDH-1活性。由圖3可見(jiàn)，對(duì)暴露于G129R的原發(fā)MMTV/neu腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的時(shí)間過(guò)程研究揭示出ALDH1活性的穩(wěn)定下降，最終水平顯著低于對(duì)照(96小時(shí)減少92.3％)。

實(shí)施例5

催乳素拮抗劑抑制哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展

從MMTV/neu轉(zhuǎn)基因小鼠中分離原發(fā)乳腺腫瘤。以PBS或G129R(200ug/天，i.p.)對(duì)小鼠治療超過(guò)40天。當(dāng)繼發(fā)腫瘤(復(fù)發(fā))生長(zhǎng)至一定尺寸，處死小鼠，切取肺并在包氏固定劑中固定以便觀察轉(zhuǎn)移。圖4顯示了在G129R治療組和對(duì)照組中具有肺轉(zhuǎn)移瘤的動(dòng)物的百分比(應(yīng)用卡方檢驗(yàn)確定顯著性)。由圖4可見(jiàn)，與未治療的對(duì)照組相比，G129R治療組中具有肺轉(zhuǎn)移瘤的動(dòng)物的百分比顯著降低**(P＜0.05)。

實(shí)施例6

催乳素拮抗劑抑制哺乳動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)

在兩個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)中，從雌性轉(zhuǎn)基因小鼠中分離腫瘤，將其切為等尺寸片并植入到年齡匹配的受體雌性轉(zhuǎn)基因小鼠。植入后10天，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n＝3-4)或G129R治療組(n＝4，10mg/kg，i.p.每日進(jìn)行)。對(duì)小鼠以每日為基礎(chǔ)進(jìn)行50天治療，并監(jiān)測(cè)對(duì)照組和治療組的腫瘤體積。如圖5所示，與對(duì)照組相比，兩個(gè)G129R治療組中最終腫瘤體積小67.1％(±9.18SEM)或71.5％(±14.9SEM)。從圖5中還可以看出，與對(duì)照組相比，G129R治療組中最終腫瘤重量減少61.3％(±18.4SEM)或62.5％(±7.07SEM)。

實(shí)施例7

催乳素拮抗劑治療抑制哺乳動(dòng)物原發(fā)和繼發(fā)腫瘤中HER2⁺/neu蛋白的磷酸化

每天以PBS(對(duì)照)或200ug的G129R對(duì)MMTV/neu小鼠(攜帶原發(fā)和繼發(fā)腫瘤)治療5天。第5次治療后24小時(shí)取出原發(fā)和繼發(fā)腫瘤，并進(jìn)行處理以用于蛋白質(zhì)印記。如圖6所示，在分離自G129R治療動(dòng)物的原發(fā)腫瘤中，磷酸化Neu蛋白顯著減少。G129R治療動(dòng)物的繼發(fā)腫瘤也顯示出neu磷酸化的降低。然后，在G129R治療小鼠的繼發(fā)腫瘤中仍可檢測(cè)出一些磷酸化neu蛋白(見(jiàn)圖6)，提示催乳素拮抗劑G129R治療可能以不同方式影響原發(fā)和繼發(fā)腫瘤。

實(shí)施例8

體內(nèi)HER⁺腫瘤對(duì)催乳素拮抗劑G129R治療的劑量-依賴響應(yīng)和體內(nèi)HER⁺腫瘤對(duì)催乳素拮抗劑G129R治療的時(shí)間-依賴響應(yīng)

為確定降低HER⁺/neu體內(nèi)磷酸化所需的G129R的最小劑量，由MMTV/neu轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤中移取活檢物，將其用作自我對(duì)照基線。然后以以下濃度的PBS或G129R對(duì)小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)治療10天：每日50、100、200或400ug(2.5mg/kg/天、5mg/kg/天；10mg/kg/天；或20mg/kg/天的G129R)。然后收集腫瘤，并對(duì)其處理以進(jìn)行蛋白質(zhì)印記。然后以檢測(cè)磷酸化HER2/neu蛋白的抗體和抗β-微管蛋白的抗體對(duì)蛋白質(zhì)印記進(jìn)行探測(cè)，β-微管蛋白是凝膠上樣及蛋白質(zhì)印記轉(zhuǎn)移的對(duì)照。由圖7可見(jiàn)，在G129R劑量為5mg/kg/天那樣低時(shí)，就觀察到G129R對(duì)HER⁺/neu磷酸化的抑制效果。

為確定G129R治療的最佳長(zhǎng)度，用200ug G129R對(duì)攜MMTV瘤小鼠治療5天或10天。最后一次治療后24小時(shí)取出腫瘤，并對(duì)其處理以用于蛋白質(zhì)印記分析。由圖8可見(jiàn)，在接受5天G129R(10mg/kg/天，i.p.)治療的14只小鼠中，5只小鼠的腫瘤與對(duì)照小鼠(n＝8)相比顯示出磷酸化HER2/neu蛋白的顯著降低，4只為中度響應(yīng)，可觀察到磷酸化HER2/neu蛋白的降低，而5只沒(méi)有響應(yīng)。由圖8可見(jiàn)，在接受10天G129R(10mg/kg/天，i.p.)治療的10只小鼠中，3只小鼠的腫瘤具有高度響應(yīng)，在這些腫瘤中實(shí)際上檢測(cè)不到磷酸化HER2/neu，5只小鼠為中度響應(yīng)，而2只沒(méi)有響應(yīng)。

序列表

<110> Oncolix, Inc.

<120> 使癌干細(xì)胞可視化并消除癌干細(xì)胞的組合物和方法

<130> 03153.0015.00PC00

<150> 61/155,624

<151> 2009-02-26

<160> 4

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

gcttagcagt tgttgttgtg 20

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

atgaacatca aaggat 16

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

cggctcctag agaggatgga gct 23

<210> 4

<211> 199

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg

1 5 10 15

Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu

20 25 30

Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg

35 40 45

Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala

50 55 60

Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe

65 70 75 80

Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr

85 90 95

His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Leu

100 105 110

Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Arg

115 120 125

Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn

130 135 140

Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp

145 150 155 160

Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg

165 170 175

Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg

180 185 190

Ile Ile His Asn Asn Asn Cys

195