用于治療癌癥或感染的組合制劑的制作方法
本發(fā)明涉及組合制劑和藥物組合物以及其作為藥物，特別用于治療癌癥或感染的用途，以及用于治療癌癥或感染的方法。
當(dāng)原初(naive)t細(xì)胞從胸腺出現(xiàn)后，其通過淋巴結(jié)在血液中循環(huán)并尋找由特定抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presentingcell，apc)(通常是樹突細(xì)胞)呈遞的外來(“非自身”)抗原。t細(xì)胞不僅可以識別病原體相關(guān)抗原，而且可以將異常表達(dá)的自身蛋白質(zhì)(指示突變或轉(zhuǎn)化的致瘤細(xì)胞)識別為“非自身”。如果t細(xì)胞在適當(dāng)?shù)墓泊碳し肿拥那闆r下遇到其特異性抗原，則細(xì)胞被活化并上調(diào)活化和歸巢分子。這些t細(xì)胞(稱為效應(yīng)t細(xì)胞)能夠進(jìn)入發(fā)炎組織以尋找感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。在其他功能中，效應(yīng)t細(xì)胞可產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和/或溶細(xì)胞顆粒(cytolyticgranule)，從而導(dǎo)致感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的凋亡或壞死。
在整個免疫應(yīng)答期間，局部和全身的下調(diào)力(down-regulatoryforce)使對健康細(xì)胞和組織的損害最小化。這些可能涉及免疫抑制細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)和來自其他細(xì)胞的負(fù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。腫瘤抗原特異性t細(xì)胞顯示出以促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少和對抗原再刺激的低應(yīng)答為特征的效應(yīng)物功能受損和表型耗竭。這是由細(xì)胞外在機(jī)制(例如調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg))和細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制(例如在耗竭的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumorinfiltratinglymphocyte，til)上上調(diào)的抑制性分子)介導(dǎo)的。
免疫檢驗(yàn)點(diǎn)通路強(qiáng)烈地下調(diào)t細(xì)胞活化，目的是保持新生的t細(xì)胞應(yīng)答在控制中，并降低對正常組織的免疫攻擊的可能性。然而，在腫瘤發(fā)生期間，癌細(xì)胞可以利用這些共抑制通路來抵抗檢測或避免被適應(yīng)性免疫系統(tǒng)消除。程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmedcelldeathprotein-1，pd-1)是由活化后t細(xì)胞表達(dá)的關(guān)鍵檢驗(yàn)點(diǎn)分子。認(rèn)為pd-1檢驗(yàn)點(diǎn)通路主要作用于外周組織以抑制持續(xù)的免疫應(yīng)答和/或防止對自身組織的損害。除t細(xì)胞外，pd-1還由b細(xì)胞、天然殺傷(naturalkiller，nk)細(xì)胞、樹突細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞表達(dá)。pd-1配體(其包括pd-l1和pd-l2等)由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)，并且這些可在炎性環(huán)境中的許多細(xì)胞類型中被誘導(dǎo)。
腫瘤利用非免疫細(xì)胞表達(dá)pd-1的配體(主要是pd-l1)的能力作為避免免疫攻擊的一種方法。腫瘤細(xì)胞也可下調(diào)抗原表達(dá)以避免檢測。此外，免疫抑制介體的產(chǎn)生以及腫瘤微環(huán)境中treg和免疫抑制細(xì)胞的保留可抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。
圖1(取自harvey，clinicalpharmacology&therapeutics，2014，第96卷(2)，214-223頁)描繪了pd-1通路在腫瘤免疫逃避中的作用和pd-1通路阻斷的作用機(jī)制：(a)t細(xì)胞活化中的pd-1。t細(xì)胞通過以下活化：(i)apc上的mhc加肽與tcr的結(jié)合，然后(ii)apccd80/86與t細(xì)胞cd28的結(jié)合。在癌癥患者中，腫瘤細(xì)胞也可充當(dāng)apc。在t細(xì)胞活化后，誘導(dǎo)pd-1表達(dá)；(b)t細(xì)胞耗竭(exhaustion)中的pd-1。在慢性感染或持續(xù)性刺激的情況下，pd-l1通過t細(xì)胞pd-1發(fā)出信號以“關(guān)閉”t細(xì)胞，從而最小化對健康組織的損害(阻斷活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo))。腫瘤細(xì)胞可上調(diào)pd-l1從而“關(guān)閉”可能破壞它們的t細(xì)胞。(c)阻斷pd-1/pd-l1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路允許t細(xì)胞維持其效應(yīng)物功能。在癌癥患者中，活化的腫瘤特異性t細(xì)胞可殺傷腫瘤細(xì)胞并分泌活化/募集其他免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子以參與抗腫瘤應(yīng)答。
ishida等(theembojournal(1992)，第11卷(11)，第3887-3895頁)描述了pd-1的克隆。人pd-1cdna的序列在genbank登錄號nm_005018下記錄。人pd-l1cdna的序列以genbank登錄號af233516給出，人pd-l2cdna的序列以genbank登錄號nm_025239給出。
2014年9月，美國食品和藥物管理局(foodanddrugadministration，fda)加速批準(zhǔn)了用于治療患有晚期或無法切除的黑素瘤患者(其不再對其他藥物有響應(yīng))的keytruda(派姆單抗(pembrolizumab))。keytruda(merck&co.)是針對pd-1的人源化單克隆igg4抗體。它包含接種到人igg4免疫球蛋白中的非常高親和力的小鼠抗人pd-1抗體的可變區(qū)序列，具有改變以提高穩(wěn)定性。keytruda阻斷pd-1與pd-l1和pd-l2的結(jié)合。
2014年12月，美國fda還加速批準(zhǔn)了opdivo(納武單抗(nivolumab))，一種用于患有無法切除或轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者(其不再對其他藥物有響應(yīng))的新治療。opdivo(bristol-myerssquibb)是針對pd-1的完全人單克隆igg4抗體，其阻斷pd-1與pd-l1和pd-l2的結(jié)合。
在pd-1通路抑制劑中，納武單抗已經(jīng)歷了肺癌中最廣泛的臨床評估。在非小細(xì)胞肺癌(non-small-celllungcarcinoma，nsclc)患者中已經(jīng)證明在鱗狀和非鱗狀非小細(xì)胞肺癌中作為單一療法以及與常規(guī)化學(xué)療法的組合二者的活性的證據(jù)。在nsclc患者中正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)(nct01295827)中正在評估派姆單抗。
靶向pd-1通路的許多其他有前景的藥劑(pd-1通路抑制劑)正處于臨床開發(fā)中(參見下表1.1)：
表1.1：除派姆單抗和納武單抗外，臨床開發(fā)中的pd-1通路抑制劑(取自harvey，clinicalpharmacology&therapeutics，2014，第96卷(2)，第214-223頁)
adcc，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；igg，免疫球蛋白g；pd-1，程序性死亡-1；pd-l1，pd配體1。
臨床開發(fā)中的另一種pd-1通路抑制劑是由merckkgaa和pfizer共同開發(fā)的avelumab(也稱為msb0010718c)，一種完全人抗pd-l1igg1單克隆抗體。
盡管最近fda批準(zhǔn)了keytruda和opdivo用于治療晚期黑素瘤，并且從靶向pd-1通路之藥劑的臨床試驗(yàn)中得到針對nsclc的有前景的結(jié)果，但是仍需要提供更有效的癌癥治療，從而為更廣泛的癌癥患者提供有效的治療，為另一些癌癥提供有效的治療，以及提供副作用減少的有效的癌癥治療。
淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyteactivationgene3，lag-3)是具有四個胞外免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域的cd4同源i型膜蛋白。與cd4類似，lag-3在t細(xì)胞的表面處寡聚化并且以比cd4顯著更高的親和力與抗原呈遞細(xì)胞(apc)上的mhcii類分子結(jié)合。lag-3在活化的cd4+和cd8+t淋巴細(xì)胞上表達(dá)，在那里其與在細(xì)胞表面處的cd3/t細(xì)胞受體復(fù)合體締合并負(fù)調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，它負(fù)調(diào)控t細(xì)胞的增殖、功能和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。與效應(yīng)t細(xì)胞或記憶t細(xì)胞相比，lag-3在耗竭的t細(xì)胞上被上調(diào)。lag-3還在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(til)上被上調(diào)，并且使用抗lag-3抗體阻斷l(xiāng)ag-3可增強(qiáng)抗腫瘤t細(xì)胞應(yīng)答。
blackburn等(natimmunol.2009；10(1)：29-37)描述了通過多種抑制性受體在慢性病毒感染期間cd8+t細(xì)胞耗竭的共調(diào)節(jié)。使用慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus，lcmv)的小鼠模型，作者證明與記憶或原初cd8+t細(xì)胞相比，耗竭的抗原特異性cd8+t細(xì)胞具有多至七種抑制性受體(pd-1、lag3、2b4、cd160、ctla-4、pir-b和gp49)的表達(dá)提高。多種不同抑制性受體的共表達(dá)與更大的t細(xì)胞耗竭和更嚴(yán)重的感染有關(guān)。阻斷t細(xì)胞抑制性受體pd-1和lag-3(使用抗pd-l1和抗lag-3抗體)改善了t細(xì)胞應(yīng)答并降低了體內(nèi)的病毒載量。
woo等(cancerresearch2011；72(4)：917-927)描述了可移植腫瘤中pd-1和lag-3在腫瘤浸潤性cd4+和cd8+t細(xì)胞上的共表達(dá)?？筶ag-3/抗pd-1雙重抗體治療治愈了大多數(shù)已建立腫瘤的小鼠(其大部分對單一抗體治療有抗性)。
在慢性感染和癌癥中l(wèi)ag-3對t細(xì)胞功能的免疫調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上，預(yù)測的lag-3特異性單克隆抗體的作用機(jī)制是抑制腫瘤特異性效應(yīng)t細(xì)胞的負(fù)調(diào)控。
lag-3還編碼翻譯為可溶形式的lag-3(slag-3)的替代剪接變體。作為可溶性分子，lag-3通過mhcii類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來活化抗原呈遞細(xì)胞(apc)，從而導(dǎo)致體內(nèi)抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答增加(triebel，trendsimmunol.，2003，24：619-622)。
通過活化1型細(xì)胞毒性(tc1)cd8t細(xì)胞、nk細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)主要的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在短期的離體測定中，可溶形式的lag-3蛋白(imp321)在外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)中誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性型應(yīng)答(brignone等，journalofimmunology，2007，179：4202-4211)。imp321與pbmc中少數(shù)mhcii類+細(xì)胞(包括所有骨髓樹突細(xì)胞和少部分單核細(xì)胞)結(jié)合。將imp321添加至pbmc后4小時，這些骨髓細(xì)胞產(chǎn)生tnf-α和ccl4。在第18小時，1％的cd8+t細(xì)胞和3.7％的nk細(xì)胞產(chǎn)生tc1細(xì)胞因子，例如ifn-α和/或tnf-α。這種tc1型活化需要通過imp321的早期apc活化，因?yàn)榧兊慕?jīng)分選cd8+t細(xì)胞不能被imp321活化。只有經(jīng)歷抗原的完全分化的顆粒酶+cd8t細(xì)胞(效應(yīng)物和效應(yīng)記憶t細(xì)胞，但不是原初或中樞記憶t細(xì)胞)才能被imp321誘導(dǎo)為完全tc1活化。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)pd-1通路抑制劑(抗pd-1抗體或抗pd-l1抗體)和作為apc活化劑的lag-3的可溶性衍生物(imp321)在體外一起協(xié)同活化t細(xì)胞(特別是cd8+t細(xì)胞)。
t細(xì)胞的這種協(xié)同活化是出乎意料的。在woo等(同上)描述的抗lag-3/抗-pd-1雙重抗體治療中，認(rèn)為抗lag-3抗體是通過lag-3抑制腫瘤特異性效應(yīng)t細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)，而認(rèn)為lag-3的可溶性衍生物(imp321)作為apc活化劑通過不同的機(jī)制起作用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了組合制劑，其包含：(a)能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物；和(b)pd-1通路抑制劑。
本文使用的術(shù)語“組合制劑”是指“藥盒組件(kitofparts)”，在該意義上，如上定義的組合組分(a)和(b)可獨(dú)立地給藥或通過使用具有不同量的組合組分(a)和(b)的不同固定組合給藥。所述組分可以同時施用或相繼施用。如果組分相繼施用，則優(yōu)選地選擇施用之間的時間間隔以使得組合使用所述組分的治療效果高于僅使用組合組分(a)和(b)中任一種將獲得的效果。
組合制劑的組分可以以一個組合單位劑型或者作為組分(a)的第一單位劑型和分開的組分(b)的第二單位劑型存在。在組合制劑中待施用的組合組分(a)與組合組分(b)總量的比可以變化，例如以應(yīng)對待治療的患者亞群的需求或單個患者的需求，這可能是由于，例如患者的特定疾病、年齡、性別或體重。
優(yōu)選地，存在至少一種有益效果，例如增強(qiáng)pd-1通路抑制劑的作用，或增強(qiáng)lag-3蛋白或其衍生物的作用，或相互增強(qiáng)組合組分(a)和(b)的作用，例如與有效劑量的組合組分(a)和(b)的一個或兩個相比，大于疊加效應(yīng)、額外的有利效果、較小的副作用、較低的毒性或組合的治療效果，以及非常優(yōu)選地組合組分(a)和(b)的協(xié)同作用。
本發(fā)明的組合制劑可作為用于向哺乳動物(優(yōu)選人)施用的藥物組合制劑提供。lag-3蛋白或其衍生物可任選地與可藥用載體、賦形劑或稀釋劑一起提供，和/或pd-1通路抑制劑可任選地與可藥用載體、賦形劑或稀釋劑一起提供。
lag-3或其衍生物可以以摩爾當(dāng)量為0.25至30mg、1至30mg或6至30mglag-3衍生物lag-3ig融合蛋白imp321的劑量存在。已示出每次皮下(s.c.)注射6至30mg劑量的imp321是安全的并基于在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者中獲得的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)的結(jié)果提供可接受的全身性暴露。在注射有劑量超過6mg的imp321的患者中在皮下(s.c)注射后至少24小時獲得高于1ng/ml的imp321的血液濃度。
本發(fā)明的組合制劑可包含多劑lag-3蛋白或其衍生物。
pd-1通路抑制劑可以是抑制pd-1與pd-l1和/或pd-l2的結(jié)合的藥劑。特別地，所述藥劑可抑制人pd-1與人pd-l1和/或人pd-l2的結(jié)合。所述藥劑可抑制pd-1與pd-l1和/或pd-l2的結(jié)合至少50％、60％、70％、80％或90％。ghiotto等(int.immunol，2010年8月；22(8)：651-660)中描述了用于通過表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，spr)分析或流式細(xì)胞術(shù)分析來確定pd-1與pd-l1或pd-l2的結(jié)合之合適的測定。所述藥劑可抑制pd-1與pd-l1和/或pd-l2的結(jié)合，例如通過使pd-1與pd-l1或pd-l2結(jié)合。所述藥劑可以是抗體，合適地是單克隆抗體，例如人或人源化單克隆抗體。所述藥劑可以是保留抑制pd-1與pd-l1和/或pd-l2結(jié)合之能力的抗體的片段或衍生物。
適用于根據(jù)本發(fā)明的抗pd-1抗體的實(shí)例包括：派姆單抗(mk-3475)，人源化單克隆igg4抗體；納武單抗，完全人單克隆igg4抗體；匹地利珠單抗(ct-011)，人源化igg1單克隆抗體。與pd-1結(jié)合但不是抗體的pd-1通路抑制劑的實(shí)例是amp-224。amp-224是pd-l2的胞外結(jié)構(gòu)域和人igg的fc區(qū)的重組融合蛋白。amp-224引起pd-1高表達(dá)t細(xì)胞的消耗。根據(jù)本發(fā)明適用的抗pd-l1抗體的實(shí)例包括：bms-936559，完全人igg4單克隆抗體；medi4736(durvalumab)，完全人單克隆抗體；mpdl3280a，含有改造的iggfc結(jié)構(gòu)域以防止adcc的人單克隆抗體；aveumab(也稱為msb0010718c)，完全人抗pd-l1igg1單克隆抗體。
pd-1通路抑制劑的劑量將取決于所使用的具體的pd-1通路抑制劑。一般來說，用于人對象的pd-1通路抑制劑的常用處方劑量可以是0.1至10mg/kg，例如0.1至1mg/kg或1至10mg/kg。術(shù)語“常用處方劑量(typicallyprescribeddose)”在本文中用于包括這樣的劑量，其與作為單一療法向?qū)ο?合適的是人對象)施用的安全和治療有效的，或由適當(dāng)?shù)墓芾頇C(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的用于作為單一療法向?qū)ο?合適的是人對象)施用的劑量相同或在所述劑量范圍內(nèi)。當(dāng)用作單一療法時，已知pd-1通路抑制劑的常用處方人劑量的實(shí)例包括：
派姆單抗(mk-3475)：每兩周或三周2至10mg/kg。例如，美國fda已批準(zhǔn)每3周在30分鐘內(nèi)以靜脈內(nèi)輸注施用2mg/kgkeytruda(派姆單抗)；
納武單抗：每兩周0.1至10mg/kg。例如，美國fda已批準(zhǔn)每2周在60分鐘內(nèi)以靜脈內(nèi)輸注施用3mg/kgopdivo(納武單抗)；
bms-936559：每兩周0.3至10mg/kg。
pd-1通路抑制劑可通過任何合適的途徑施用，例如腸胃外(包括通過皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)。目前批準(zhǔn)的或開發(fā)中的pd-1通路抑制劑以靜脈內(nèi)輸注施用。
本發(fā)明的組合制劑可包含多劑pd-1通路抑制劑。
lag-3蛋白可以是分離的天然或重組lag-3蛋白。lag-3蛋白可包含來自任何合適物種的lag-3蛋白質(zhì)(例如靈長類動物或鼠lag-3蛋白，但優(yōu)選人lag-3蛋白)的氨基酸序列。在huard等(proc.natl.acad.sci.usa，11：5744-5749，1997)的圖1中提供了人和鼠lag-3蛋白的氨基酸序列。在下面的圖15中重復(fù)了人lag-3蛋白的序列(seqidno：1)。在huard等的圖1中還鑒定了人lag-3的四個胞外ig超家族結(jié)構(gòu)域(d1、d2、d3和d4)的氨基酸序列，其在以下氨基酸殘基處：1-149(d1)；150-239(d2)；240-330(d3)；和331-412(d4)。
lag-3蛋白的衍生物包括能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白的可溶性片段、變體或突變體。已知lag-3蛋白的幾種衍生物能夠與mhcii類分子結(jié)合。在huard等(proc.natl.acad.sci.usa，11：5744-5749，1997)中描述了這些衍生物的許多實(shí)例。該文件描述了在lag-3蛋白上mhcii類結(jié)合位點(diǎn)的特征。描述了用于制備lag-3突變體的方法以及用于確定lag-3突變體與ii類陽性daudi細(xì)胞結(jié)合的能力的定量細(xì)胞粘附測定。測定了lag-3的幾個不同突變體與mhcii類分子的結(jié)合。一些突變能夠減少ii類結(jié)合，而其他突變則提高lag-3對ii類分子的親和力。對于結(jié)合mhcii類蛋白所必需的許多殘基在lag-3d1結(jié)構(gòu)域中大的30個氨基酸額外環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基處簇集。人lag-3蛋白d1結(jié)構(gòu)域之額外環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為圖15中加下劃線的序列：gppaaapghplapgphpaapsswgprprry(seqidno：2)。
lag-3蛋白衍生物可包含人lag-3d1結(jié)構(gòu)域的30個氨基酸的額外環(huán)序列或具有一個或更多個保守氨基酸替換的這樣的序列的變體。所述變體可包含與人lag-3d1結(jié)構(gòu)域的30個氨基酸的額外環(huán)序列具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。
lag-3蛋白的衍生物可包含lag-3蛋白(優(yōu)選人lag-3蛋白)的結(jié)構(gòu)域d1和任選的結(jié)構(gòu)域d2的氨基酸序列。
lag-3蛋白的衍生物可包含與lag-3蛋白(優(yōu)選人lag-3蛋白)的結(jié)構(gòu)域d1或結(jié)構(gòu)域d1和d2具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。
lag-3蛋白的衍生物可包含lag-3蛋白(優(yōu)選人lag-3蛋白)的結(jié)構(gòu)域d1、d2、d3和任選的d4的氨基酸序列。
lag-3蛋白的衍生物可包含與lag-3蛋白(優(yōu)選人lag-3)的結(jié)構(gòu)域d1、d2和d3或結(jié)構(gòu)域d1、d2、d3和d4具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。
氨基酸序列之間的序列同一性可通過比較序列的比對來確定。當(dāng)被比較的序列中的等同位置被相同的氨基酸占據(jù)時，那么該分子在該位置是相同的。將比對評分為同一性百分比，其是在被比較序列共有位置上相同氨基酸數(shù)目的函數(shù)。當(dāng)比較序列時，最佳比對可能需要將空位引入一個或更多個序列中以考慮所述序列中可能的插入和缺失。序列比較方法可采用空位罰分，以使得對于所比較序列中相同數(shù)目的相同分子具有盡可能少空位的序列比對(這反映了兩個比較序列之間更高的相關(guān)性)將比具有許多空位的序列獲得更高的得分。考慮到空位罰分，最大百分比同一性的計(jì)算包括產(chǎn)生最佳比對。
用于進(jìn)行序列比較的合適的計(jì)算機(jī)程序可從商業(yè)和公共部門廣泛獲得。實(shí)例包括matgat(campanella等，2003，bmcbioinformatics4：29；可從http：//bitincka.com/ledion/matgat獲得程序)、gap(needleman&wunsch，1970，j.mol.biol.48：443-453)、fasta(altschul等，1990，j.mol.biol.215：403-410；可從http：//www.ebi.ac.uk/fasta獲得程序)、clustalw2.0和x2.0(larkin等，2007，bioinformatics23：2947-2948；可從http：//www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2獲得程序)和emboss成對比對算法(needleman&wunsch，1970，同上；kruskal，1983，在：timewarps，stringeditsandmacromolecules：thetheoryandpracticeofsequencecomparison，sankoff&kruskal(編輯)，第1-44頁，addisonwesley；可從http：//www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align獲得程序)。所有程序都可以使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行。
例如，可以使用emboss成對比對算法的“needle”法進(jìn)行序列比較，當(dāng)考慮兩個序列的整個長度時，其決定了這兩個序列的最佳比對(包括空位)并提供百分比同一性得分。氨基酸序列比較(“蛋白質(zhì)分子”選項(xiàng))的默認(rèn)參數(shù)可能是空位延伸罰分：0.5，空位開放罰分：10.0，矩陣：blosum62。
序列比較可以在參照序列的全長上進(jìn)行。
lag-3蛋白衍生物可任選地通過接頭氨基酸序列與免疫球蛋白fc氨基酸序列(優(yōu)選人igg1fc氨基酸序列)融合。
可使用如huard等(同上)中所述的定量細(xì)胞粘附測定來確定lag-3蛋白的衍生物與mhcii類分子結(jié)合的能力。lag-3蛋白的衍生物對mhcii類分子的親和力可以是人lag-3蛋白對ii類分子親和力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。優(yōu)選地，lag-3蛋白的衍生物對mhcii類分子的親和力是人lag-3蛋白對ii類分子的親和力的至少50％。
能夠與mhcii類分子結(jié)合的合適的lag-3蛋白衍生物的實(shí)例包括包含以下的衍生物：
人lag-3序列的23至448位氨基酸殘基；
lag-3的結(jié)構(gòu)域d1和d2的氨基酸序列；
lag-3的結(jié)構(gòu)域d1和d2的氨基酸序列，其中在一個或更多個以下位置處具有氨基酸替換：73位，其中arg被替換為glu；75位，其中arg被替換為ala或glu；76位，其中arg被替換為glu；30位，其中asp被替換為ala；56位，其中his被替換為ala；77位，其中tyr被替換為phe；88位，其中arg被替換為ala；103位，其中arg被替換為ala；109位，其中asp被替換為glu；115位，其中arg被替換為ala；
54至66位氨基酸殘基缺失的lag-3之d1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；
重組可溶性人lag-3ig融合蛋白(imp321)-在轉(zhuǎn)染有編碼與人igg1fc融合的hlag-3的胞外結(jié)構(gòu)域之質(zhì)粒的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的200-kda二聚體。imp321的序列在us2011/0008331的seqidno：17中給出。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了藥物組合物，其包含(a)能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物；(b)pd-1通路抑制劑；和(c)可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物，其用作藥物。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物，其用于預(yù)防、治療或改善癌癥。
根據(jù)本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物在制造用于預(yù)防、治療或改善癌癥的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或改善癌癥的方法，其包括向有此預(yù)防、治療或改善需要的對象施用能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物，和pd-1通路抑制劑。
我們已經(jīng)了解，本發(fā)明的組合制劑和組合物還可用于預(yù)防、治療或改善感染，尤其是慢性或持續(xù)性感染。
在急性感染期間，活化的病原體特異性細(xì)胞毒性cd8t淋巴細(xì)胞(ctl)增殖并獲得效應(yīng)物功能(例如細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性能力)，這使得它們能夠有效地清除感染。清除后，仍然存在一小部分的病原體特異性記憶t細(xì)胞，其在再次暴露于相同病原體后具有非常快速地重新活化并獲得其殺傷功能的能力。然而，在慢性感染期間，這種情況不會發(fā)生，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)病原體特異性ctl在功能上有缺陷并且不能消除感染。這些耗竭的ctl受其受損的增殖能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性能力喪失所限定(參見圖1(b)，以及hofmeyer等，journalofbiomedicineandbiotechnology，第2011卷，文章id451694的綜述)。
這種現(xiàn)象最初是使用小鼠慢性病毒感染的建立良好的小鼠模型(淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus，lcmv))所限定(zajac等，thejournalofexperimentalmedicine，第188卷，第12期，第2205-2213頁，1998；gallimore等，thejournalofexperimentalmedicine，第187卷，第9期，第1383-1393頁，1998)。lcmv的阿姆斯特朗毒株(armstrongstrain)導(dǎo)致被免疫系統(tǒng)清除的急性感染，從而產(chǎn)生穩(wěn)健的ctl記憶。另一方面，lcmv的克隆13毒株在小鼠中產(chǎn)生慢性感染，這使ctl耗竭并且不能清除感染。此外，與正常t細(xì)胞相比，耗竭的ctl具有代謝缺陷和參與趨化性、粘附和遷移之改變的基因表達(dá)(wherry等，immunity，第27卷，第4期，第670-684頁，2007)。
在進(jìn)行為了揭示導(dǎo)致耗竭的機(jī)制的研究中，將來自慢性lmcv感染的耗竭的ctl的遺傳譜與對急性lcmv感染應(yīng)答的功能性ctl的遺傳譜進(jìn)行比較(barber等，nature，第439卷，第7077期，第682-687頁，2006)。發(fā)現(xiàn)耗竭的ctl具有pd-1的顯著過表達(dá)，而功能性lcmv特異性ctl沒有pd-1的明顯表達(dá)。發(fā)現(xiàn)pd-1的表達(dá)與在耗竭的t細(xì)胞中看到的限定的功能受損相關(guān)，進(jìn)而與較高的病毒載量相關(guān)。在慢性感染的小鼠中用抗pd-l1抗體阻斷pd-1/pd-l1通路導(dǎo)致ctl應(yīng)答增強(qiáng)，其引起病毒載量降低。通過耗竭的ctl的pd-1表達(dá)依賴于持續(xù)的抗原特異性刺激，因?yàn)槁愿腥酒陂g特異性表位呈遞的喪失導(dǎo)致功能恢復(fù)以及降低的表位特異性ctl上的pd-1表達(dá)(blattman等，journalofvirology，第83卷，第9期，第4386-4394頁，2009)。慢性病毒感染期間的持續(xù)性抗原刺激對ctl功能的喪失和pd-1表達(dá)的相關(guān)提高具有累進(jìn)效應(yīng)(progressiveeffect)，這意味著更多耗竭的ctl(pd-1hi)與另一些(pd-1int)相比對pd-1阻斷的功能性挽救不那么易感(blackburn等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，第105卷，第39期，第15016-15021頁，2008)。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了用于預(yù)防、治療或改善感染的本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物在制造用于預(yù)防、治療或改善感染的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了預(yù)防、治療或改善感染的方法，其包括向有此預(yù)防、治療或改善需要的對象施用能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物，和pd-1通路抑制劑。
在一些具體實(shí)施方案中，所述感染是慢性或持續(xù)性感染。術(shù)語“慢性或持續(xù)性感染”在本文中用于指在感染的對象中已誘導(dǎo)經(jīng)典的ctl應(yīng)答的病原體的感染，但感染尚未被清除，從而導(dǎo)致存在耗竭的pd-1表達(dá)，具有增殖能力受損、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性能力喪失的病原體特異性ctl。
可根據(jù)本發(fā)明治療的感染的實(shí)例包括病毒、細(xì)菌、真菌或原生動物感染，尤其是慢性或持續(xù)性病毒、細(xì)菌、真菌或原生動物感染。
病毒感染可由以下引起：例如腺病毒、腺相關(guān)病毒、b病毒(i型恒河猴皰疹病毒，macacineherpesvirusi)、bk病毒、布尼亞病毒、基孔肯雅病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、巨細(xì)胞病毒、東方馬腦炎病毒、埃博拉病毒、腸病毒、eb病毒、漢坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、皰疹病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人泡沫病毒、3型人皰疹病毒、5型人皰疹病毒、6型人皰疹病毒、7型人皰疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、人嗜β-淋巴細(xì)胞病毒、i型人t細(xì)胞白血病病毒、ii型人t細(xì)胞白血病病毒、流感病毒、jc病毒、jev、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒、拉沙熱病毒(lassavirus)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、馬爾堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、諾如病毒、諾沃克病毒、正呼腸孤病毒(orthoreovirus)、副流感病毒、細(xì)小病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、呼腸孤病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、裂谷熱病毒、輪狀病毒、風(fēng)疹病毒、天花病毒、圣路易斯腦炎病毒、重型天花病毒、輕型天花病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、西尼羅病毒、西方馬腦炎病毒或黃熱病病毒。
在一些具體實(shí)施方案中，病毒感染由以下引起：肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)、慢病毒(例如，人免疫缺陷病毒)、或皰疹病毒(例如，1型單純皰疹病毒毒，2型單純皰疹病毒)。
細(xì)菌感染可由以下引起：例如大腸桿菌(escherichiacoli)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellathyphimurium)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)、流感嗜血桿菌(hemophilusinfluenzae)、痢疾志賀菌(shigelladysenteriae)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)或沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis)。
真菌感染可由以下引起：例如假絲酵母屬(candida)、曲霉屬(aspergillus)、隱球菌屬(cryptococcus)、球孢子菌屬(coccidioides)、組織胞漿菌屬(histoplasma)、肺孢子菌屬(pneumocystis)或葡萄穗霉屬(stachybotrys)。
原生動物感染可由以下引起：例如變形蟲界(amoebozoa)、古蟲界(excavata)、囊泡藻界(chromalveolata)、內(nèi)阿米巴屬(entamoeba)、瘧原蟲屬(plasmodium)、賈第蟲屬(giardia)、錐蟲屬(trypanosoma)、球蟲目(coccidia)、貝諾孢子蟲屬(besnoitia)、雙腔吸蟲屬(dicrocoelium)或利什曼蟲屬(leishmania)。
根據(jù)本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物，其用于預(yù)防、治療或改善疾病、病癥或狀況，所述疾病、病癥或狀況可通過活化t細(xì)胞(特別是通過活化cd8陽性t細(xì)胞)預(yù)防、治療或改善。
根據(jù)本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物在制造用于預(yù)防、治療或改善疾病、病癥或狀況的藥物中的用途，所述疾病、病癥或狀況可通過活化t細(xì)胞(特別是通過活化cd8陽性t細(xì)胞)預(yù)防、治療或改善。
根據(jù)本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療或改善疾病、病癥或狀況的方法，所述疾病、病癥或狀況可通過活化t細(xì)胞(特別是通過活化cd8陽性t細(xì)胞)預(yù)防、治療或改善。所述方法包括向有此預(yù)防、治療或改善需要的對象施用能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物，和pd-1通路抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，可通過活化t細(xì)胞預(yù)防、治療或改善的疾病、病癥或狀況可排除癌癥。
根據(jù)本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物，其用于增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，特別是cd8陽性t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合制劑或藥物組合物在制造用于增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(特別是cd8陽性t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明還提供了增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(特別是cd8陽性t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)的方法，其包括向有此增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答需要的對象施用能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物，和pd-1通路抑制劑。
在一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或cd8陽性t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)可排除癌癥的預(yù)防、治療或改善。
可向?qū)ο笠来问┯胠ag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑，即可在pd-1通路抑制劑之前、同時或之后施用lag-3蛋白或其衍生物。
lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑可在間隔96小時、72小時、48小時、24小時或12小時內(nèi)向?qū)ο笫┯谩?/p>
或者，可向?qū)ο蠊彩┯胠ag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑，例如作為包含lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑的組合物，或通過同時施用分開劑量的lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑。
根據(jù)一些實(shí)施方案，向?qū)ο笫┯枚鄤﹍ag-3蛋白或其衍生物和/或多劑pd-1通路抑制劑。
根據(jù)一些實(shí)施方案，在每次施用兩劑或更多劑pd-1通路抑制劑之前、同時或之后施用一劑lag-3蛋白或其衍生物。
例如，可在每次施用兩劑或更多劑pd-1通路抑制劑的96小時、72小時、48小時、24小時或12小時內(nèi)施用一劑lag-3蛋白或其衍生物。
根據(jù)本發(fā)明在組合療法中使用的組分之合適劑量的選擇可由技術(shù)人員來確定和優(yōu)化，例如，通過對患者進(jìn)行觀察，包括患者的整體健康和對組合療法的響應(yīng)。例如，如果確定患者沒有表現(xiàn)出所期望的治療效果或相反地，如果患者正在經(jīng)歷數(shù)量過多或引起麻煩的嚴(yán)重程度的不期望的或不良副作用，則可能需要優(yōu)化。
應(yīng)該對根據(jù)本發(fā)明在組合療法中使用的組分的劑量進(jìn)行選擇以提供治療有效量的組合中的組分。
組合療法的“有效量”可以是導(dǎo)致與癌癥相關(guān)的至少一種病理參數(shù)降低的量。例如，在一些實(shí)施方案中，組合療法的有效量是與沒有進(jìn)行組合療法的癌癥相關(guān)參數(shù)的預(yù)期降低相比，有效實(shí)現(xiàn)病理參數(shù)降低至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。例如，所述病理參數(shù)可以是腫瘤生長或腫瘤生長速率。
或者，組合療法的“有效量”可以是導(dǎo)致與癌癥治療相關(guān)的臨床益處提高的量。例如，在一些實(shí)施方案中，組合療法的“有效量”是與沒有進(jìn)行組合療法的預(yù)期臨床益處相比，有效實(shí)現(xiàn)臨床益處提高至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。例如，臨床益處可以是腫瘤響應(yīng)速率、無進(jìn)展的存活、總的存活或提高對隨后治療的敏感性。
或者，組合療法的“有效量”可以是導(dǎo)致與癌癥治療相關(guān)的至少一個有益參數(shù)的變化的量。例如，在一些實(shí)施方案中，組合療法的“有效量”是與沒有組合療法的癌癥治療相關(guān)參數(shù)的預(yù)期變化相比，有效實(shí)現(xiàn)參數(shù)變化至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。例如，該參數(shù)可以是循環(huán)腫瘤抗原特異性cd8+t細(xì)胞數(shù)目的增加，或者腫瘤抗原特異性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞數(shù)目的減少，或者活化的t細(xì)胞(特別是活化的cd8+t細(xì)胞)數(shù)目的增加，耗竭的抗原特異性cd8+t細(xì)胞數(shù)目的減少，或者循環(huán)功能性(即，非耗竭的)抗原特異性cd8+t細(xì)胞數(shù)目的增加。
在與感染治療有關(guān)的一些實(shí)施方案中，組合療法的“有效量”可以是導(dǎo)致與感染相關(guān)的至少一個病理參數(shù)降低的量。例如，在一些實(shí)施方案中，組合療法的有效量是與沒有組合療法的感染相關(guān)參數(shù)的預(yù)期降低相比，有效實(shí)現(xiàn)病理參數(shù)降低至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。例如，病理參數(shù)可以是病毒載量(例如，每ml血液的病毒顆粒的數(shù)目或病毒dna的量)、細(xì)菌載量(例如，每ml血液的細(xì)菌dna的量或者在不同瓊脂平板上1-21天生長期后的細(xì)菌菌落的數(shù)目)。
測量病毒和細(xì)菌載量的合適方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。例如，在goldschmidt等(clinicalanddiagnosticlaboratoryimmunology，1998年7月，第513-518頁)中比較了通過elisa測量病毒載量的方法。在holguin等(eurjclinmicrobiolinfectdis.1999年4月；18(4)：256-9)和swenson等(j.clin.microbiol，2014年2月；52(2)：517-523)中比較了使用用于檢測病毒核酸的不同商業(yè)測定來測量病毒載量的方法。描述通過實(shí)時pcr測量細(xì)菌載量的論文的一個實(shí)例是nadkarni等(microbiology(2002)，148，257-266)。該論文引用了bergey的manualofdeterminativebacteriology，現(xiàn)已被bergey的manualofsystematicbacteriology，第2版代替。honeyborne等(j.clin.microbiol，201149：3905-3911和j.clin.microbiol.2014年8月；52(8)：3064-7)描述了分子細(xì)菌載量測定。fda批準(zhǔn)的測量病毒和細(xì)菌載量的篩選測定的列表可在fda網(wǎng)站：www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/bloodbloodproducts/approvedproducts/licensedproductsblas/blooddonorscreening/infectiousdisease/ucm080466.htm上找到。
或者，組合療法的“有效量”可以是導(dǎo)致與感染治療相關(guān)的臨床益處增加的量。例如，在一些實(shí)施方案中，組合療法的“有效量”是與沒有組合療法的預(yù)期臨床益處相比，有效實(shí)現(xiàn)臨床益處增加至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。
或者，組合療法的“有效量”可以是導(dǎo)致與感染治療相關(guān)的至少一個有益參數(shù)的變化的量。例如，在一些實(shí)施方案中，組合療法的“有效量”是與沒有組合療法的治療相關(guān)的參數(shù)預(yù)期變化相比，有效實(shí)現(xiàn)參數(shù)變化至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的量。例如，該參數(shù)可以是活化的t細(xì)胞(特別是活化的cd8+t細(xì)胞)數(shù)目的增加，循環(huán)功能性(即，非耗竭的)抗原特異性cd8+t細(xì)胞數(shù)目的增加，或者耗竭的抗原特異性cd8+t細(xì)胞數(shù)目的減少，或者抗原特異性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞數(shù)目的減少。
根據(jù)本發(fā)明，與作為單一療法的pd-1通路抑制劑或lag-3蛋白質(zhì)或其衍生物的效果相比，可采用組合治療來提高pd-1通路抑制劑或lag-3蛋白或其衍生物的治療效果，或者降低所得組合中單個組分的劑量，同時防止或進(jìn)一步降低單個組分的不期望的或有害的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。
在一個實(shí)施方案中，lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑的處方劑量各自在各化合物作為單一療法的常用處方劑量范圍內(nèi)?？梢砸?guī)定化合物為單獨(dú)劑量或組合劑量。與任一化合物作為單一療法的效果相比，這樣的組合提供了提高的效力。
在另一個實(shí)施方案中，lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑的處方劑量各自低于各組分作為單一療法的常用處方劑量，但為在組合中具有治療效力的劑量?？梢砸?guī)定組分為單獨(dú)劑量或組合劑量?？梢赃x擇組合中成分的劑量以提供與lag-3蛋白或其衍生物或者pd-1通路抑制劑作為單一療法之類似水平的治療效力，但是與各化合物作為單一療法的處方劑量相比，其優(yōu)點(diǎn)是較低劑量的lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑降低了不利的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。
在另一個實(shí)施方案中，pd-1通路抑制劑的處方劑量在單一療法的常用處方劑量范圍內(nèi)，并且lag-3蛋白或其衍生物的處方劑量低于單一療法的常用處方劑量。
在另一個實(shí)施方案中，pd-1通路抑制劑的處方劑量低于單一療法的常用處方劑量，并且lag-3蛋白或其衍生物的處方劑量在以單一療法的常用處方劑量范圍內(nèi)。
對于單一療法，低于常用處方劑量的優(yōu)選劑量是這樣的劑量，其為常用處方劑量的至高50％或至高25％。例如，低于單一療法常用處方劑量的劑量可以是這樣的劑量，其為pd-1通路抑制劑和/或lag-3蛋白質(zhì)或其衍生物的常用處方劑量的1-50％、1-25％、1-10％、2-50％、2-25％、2-10％。
在人對象中單一療法的lag-3蛋白或其衍生物的常用處方劑量可以是摩爾當(dāng)量為0.25-30mg、1-30mg或6-30mglag-3衍生物lag-3ig融合蛋白imp321的劑量。
人對象中單一療法的pd-1通路抑制劑的常用處方劑量可以是0.1至10mg/kg，0.1至1mg/kg或1至10mg/kg。例如，人對象中單一療法的派姆單抗的常用處方劑量可以是2至10mg/kg，例如2mg/kg，在人對象中單一療法的納武單抗的常用處方劑量可以是0.1至10mg/kg，例如3mg/kg，并且在人對象中單一療法的bms-936559的常用處方劑量可以是0.3至10mg/kg。
在本發(fā)明的組合制劑或組合物的一些具體實(shí)施方案中，pd-1通路抑制劑的處方劑量低于單一療法的常用處方劑量，例如pd-1通路抑制劑常用處方劑量的1-50％、1-25％、1-20％、1-10％、2-50％、2-25％、2-20％、2-10％、0.1-50％、0.1-25％、0.1-20％、0.1-10％、＜20％、＜10％、0.1-＜10％、0.1-＜10％、0.01-＜20％或0.01-＜10％。
根據(jù)本發(fā)明的pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白或其衍生物的合適劑量的實(shí)例列于下表1.2中：
表1.2：根據(jù)本發(fā)明的組合制劑或組合物的一些實(shí)施方案的pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白或其衍生物的劑量的實(shí)例
lag-3衍生物可以是上述的或圖7所示的任何lag-3衍生物。在一些具體實(shí)施方案中，lag-3衍生物是imp321。
當(dāng)以單獨(dú)劑量施用時，lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑可以基本上同時施用(例如，在間隔約60分鐘、約50分鐘、約40分鐘、約30分鐘、約20分鐘、約10分鐘、約5分鐘或約1分鐘內(nèi))或者在時間上間隔約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約72小時或約96小時或更長時間。
技術(shù)人員將能夠確定并優(yōu)化依次施用的合適時間過程，這取決于lag-3蛋白或其衍生物和pd-1通路抑制劑的具體組合。優(yōu)選地選擇所述時間過程以使得存在至少一種有益效果，例如增強(qiáng)lag-3蛋白或其衍生物或者pd-1通路抑制劑的效果，或者相互增強(qiáng)組合組分的效果，例如與非有效劑量的組合組分的一個或兩個相比，大于疊加效應(yīng)、額外的有利效果、較小的副作用、較低的毒性或者組合治療效果，以及非常優(yōu)選組合組分的協(xié)同作用。
應(yīng)理解，最佳時間過程將取決于這樣的因素，例如在施用后達(dá)到化合物的峰血漿濃度所花費(fèi)的時間以及每個化合物的消除半衰期。優(yōu)選地，時間差小于待施用的第一組分的半衰期。
技術(shù)人員還將能夠確定用于施用的適當(dāng)時機(jī)。在某些實(shí)施方案中，pd-1通路抑制劑可以在早晨施用，而lag-3蛋白或其衍生物在當(dāng)天晚些時候施用至少一次。在另一些實(shí)施方案中，pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白或其衍生物可以在基本上相同的時間施用。
在一些實(shí)施方案中，可以(例如，由醫(yī)務(wù)人員)向?qū)ο笫┯胮d-1通路抑制劑，以及可以為對象提供一定劑量的lag-3蛋白或其衍生物(例如以預(yù)填充注射器的形式)以便隨后施用(例如在同一天的晚些時候或第二天)。
pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白或其衍生物可以每天、每周、每兩周、每三周、每月、每2個月、每3個月、每4個月、每5個月、每6個月、每7個月、每8個月、每9個月、每10個月、每11個月、每1年、每2年、每3年、每4年、每5年或更長時間施用。
對象可以在數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年的時間內(nèi)接受pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白或其衍生物的劑量。例如，1周、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年或更長時間。
對象可以是哺乳動物對象，適當(dāng)?shù)厥侨藢ο蟆?/p>
根據(jù)本發(fā)明可治療的癌癥包括其中癌癥的腫瘤細(xì)胞表達(dá)pd-l1和/或pd-l2的癌癥(即pd-l1和/或pd-l2陽性癌癥)。
已經(jīng)在肺、卵巢、腎和結(jié)腸癌以及惡性黑素瘤中檢測到pd-l1表達(dá)，但在正常組織(包括肺、子宮、腎、結(jié)腸或皮膚)中沒有檢測到pd-l1表達(dá)(benson等，blood116，2286-2294(2010)；blank等，int.j.cancer119，317-327(2006)；dong等，nat.med.8，793-800(2002))。腫瘤細(xì)胞的pd-l1表達(dá)與乳腺癌、胃癌、食道癌、肝細(xì)胞癌、惡性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌和尿道上皮癌的預(yù)后較差相關(guān)(zou&chen，nat.revimmunol.8，467-477(2008))。
還有證據(jù)表明人腫瘤可以表達(dá)pd-l2(rozali等，clin.dev.immunol.2012，656340(2012)；karim等，clin.cancerres.15，6341-6347(2009))。非小細(xì)胞肺癌(nsclc)相關(guān)的成纖維細(xì)胞組成型表達(dá)pd-l1和pd-l2二者。還描述了pd-l2陽性(相對于pd-l2陰性)、食道癌、卵巢癌或肝細(xì)胞癌患者存活降低。
根據(jù)本發(fā)明可治療的癌癥還包括其中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltratinglymphocyte，til)(尤其是cd8+til)表達(dá)pd-1的癌癥或其中與循環(huán)淋巴細(xì)胞相比til表達(dá)更高水平pd-1的癌癥。
在nsclc和黑素瘤患者二者中，在til上比在循環(huán)淋巴細(xì)胞上觀察到更高水平的pd-1(blank等，int.j.cancer119，317-327(2006)；zhang等，cell.mol.immunol.7，389-395(2010))。在接種疫苗的黑素瘤患者的外周血中，黑素瘤抗原特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和treg二者表達(dá)pd-1(wang等，int.immunol.21，1065-1077(2009))。腫瘤pd-l2表達(dá)與食道癌中cd8+til的存在之間也存在負(fù)相關(guān)(rozali等，clin.dev.immunol.，2012，656340(2012))。
與循環(huán)cd8+t細(xì)胞或來自健康志愿者的cd8+t細(xì)胞相比，從nsclc分離的cd8+til具有提高表達(dá)的pd-1和受損的功能應(yīng)答(體外增殖和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生)?？筽d-l1抗體的添加顯著提高了cd8+til在體外增殖和產(chǎn)生干擾素-γ的能力(zhang等，cell.mol.immunol.7，389-395(2010))。在使用來自卵巢癌患者的腫瘤衍生樹突細(xì)胞和til的培養(yǎng)物的類似研究中，添加抗pd-l1抗體顯著提高了響應(yīng)腫瘤抗原之通過til的干擾素-γ產(chǎn)生。當(dāng)這些til轉(zhuǎn)移到攜帶卵巢腫瘤的免疫缺陷小鼠時，與對照組中的小鼠的腫瘤生長相比，觀察到腫瘤生長減少(curiel等，nat.med.9，562-567(2003))。
特別地，根據(jù)本發(fā)明可治療的癌癥包括皮膚癌、肺癌(尤其是鱗狀或非鱗狀nsclc)、卵巢癌、腎癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、膀胱癌、尿道上皮癌和肝癌。
根據(jù)本發(fā)明可治療的癌癥的其他實(shí)例包括黑素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌)、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤(例如b細(xì)胞淋巴瘤)、腎上腺癌、aids相關(guān)癌癥、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細(xì)胞瘤、骨癌、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、頸動脈體瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細(xì)胞癌(chromophoberenalcellcarcinoma)、透明細(xì)胞癌、皮膚良性纖維組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、室管膜瘤、尤因瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、骨不完全性纖維發(fā)生、骨纖維發(fā)育異常、膽囊或膽管癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、生殖細(xì)胞腫瘤、血液惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、默克爾細(xì)胞癌、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤形成、多發(fā)性骨髓瘤、脊髓發(fā)育不良綜合征、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑素瘤、罕見的血液病、腎轉(zhuǎn)移癌、橫紋肌樣瘤(rhabdoidtumor)、橫紋肌肉瘤、肉瘤、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移癌或子宮癌。
一般而言，本發(fā)明組合的組分或本發(fā)明的組合物可通過已知方法，以任何合適的制劑，通過任何合適的途徑施用。在一些實(shí)施方案中，lag-3蛋白或其衍生物經(jīng)腸胃外施用(包括通過皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)。在一些實(shí)施方案中，pd-1通路抑制劑為靜脈內(nèi)施用。在一些具體的實(shí)施方案中，lag-3蛋白或其衍生物為皮下施用，而pd-1通路抑制劑為靜脈內(nèi)施用。
可使用藥物制劑領(lǐng)域技術(shù)人員已知和在相關(guān)文本和文獻(xiàn)(例如，在remington：thescienceandpracticeofpharmacy(easton，pa.：mackpublishingco.，1995))中描述的常規(guī)方法來制備合適的藥物組合物和劑型。
為了便于施用和劑量均勻，以單位劑型配制本發(fā)明的組合或組合物是特別有利的。如本文中使用的術(shù)語“單位劑型”是指適合以單位劑量(unitarydosage)用于待治療個體的物理離散單位。換言之，組合物被配制成離散劑量單位，各自含有經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生與所需藥物載體相關(guān)的期望治療效果的預(yù)定“單位劑量”量的活性劑。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格取決于待遞送的活性劑的獨(dú)特特征。還可以通過參考成分的常用劑量和施用方式來確定劑量。應(yīng)當(dāng)指出，在一些情況下，組合中兩個或更多個單獨(dú)的劑量單位提供治療有效量的活性劑，例如，一起服用的兩個片劑或膠囊劑可提供治療有效劑量，以使得各片劑或膠囊劑中的單位劑量為治療有效量的約50％。
用于腸胃外施用的根據(jù)本發(fā)明的制劑包括無菌水和非水溶液、混懸劑和乳劑?？勺⑸渌芤汉兴苄孕问降幕钚詣７撬軇┗蜉d劑的實(shí)例包括脂肪油，例如橄欖油和玉米油；合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯；低分子量醇，例如丙二醇；合成的親水性聚合物，例如聚乙二醇、脂質(zhì)體等。腸胃外制劑還可含有助劑，例如增溶劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑和穩(wěn)定劑，并且水性混懸劑可含有提高混懸劑粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖?？赏ㄟ^并入滅菌劑、通過截留細(xì)菌的過濾器過濾、輻照或加熱來使可注射制劑無菌。它們也可以使用無菌可注射介質(zhì)來制造?；钚詣┮部梢允歉稍?例如，凍干)形式，其可在即將通過注射施用前用合適的載劑再水化。
除先前描述的制劑之外，活性劑還可被配制成用于活性劑控制釋放，優(yōu)選在延長的時間段內(nèi)持續(xù)釋放的貯庫制劑。這些持續(xù)釋放劑型通常通過植入施用(例如，皮下或肌內(nèi)或通過肌內(nèi)注射)。
本發(fā)明的組合制劑可與施用組合之組分的說明書一起包裝。說明書可記錄在合適的記錄介質(zhì)或基質(zhì)上。例如，說明書可被印刷在例如紙或塑料的基質(zhì)上。說明書可作為在容器或其組件的標(biāo)簽中的包裝插頁存在(即，與包裝或分包裝相關(guān))。在另一些實(shí)施方案中，說明書作為存在于合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)(例如，cd-rom、磁盤)上的電子存儲數(shù)據(jù)文件存在。組合制劑的一些或所有組分可被包裝在合適的包裝中以保持無菌性。
以下參考附圖僅通過示例的方式來描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案，其中：
圖1描繪了pd-1通路在腫瘤免疫逃避中的作用和pd-1通路阻斷的作用機(jī)制(apc，抗原呈遞細(xì)胞；ifn-γ，干擾素-γ；mhc，主要組織相容性復(fù)合體；pd-1，程序性死亡-1；pd-l1，pd配體1；tcr，t細(xì)胞受體)；
圖2示出了lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ分泌的作用；
圖3示出了lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ分泌的作用；
圖4示出了lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ分泌的作用；
圖5示出了lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的tnfα、il-6、rantes分泌的作用；
圖6示出了lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的活化標(biāo)志物表達(dá)的作用。注意，圖6的每個圖中的最后一列的條件是“1000ng/ml抗pd1+30ng/mllag-3ig”，而不是如圖所示的“30ng/ml抗pd1+1000ng/mllag-3ig”；
圖7示出了與免疫球蛋白fc(lgfc)序列融合的lag-3蛋白的衍生物的示意圖；
圖8示出了lag-3衍生物與mhcii類陽性細(xì)胞的結(jié)合；
圖9示出了通過阻斷l(xiāng)ag-3與mhcii類分子結(jié)合的抗體抑制lag-3衍生物與mhcii類陽性細(xì)胞的結(jié)合；
圖10示出了如通過ccl4分泌確定的通過lag-3衍生物活化thp-1細(xì)胞；
圖11示出了如通過tnf-α分泌確定的通過lag-3衍生物活化thp-1細(xì)胞；
圖12示出了通過阻斷l(xiāng)ag-3與mhcii類分子結(jié)合的抗體抑制lag衍生物誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化；
圖13示出了通過lag-3衍生物活化抗原呈遞細(xì)胞(apc)；
圖14示出了通過lag-3衍生物活化cd8陽性t細(xì)胞；
圖15示出了成熟人lag-3蛋白的氨基酸序列。四個胞外lg超家族結(jié)構(gòu)域在以下氨基酸殘基處：1-149(d1)、150-239(d2)、240-330(d3)和331-412(d4)。人lag-3蛋白的d1結(jié)構(gòu)域的額外環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列以下劃線粗體示出；
圖16示出了lag-3ig和抗pd-l1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的活化標(biāo)志物表達(dá)的作用；
圖17示出了lag-3ig和不同的抗pd-1抗體(ab1和ab2)對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ和tnf-α分泌的作用；
圖18示出了lag-3ig和不同的抗pd-l1抗體(ab3、ab4、ab5和ab6)對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ和tnf-α分泌的作用；以及
圖19示出了不同的lag-3衍生物(imp321、imp321r75a、lag3d1d4-接頭2-lg)和抗pd-1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ分泌的作用。
在下列實(shí)施例、表和附圖中，術(shù)語“抗pd1抗體”與“抗pd-1抗體”同義使用，以及術(shù)語“抗pdl1抗體”與“抗pd-l1抗體”同義使用。
實(shí)施例1
lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ分泌的作用
本實(shí)施例使用ifn-γ分泌測定證明了lag-3的可溶性衍生物(lag-3ig，也被稱為imp321)和抗pd1抗體對體外t細(xì)胞活化的作用。外周血單核細(xì)胞(pbmc)包括淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞)，單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞。ifn-γ主要由活化的cd4+和cd8+記憶和效應(yīng)t細(xì)胞以及活化后的nk細(xì)胞分泌。在體外用特定抗原再刺激后，誘導(dǎo)ifn-γ分泌。
在存在或不存在30ng/mllag-3ig和指定濃度的抗pd1mab(克隆eh12.1，bdbiosciences，目錄號562138)的情況下，將來自三個健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全roswellparkmemorialinstitute(rpmi)+10％胎牛血清(fbs)中1×106m/ml)與覆蓋人巨細(xì)胞病毒(cmv)pp65(來自miltenyibiotec的
通過使用bd細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列(cytometricbeadarray)測量刺激后兩天的細(xì)胞上清液中ifn-γ的濃度來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
在下表2中記錄了各個供體之合并的一式三份存在的ifn-γ濃度。圖2示出了各個供體的ifn-γ濃度對抗pd1mab濃度作圖。
表2：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd1抗體時抗原誘導(dǎo)的ifn-γ分泌
結(jié)果表明，與單獨(dú)的抗pd1抗體相比，當(dāng)在存在30ng/mllag-3ig和較低濃度的抗pd1抗體的情況下孵育pbmc時，ifn-γ的分泌顯著增加。例如，對于各個供體，在存在30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1抗體的情況下，高于背景水平(即，在不存在抗pd1和lag-3ig的情況下的ifn-γ的濃度)的ifn-γ濃度的增加大于在存在單獨(dú)的30ng/mllag-3ig和單獨(dú)的30ng/ml抗pd1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和，如下表3所示。因此，對于各個供體lag-3ig和抗pd1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
表3：在存在30ng/ml抗pd1抗體和/或30ng/mllag-3ig的情況下抗原誘導(dǎo)的高于背景的ifn-γ濃度的增加
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的ifn-γ分泌等同于由單獨(dú)的高得多濃度(300ng/ml-1000ng/ml，高10至30倍以上)的抗pd1抗體誘導(dǎo)的ifn-γ分泌。對于1和3號供體，與單獨(dú)的1000ng/ml抗pd1抗體相比，當(dāng)將pbmc與30ng/ml抗pd1和30ng/mllag-3ig一起孵育時，分泌類似濃度的ifn-γ。對于2號供體，與單獨(dú)的300ng/ml和1000ng/ml抗pd1抗體相比，當(dāng)將pbmc與30ng/ml抗pd1和30ng/mllag-3ig一起孵育時，分泌類似濃度的ifn-γ。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加(對于1、2和3號供體分別增加約7.5、1.5和2倍)由相對低劑量的抗pd1抗體誘導(dǎo)的體外t細(xì)胞應(yīng)答(如通過ifn-γ分泌測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd1抗體與可溶性lag-3衍生物組合，則使用少約10至30倍的抗pd1抗體獲得同等的體外t細(xì)胞應(yīng)答。
實(shí)施例2
lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ分泌的作用
本實(shí)施例使用ifn-γ分泌測定證明了lag-3的可溶性衍生物(lag-3ig)和抗pd1抗體對體外t細(xì)胞活化的作用。
在沒有任何添加劑(介質(zhì))的情況下，在有30ng/ml或1000ng/ml抗pd1mab(克隆eh12.1，bdbiosciences，目錄號562138)，30ng/mllag-3ig，或者30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1mab的情況下，將來自10個健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全rpmi+10％fbs中1×106m/ml)與覆蓋cmvpp65(來自miltenyibiotec的
通過使用bd細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列測量刺激后兩天的細(xì)胞上清液中ifn-γ的濃度來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
下表4中記錄了各個供體各種刺激條件之合并的一式三份的ifn-γ的濃度。表5中示出了10個供體所獲得的結(jié)果的平均值。圖3和圖4中也繪出了各個供體的結(jié)果。在圖3中以黑色示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＊p＜0.05)。
表4：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd1抗體時抗原誘導(dǎo)的ifn-γ分泌
表5：各種不同刺激條件的平均ifn-γ濃度
結(jié)果表明，與單獨(dú)的30ng/mllag-3ig或30ng/ml抗pd1抗體相比，當(dāng)在存在30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1抗體的情況下孵育pbmc時，各個供體的ifn-γ分泌高得多。表5表明在存在30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1抗體的情況下，高于平均背景水平(即，在不存在抗pd1和lag-3ig的情況下的ifn-γ平均濃度)的ifn-γ平均濃度的增加大于在存在單獨(dú)的30ng/mllag-3ig和單獨(dú)的30ng/ml抗pd1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即765＞239+172)。因此，lag-3ig和抗pd1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的ifn-γ分泌等同于由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd1抗體誘導(dǎo)的ifn-γ分泌。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加(平均增加約2倍)由相對低劑量的抗pd1抗體誘導(dǎo)的體外t細(xì)胞應(yīng)答(如通過ifn-γ分泌測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd1抗體與可溶性lag-3衍生物組合，則使用少30倍以上的抗pd1抗體獲得同等的體外t細(xì)胞應(yīng)答。
實(shí)施例3
lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的tnf-α、il-6、rantes分泌的作用
本實(shí)施例通過測量tnf-α、il-6和rantes(ccl5)的分泌證明了lag-3的可溶性衍生物(lag-3ig)和抗pd1抗體對體外t細(xì)胞活化的作用。
在沒有任何添加劑(介質(zhì))的情況下，在有30ng/ml或1000ng/ml抗pd1mab(克隆eh12.1，bdbiosciences，目錄號562138)，30ng/mllag-3ig，或者30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1mab的情況下，將來自10個健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全rpmi+10％fbs中1×106m/ml)與覆蓋cmvpp65(來自miltenyibiotec的
通過使用bd細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列測量刺激后兩天的細(xì)胞上清液中tnf-α、il-6和rantes(ccl5)的濃度來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
下表6-8中記錄了各個供體各種刺激條件之合并的一式三份的細(xì)胞因子/趨化因子的濃度。表9中示出了10個供體所獲得的結(jié)果的平均值，并且表10中示出了高于平均背景的平均值的增加。圖5中也繪出了各個供體的結(jié)果，并且以黑色示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＊p＜0.05)。
表6：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd1抗體時抗原誘導(dǎo)的tnf-α分泌
表7：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd1抗體時抗原誘導(dǎo)的il-6分泌
表8：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd1抗體時抗原誘導(dǎo)的rantes(ccl5)分泌
表9：各種不同刺激條件的平均tnf-α、il-6和rantes(ccl5)濃度
表10：各種不同的刺激條件的高于平均背景的平均tnf-α、il-6和rantes(ccl5)濃度的增加
結(jié)果表明，與單獨(dú)的30ng/mllag-3ig或30ng/ml抗pd1抗體相比，當(dāng)在存在30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1抗體的情況下孵育pbmc時，各個供體的il-6分泌高得多。表10表明在存在30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd1抗體的情況下，高于平均背景水平(即，在不存在抗pd1和lag-3ig的情況下的il-6的平均濃度)的il-6平均濃度的增加大于在存在單獨(dú)的30ng/mllag-3ig和單獨(dú)的30ng/ml抗pd1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即8594＞732+2964)。因此，lag-3ig和抗pd1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的il-6分泌等同于由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd1抗體誘導(dǎo)的il-6分泌。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加(平均增加2.3倍以上)由相對低劑量的抗pd1抗體誘導(dǎo)的體外t細(xì)胞應(yīng)答(如通過il-6分泌測量)。
實(shí)施例4
lag-3ig和抗pd1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的活化標(biāo)志物表達(dá)的作用
本實(shí)施例證明了lag-3的可溶性衍生物(lag-3ig)和抗pd1抗體對t細(xì)胞活化標(biāo)志物表達(dá)的作用。
在沒有任何添加劑(介質(zhì))的情況下，在有30ng/ml或1000ng/ml抗pd1mab(克隆eh12.1，bdbiosciences，目錄號562138)，30ng/mllag-3ig，或者30ng/mllag-3ig和30或1000ng/ml抗pd1mab的情況下，將來自7個健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全rpmi+10％fbs中1×106m/ml)與覆蓋cmvpp65(來自miltenyibiotec的
通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞刺激后兩天的三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的表達(dá)進(jìn)行表型分析來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
下表11-15中記錄了對于各種刺激條件之合并的一式三份的表達(dá)lag-3、cd69或cd25，三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中的至少一種或所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的百分比。表16中示出了7個供體所獲得的結(jié)果的平均值，表17中示出了高于平均背景的平均值的增加。圖6中也繪出了各個供體的結(jié)果，并且以黑色示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＊p＜0.05)。
表11：各種不同的刺激條件表達(dá)lag-3的cd8細(xì)胞的百分比
表12：各種不同的刺激條件表達(dá)cd69的cd8細(xì)胞的百分比
表13：各種不同的刺激條件表達(dá)cd25的cd8細(xì)胞的百分比
表14：各種不同的刺激條件表達(dá)三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中任一種的cd8細(xì)胞的百分比
表15：各種不同的刺激條件表達(dá)所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的百分比
表16：各種不同的刺激條件表達(dá)lag-3、cd69、cd25，三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中任一種或所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的平均百分比
表17：各種不同的刺激條件高于平均背景的表達(dá)lag-3、cd69、cd25，三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中任一種或所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)的cd8細(xì)胞的平均百分比增加
結(jié)果表明，用30ng/ml抗pd-1抗體和30ng/mllag-3ig或者1000ng/ml抗pd-1抗體和30ng/mllag-3ig刺激導(dǎo)致表達(dá)任何或所有三種活化標(biāo)志物的cd8細(xì)胞的平均百分比協(xié)同增加。
結(jié)果還表明，用30ng/ml抗pd-1抗體和30ng/mllag-3ig刺激比用1000ng/ml抗pd-1抗體刺激導(dǎo)致表達(dá)任何或所有三種活化標(biāo)志物的cd8細(xì)胞的平均百分比顯著更高。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加由相對低劑量的抗pd1抗體誘導(dǎo)的體外cd8+t細(xì)胞應(yīng)答(如通過t細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd1抗體與可溶性lag-3衍生物組合，則使用少30倍以上的抗pd1抗體獲得體外cd8+t細(xì)胞應(yīng)答的顯著改善。
由于已知pd-1通路抑制劑(例如keytruda和opdivo)活化cd8+t細(xì)胞，并且這種活化與抗癌效果有關(guān)，因此上述實(shí)施例中呈現(xiàn)的結(jié)果提供了如下證據(jù)：可通過共同施用pd-1通路抑制劑和能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物獲得改善的抗癌效果?；蛘?，與作為單一療法的pd-1通路抑制劑的施用相比，可通過在較低劑量(例如，低10至30倍的劑量)的pd-1通路抑制劑下共同施用pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白(或其能夠與mhcii類分子結(jié)合的衍生物)來實(shí)現(xiàn)類似的抗癌效果。預(yù)期這樣的共同施用將減少由pd-1通路抑制劑引起的副作用。
類似地，由于還已知cd8+t細(xì)胞活化對感染(包括慢性或持續(xù)性感染)有效，因此上述實(shí)施例中呈現(xiàn)的結(jié)果也提供了如下證據(jù)：共同施用pd-1通路抑制劑和能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物可用于更有效地預(yù)防、治療或改善感染?；蛘撸c作為單一療法的pd-1通路抑制劑的施用相比，可通過在較低劑量(例如，低30至100倍的劑量)的pd-1通路抑制劑下共同施用pd-1通路抑制劑與lag-3蛋白(或其能夠與mhcii類分子結(jié)合的衍生物)來實(shí)現(xiàn)類似的針對感染的效果。預(yù)期這樣的共同施用將減少由pd-1通路抑制劑引起的副作用。
實(shí)施例5
lag-3衍生物與mhcii型陽性細(xì)胞的結(jié)合
測試了lag-3的幾種衍生物與mhcii類陽性細(xì)胞結(jié)合的能力：
i)通過第一接頭與免疫球蛋白fc(igfc)序列連接的lag-3的結(jié)構(gòu)域d1-d4(lag-3d1d4-接頭1-ig，slag-3d1d4-ig、lag-3ig或imp321)；
ii)通過第二接頭與igfc序列連接的lag-3的結(jié)構(gòu)域d1-d4(lag-3d1d4-接頭2-ig或slag-3d1d4-接頭b-ig)；
iii)通過第二接頭與igfc序列連接的lag-3的結(jié)構(gòu)域d1和d2(lag-3d1d2-接頭2-ig或slag-3d1d2接頭b-ig)；和
iv)通過第一接頭與igfc序列連接的lag-3的結(jié)構(gòu)域d1-d4，但在lag-3d1結(jié)構(gòu)域的mhcii類結(jié)合位點(diǎn)中于r75位具有突變(r75a)，這使與mhcii類分子的結(jié)合增強(qiáng)了三倍或更多(huard等，proc.natl.acad.sci.usa，1997，94：5744)(imp321r75a)。
圖7中示出了所述衍生物。
用不同濃度的lag-3衍生物或用人igg1抗體(higg1)作為陰性對照將mhcii類+raji細(xì)胞在4℃下孵育45分鐘。用fitc-綴合的山羊抗小鼠ig(coulter)顯示與細(xì)胞表面結(jié)合的lag-3分子。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。圖8中示出了表示為熒光強(qiáng)度單位的結(jié)果。結(jié)果表明，所有的lag-3衍生物均與mhcii類陽性細(xì)胞結(jié)合。
實(shí)施例6
通過阻斷l(xiāng)ag-3與mhcii類分子結(jié)合的抗體抑制lag-3衍生物imp321與mhcii類陽性細(xì)胞的結(jié)合
17b4和11e3是已知阻斷l(xiāng)ag-3與mhcii類分子結(jié)合的抗lag-3單克隆抗體。在imp321綴合物(lag-3ig-alexa488)(4μg/ml在4℃下)與17b4或11e3阻斷抗體或與同種型匹配的陰性對照單克隆抗體(migg1)預(yù)孵育之后，測定該綴合物與mhcii類-陽性b細(xì)胞(raji細(xì)胞)的結(jié)合。使用熒光活化細(xì)胞分選(facs)進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合熒光的分析。圖9中示出了結(jié)果。
結(jié)果表明，通過阻斷l(xiāng)ag-3與mhcii類分子結(jié)合的lag-3特異性單克隆抗體抑制了imp321與raji細(xì)胞的結(jié)合。
實(shí)施例7
通過lag-3衍生物活化單核細(xì)胞
將thp-1細(xì)胞與圖5中所示的lag-3衍生物或與作為陰性對照的人igg1在4℃下孵育4小時。測定了thp-1細(xì)胞分泌的趨化因子ccl4和細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tnf-α)的量，并將其用作單核細(xì)胞活化的量度。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列在細(xì)胞上清液中定量ccl4和tnf-α分泌。圖10中示出了ccl4測定的結(jié)果，圖11中示出了tnf-α測定的結(jié)果。
結(jié)果表明，lag-3衍生物均能夠活化thp-1單核細(xì)胞。
實(shí)施例8
通過阻斷l(xiāng)ag-3與mhcii類分子結(jié)合的抗體抑制imp321誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化
將imp321(20ng/ml)與17b4或11e3抗體預(yù)孵育(在37℃下5分鐘)，之后將該混合物與thp-1細(xì)胞在37℃下孵育4小時。使用thp-1細(xì)胞分泌的ccl4的量來確定單核細(xì)胞活化的水平。圖12中示出了兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
結(jié)果證明，imp321誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化被阻斷性抗lag-3mab17b4和11e3所抑制。這表明imp321活化單核細(xì)胞的能力依賴于imp321與mhcii類分子的結(jié)合。
實(shí)施例9
通過lag-3衍生物活化原代抗原呈遞細(xì)胞(apc)
在存在布雷菲德菌素(brefeldin)(一種分泌抑制劑)的情況下，將人外周血單核細(xì)胞(pbmc)與圖7中所示的lag-3衍生物或與作為陰性對照的人igg1在37℃下孵育4小時。通過ccl4(一種已知有利于th1和cd8陽性應(yīng)答的趨化因子)和tnf-α(一種直接抑制腫瘤發(fā)生的多功能細(xì)胞因子)的胞內(nèi)染色來確定存在于pbmc中的apc的細(xì)胞因子應(yīng)答。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析結(jié)果。由在mhcii類陽性細(xì)胞中表達(dá)ccl4和/或tnf-α的細(xì)胞的百分比所表示的結(jié)果示于圖13中。
結(jié)果表明，所有經(jīng)測試的lag-3衍生物均在原代apc中誘導(dǎo)了ccl4和tnf-α的產(chǎn)生。
實(shí)施例10
通過lag-3衍生物活化cd8+t細(xì)胞
將人pbmc與圖7中所示的lag-3衍生物，或與作為陰性對照的人igg1孵育18小時。在孵育的最后16小時存在布雷菲德菌素。在暴露于lag-3衍生物18小時之后，通過ccl4、ifn-γ和tnf-α的胞內(nèi)染色追蹤cd8+t細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析。由在cd3+/cd8+t細(xì)胞中表達(dá)ccl4、ifn-γ和/或tnf-α的細(xì)胞的百分比所表示的結(jié)果示于圖14中。
結(jié)果表明，所有經(jīng)測試的lag-3衍生物均誘導(dǎo)1型細(xì)胞毒性cd8陽性t細(xì)胞(tc1細(xì)胞)的活化。得出結(jié)論，通過與apc表達(dá)的mhcii類分子結(jié)合，lag-3衍生物誘導(dǎo)了tc1細(xì)胞的活化。tc1細(xì)胞的活化形成主要的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
實(shí)施例11
lag-3ig和抗pd-l1對抗原刺激誘導(dǎo)的活化標(biāo)志物表達(dá)的作用
本實(shí)施例證明了lag-3的可溶性衍生物(lag-3ig)和抗pd-l1抗體對t細(xì)胞活化標(biāo)志物表達(dá)的作用。
在沒有任何添加劑(介質(zhì))的情況下，在有30ng/ml或3000ng/ml抗pd-l1人源化抗體(bpsbioscience，目錄號71213)，30ng/mllag-3ig，或者30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd-l1抗體的情況下，將來自12個健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全rpmi+10％fbs中1m/ml)與覆蓋cmvpp35序列的肽庫一起一式三份孵育。
通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞刺激后三天的三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的表達(dá)進(jìn)行表型分析來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
下表18-22中記錄了各種刺激條件之合并的一式三份的表達(dá)lag-3、cd69或cd25，三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中的至少一種或所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的百分比。表23中示出了12個供體所獲得的結(jié)果的平均值，表24中示出了高于平均背景的平均值的增加。圖16中也繪出了各個供體的結(jié)果，并且以黑色示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＊p＜0.05)。
表18：各種不同的刺激條件表達(dá)lag-3的cd8細(xì)胞的百分比
表19：各種不同的刺激條件表達(dá)cd69的cd8細(xì)胞的百分比
表20：各種不同的刺激條件表達(dá)cd25的cd8細(xì)胞的百分比
表21：各種不同的刺激條件表達(dá)三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中任一種的cd8細(xì)胞的百分比
表22：各種不同的刺激條件表達(dá)所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的百分比
表23：各種不同的刺激條件表達(dá)lag-3、cd69、cd25，三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中任一種或所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的平均百分比
表24：各種不同的刺激條件高于平均背景的表達(dá)lag-3、cd69、cd25，三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69或cd25)中任一種或所有三種活化標(biāo)志物(lag-3、cd69和cd25)的cd8細(xì)胞的平均百分比的增加
結(jié)果表明，用30ng/ml抗pd-l1抗體和30ng/mllag-3ig刺激導(dǎo)致表達(dá)任何或所有三種活化標(biāo)志物的cd8細(xì)胞的平均百分比協(xié)同增加。
結(jié)果還表明，用30ng/ml抗pd-l1抗體和30ng/mllag-3ig刺激比用單獨(dú)的3000ng/ml抗pd-1抗體刺激導(dǎo)致表達(dá)任何或所有三種活化標(biāo)志物的cd8細(xì)胞的平均百分比顯著更高。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加由相對低劑量的抗pd-l1抗體誘導(dǎo)的體外cd8+t細(xì)胞應(yīng)答(如通過t細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd-l1抗體與可溶性lag-3衍生物組合，則使用少100倍的抗pd-l1抗體獲得體外cd8+t細(xì)胞應(yīng)答的顯著改善。
由于已知pd-1通路抑制劑(例如keytruda和opdivo)活化cd8+t細(xì)胞，并且這種活化與抗癌效果有關(guān)，因此上述實(shí)施例中呈現(xiàn)的結(jié)果提供了如下證據(jù)：可通過共同施用pd-1通路抑制劑和能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物獲得改善的抗癌效果?；蛘?，與作為單一療法的pd-1通路抑制劑的施用相比，可通過在較低劑量(例如，低30至100倍的劑量)的pd-1通路抑制劑下共同施用pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白(或其能夠與mhcii類分子結(jié)合的衍生物)來實(shí)現(xiàn)類似的抗癌效果。預(yù)期這樣的共同施用將減少由pd-1通路抑制劑引起的副作用。
類似地，由于還已知cd8+t細(xì)胞活化對感染(包括慢性或持續(xù)性感染)有效，因此上述實(shí)施例中呈現(xiàn)的結(jié)果也提供了如下證據(jù)：共同施用pd-1通路抑制劑和能夠與mhcii類分子結(jié)合的lag-3蛋白或其衍生物可用于更有效地預(yù)防、治療或改善感染。或者，與作為單一療法的pd-1通路抑制劑的施用相比，可通過在較低劑量(例如，低30至100倍的劑量)的pd-1通路抑制劑下共同施用pd-1通路抑制劑和lag-3蛋白(或其能夠與mhcii類分子結(jié)合的衍生物)來實(shí)現(xiàn)類似的針對感染的效果。預(yù)期這樣的共同施用將減少由pd-1通路抑制劑引起的副作用。
實(shí)施例12
lag-3ig和多種抗pd-1或抗pd-l1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ和tnf-α產(chǎn)生的作用
本實(shí)施例使用ifn-γ和tnf-α分泌測定證明了lag-3的可溶性衍生物(lag-3ig)和多種不同的抗pd-1或抗pd-l1抗體對體外t細(xì)胞活化的作用。
在沒有任何添加劑(介質(zhì))的情況下，在有30ng/ml或1000ng/ml抗pd-1抗體(ab1或ab2)或抗pd-l1抗體(ab3、ab4、ab5或ab6)，10或30ng/mllag-3ig，或者10或30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd-1抗體或抗pd-l1抗體的情況下，將來自健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全rpmi+10％fbs中1m/ml)與覆蓋cmvpp35序列的肽庫一起一式三份孵育。
通過使用bd細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列測量刺激后3天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ifn-γ和tnf的濃度來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
抗pd-1：ab1(來自bdpharmingen的克隆mih4，目錄號557823)和ab2(來自bpsbioscience的人源化抗pd-1，目錄號71120)；
抗pd-l1：ab3(來自ebioscience的克隆mih1，目錄號16-5983-82)，ab4(來自ebioscience的克隆mih5，目錄號16-5982-81)，ab5(來自ebioscience的克隆1-111a，目錄號14-9971-81)和ab6(來自bpsbioscience的人源化抗pd-l1，目錄號71213)。
表25中記錄了抗pd-1抗體各種刺激條件之合并的一式三份的ifn-γ和tnf-α的濃度。圖17中繪出了結(jié)果。
表25：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd-1抗體時抗原誘導(dǎo)的ifn-γ和tnf-α分泌
結(jié)果表明，對于各抗pd-1抗體，與單獨(dú)的抗pd-1抗體相比，當(dāng)在存在lag-3ig和較低濃度的抗pd-1抗體的情況下孵育pbmc時，ifn-γ的分泌增加。例如，在存在30ng/mllag-3ig和30ng/mlab1抗pd-1抗體或者10ng/mllag-3ig和30ng/mlab2抗pd-1抗體的情況下，高于背景水平(即，在不存在抗pd-1和lag-3ig的情況下的ifn-γ的濃度)的ifn-γ濃度的增加大于在存在單獨(dú)的lag-3ig和單獨(dú)的30ng/ml抗pd-1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即對于ab1，235.1＞-53.3+144.6；對于ab2，273.8＞176.1+18.2)。因此，lag-3ig和各不同抗pd-1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd-1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的ifn-γ分泌比由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd-1抗體誘導(dǎo)的ifn-γ分泌高得多(即對于ab1，235.1＞107.7；對于ab2，273.8＞27.3)。
關(guān)于tnf-α分泌，單獨(dú)的抗pd-1抗體(以相對低或高的濃度)均不對tnf-α分泌具有顯著作用。然而，對于各抗pd-1抗體，與單獨(dú)的抗pd-1抗體相比，當(dāng)在存在lag-3ig和較低濃度的抗pd-1抗體的情況下孵育pbmc時，tnf-α的分泌增加。例如，在存在30ng/mllag-3ig和30ng/mlab1抗pd-1抗體或者10ng/mllag-3ig和30ng/mlab2抗體的情況下，高于背景水平(即，在不存在抗pd-1和lag-3ig的情況下的tnf-α濃度)的tnf-α濃度的增加大于在存在單獨(dú)的lag-3ig和單獨(dú)的30ng/ml抗pd-1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即對于ab1，118.7＞0.9+82.2；對于ab2，12.778＞2.563+9.858)。因此，lag-3ig和各不同抗pd-1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd-1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的tnf-α分泌顯著高于由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd-1抗體誘導(dǎo)的tnf-α分泌(即對于ab1，118.7＞1.6；對于ab2，12.778＞2.494)。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加由相對低劑量的抗pd-1抗體誘導(dǎo)的體外t細(xì)胞應(yīng)答(如通過ifn-γ和tnf-α分泌測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd-1抗體與可溶性lag-3衍生物組合，則使用少30倍以上的抗pd-1抗體獲得顯著更大的體外t細(xì)胞應(yīng)答。用不同的抗pd-1抗體觀察到這些作用。
表26中記錄了抗pd-l1抗體各種刺激條件之合并的一式三份的ifn-γ和tnf-α的濃度。圖18中繪出了結(jié)果。
表26：在有和沒有l(wèi)ag-3ig的情況下在存在抗pd-l1抗體時抗原誘導(dǎo)的ifn-γ和tnf-α分泌
結(jié)果表明，對于各抗pd-l1抗體，與單獨(dú)的抗pd-l1抗體相比，當(dāng)在存在lag-3ig和較低濃度的抗pd-l1抗體的情況下孵育pbmc時，ifn-γ的分泌增加。例如，在存在10或30ng/mllag-3ig和30ng/ml抗pd-l1抗體的情況下，高于背景水平(即，在不存在抗pd-l1和lag-3ig的情況下的ifn-γ的濃度)的ifn-γ濃度的增加大于在存在單獨(dú)的10或30ng/mllag-3ig和單獨(dú)的30ng/ml抗pd-l1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即對于ab3，226.5＞28.5+79.1；對于ab4，126.03＞2.31+8.00；對于ab5，180.34＞19.84+30.11；對于ab6，95.14＞-16.51+19.84)。因此，lag-3ig和各不同抗pd-l1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd-l1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的ifn-γ分泌顯著高于由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd-l1抗體誘導(dǎo)的ifn-γ分泌(即對于ab3，226.5＞55.5；對于ab4，126.03＞-10.66；對于ab5，180.34＞10.89；對于ab6，95.14＞-49.61)。
關(guān)于tnf-α分泌，對于抗pd-l1抗體ab3、ab4和ab5，與單獨(dú)的抗pd-l1抗體相比，當(dāng)在存在lag-3ig和較低濃度的抗pd-l1抗體的情況下孵育pbmc時，tnf-α的分泌增加。例如，在存在10或30ng/mllag-3ig和30ng/mlab3、ab4或ab5抗pd-l1抗體的情況下，高于背景水平(即，在不存在抗pd-l1和lag-3ig的情況下的tnf-α的濃度)的tnf-α濃度的增加大于在存在單獨(dú)的lag-3ig和單獨(dú)的30ng/mlab3、ab4或ab5抗pd-l1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即對于ab3，9.0＞-1.8+2.4；對于ab4，80.34＞2.08+58.71；對于ab5，137.84＞5.53+84.21)。因此，lag-3ig和這些不同的抗pd-1抗體的組合的作用是協(xié)同的。
盡管對于與lag-3ig組合的抗pd-l1抗體ab6未觀察到對tnf-α分泌的協(xié)同作用，然而這可能是由于在存在單獨(dú)的這種抗體的情況下高水平的tnf-α分泌。然而，在存在ab6和lag-3ig的組合的情況下，tnf-a的分泌水平高于在存在單獨(dú)的ab6抗體(30ng/ml和1000ng/ml)的情況下tnf-α的分泌水平。
結(jié)果還表明，由lag-3ig和相對低濃度的抗pd-l1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的tnf-α分泌顯著高于由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd-l1抗體誘導(dǎo)的tnf-α分泌(即對于ab3，9.0＞0.6；對于ab4，80.34＞2.50；對于ab5，137.84＞4.00；對于ab6，100.99＞47.81)。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過可溶性lag-3衍生物協(xié)同增加由相對低劑量的抗pd-l1抗體誘導(dǎo)的體外t細(xì)胞應(yīng)答(如通過ifn-γ和tnf-α分泌測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd-l1抗體與可溶性lag-3衍生物組合，則使用少30倍以上的抗pd-l1抗體獲得顯著更大的體外t細(xì)胞應(yīng)答。用不同的抗pd-l1抗體觀察到這些作用。
實(shí)施例13
lag-3衍生物和抗pd-1抗體對抗原刺激誘導(dǎo)的ifn-γ產(chǎn)生的作用
本實(shí)施例使用ifn-γ分泌測定證明了lag-3的多種不同的可溶性衍生物(實(shí)施例5中描述和圖7中示出的衍生物(i)、(ii)和(iv))和抗pd-1對體外t細(xì)胞活化的作用。
在沒有任何添加劑(介質(zhì))的情況下，在有30ng/ml或1000ng/ml抗pd-1抗體(eh12克隆)，30ng/mllag-3衍生物(imp321、imp321r75a或lag3d1d4-接頭2-ig)或者30ng/mllag-3衍生物和30ng/ml抗pd-1的情況下，將來自健康供體的pbmc(0.2×106個細(xì)胞/孔，在完全rpmi+10％fbs中1m/ml)與覆蓋cmvpp35序列的肽庫一起一式三份孵育。
通過使用bd細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列測量刺激后3天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ifn-γ的濃度來評價(jià)t細(xì)胞應(yīng)答。
表27中記錄了各種刺激條件之合并的一式三份的ifn-γ的濃度。圖19中繪出了結(jié)果。
表27：在有和沒有l(wèi)ag-3的不同衍生物的情況下在存在抗pd-1抗體時抗原誘導(dǎo)的ifn-γ分泌
結(jié)果表明，對于各lag-3衍生物，與單獨(dú)的30ng/mllag-3衍生物或30ng/ml抗pd-1抗體相比，當(dāng)在存在30ng/mllag-3衍生物和30ng/ml抗pd-1抗體的情況下孵育pbmc時，ifn-γ的分泌增加。例如，在存在30ng/mllag-3衍生物和30ng/ml抗pd-1抗體的情況下，高于背景水平(即，在不存在抗pd-1和lag-3衍生物的情況下的ifn-γ的濃度)的ifn-γ濃度的增加大于在存在單獨(dú)的30ng/mllag-3衍生物和單獨(dú)的30ng/ml抗pd-1抗體的情況下的對應(yīng)增加之和(即對于imp321，572.3＞249.7+22.3；對于imp321r75a，511.2＞317.3+22.3；對于lag3d1d4-接頭2-ig，520.7＞258.0+22.3)。因此，抗pd-1抗體和各不同的lag-3衍生物的組合的作用是協(xié)同的。
結(jié)果還表明，由各lag-3衍生物和相對低濃度的抗pd-1抗體(30ng/ml)的組合誘導(dǎo)的ifn-γ分泌顯著高于由單獨(dú)的高得多濃度(1000ng/ml，高30倍以上)的抗pd-1抗體誘導(dǎo)的ifn-γ分泌(即對于imp321，572.3＞85.9；對于imp321r75a，511.2＞85.9；對于lag3d1d4-接頭2-ig，520.7＞85.9)。
從這些結(jié)果得出結(jié)論，通過多種不同的可溶性lag-3衍生物(其各自保留與mhcii類陽性細(xì)胞結(jié)合的能力)協(xié)同增加由相對低劑量的抗pd-1抗體誘導(dǎo)的體外t細(xì)胞應(yīng)答(如通過ifn-γ分泌測量)。還得出結(jié)論，如果將抗pd-1抗體與任何可溶性lag-3衍生物組合，則使用少30倍以上的抗pd-1抗體獲得顯著更大的體外t細(xì)胞應(yīng)答。
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